Name: Une analyse comparative des recombinant expression des protéines dans différents bio-usines: bactéries, cellules dinsectes et Plant Systems (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-03-23T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 11 s
Description: Découvrez une comparaison de l'expression de protéines recombinantes humaines dans les cultures fermentaires et les systèmes végétaux. Cette étude évalue les avantages et limites de chaque plateforme pour optimiser la production.

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Ce travail a été soutenu par l’action COST 'Molecular pharming : Plants as a production platform for high-value proteins' FA0804. Les auteurs remercient le Dr Anatoli Giritch et le professeur Yuri Gleba d’avoir fourni les vecteurs MagnICON à des fins de recherche.

<ol><li>Hampe, C. S., Hammerle, L. P., Falorni, A., Robertson, J., Lernmark, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Site-directed+mutagenesis+of+K396R+of+the+65+kDa+glutamic+acid+decarboxylase+active+site+obliterates+enzyme+activity+but+not+antibody+binding%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Site-directed mutagenesis of K396R of the 65 kDa glutamic acid decarboxylase active site obliterates enzyme activity but not antibody binding.</a> FEBS Lett. 488 (3), 185-189 (2001).</li>
<li>Avesani, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recombinant+human+GAD65+accumulates+to+high+levels+in+transgenic+tobacco+plants+when+expressed+as+an+enzymatically+inactive+mutant%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Biotechnol.+J%22%5BJournal%5D)">Recombinant human GAD65 accumulates to high levels in transgenic tobacco plants when expressed as an enzymatically inactive mutant.</a> Plant Biotechnol. J. 9 (8), 862-872 (2010).</li>
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<li>Avesani, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+analysis+of+different+biofactories+for+the+production+of+a+major+diabetes+autoantigen%5BTitle%5D)+AND+%22Transgenic+Res%22%5BJournal%5D)">Comparative analysis of different biofactories for the production of a major diabetes autoantigen.</a> Transgenic Res. 23, 281-291 (2014).</li>
<li>Marillonnet, S., Giritch, A., Gils, M., Kandzia, R., Klimyuk, V., Gleba, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+planta+engineering+of+viral+RNA+replicons%3A+efficient+assembly+by+recombination+of+DNA+modules+delivered+by+Agrobacterium%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+%28USA%29%22%5BJournal%5D)">In planta engineering of viral RNA replicons: efficient assembly by recombination of DNA modules delivered by Agrobacterium.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. (USA). 101 (18), 6852-6857 (2004).</li>
<li>Gleba, Y., Klimyuk, V., Marillonnet, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viral+vectors+for+the+expression+of+proteins+in+plants%29%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Viral vectors for the expression of proteins in plants).</a> Curr. Opin. Biotechnol. 18, 134-141 (2007).</li>
<li>Engler, C., Kandzia, R., Marillonnet, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+one+pot%2C+one+step%2C+precision+cloning+method+with+high+throughput+capability%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A one pot, one step, precision cloning method with high throughput capability.</a> PLoS One. 3 (11), (2008).</li>
<li>Xu, R., Li, Q. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protocol%3A+streamline+cloning+of+genes+into+binary+vectors+in+Agrobacterium+via+the+Gateway+TOPO+vector+system%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Methods%22%5BJournal%5D)">Protocol: streamline cloning of genes into binary vectors in Agrobacterium via the Gateway TOPO vector system.</a> Plant Methods. 4 (4), 1-7 (2008).</li>
<li>Fairbanks, G., Steck, T. L., Wallach, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrophoretic+analysis+of+the+major+polypeptides+of+the+human+erythrocyte+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Electrophoretic analysis of the major polypeptides of the human erythrocyte membrane.</a> Biochemistry. 10 (13), 2606-2617 (1971).</li>
<li>Falorni, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Radioimmunoassay+detects+the+frequent+occurrence+of+autoantibodies+to+the+Mr+65%2C000+isoform+of+glutamic+acid+decarboxylase+in+Japanese+insulin-dependent+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Autoimmunity%22%5BJournal%5D)">Radioimmunoassay detects the frequent occurrence of autoantibodies to the Mr 65,000 isoform of glutamic acid decarboxylase in Japanese insulin-dependent diabetes.</a> Autoimmunity. 19, 113-125 (1994).</li>
<li>Hunt, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+gene+to+protein%3A+a+review+of+new+and+enabling+technologies+for+multi-parallel+protein+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Expr.+Purif%22%5BJournal%5D)">From gene to protein: a review of new and enabling technologies for multi-parallel protein expression.</a> Protein Expr. Purif. 40 (1), 1-22 (2005).</li>
<li>Arzola, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transient+co-expression+of+post-transcriptional+silencing+suppressor+for+increased+in+planta+expression+of+a+recombinant+anthrax+receptor+fusion+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Mol.+Sci%22%5BJournal%5D)">Transient co-expression of post-transcriptional silencing suppressor for increased in planta expression of a recombinant anthrax receptor fusion protein.</a> Int. J. Mol. Sci. 12 (8), 4975-4990 (2011).</li>
<li>Merlin, M., Gecchele, E., Capaldi, S., Pezzotti, M., Avesani, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+evaluation+of+recombinant+protein+production+in+different+biofactories%3A+the+green+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed.+Res.+Int%22%5BJournal%5D)">Comparative evaluation of recombinant protein production in different biofactories: the green perspective.</a> Biomed. Res. Int. 2014, 136419(2014).</li>
<li>Avesani, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+in+planta+expression+of+the+human+islet+autoantigen+glutamic+acid+decarboxylase+%28GAD65%29%5BTitle%5D)+AND+%22Transgenic+Res%22%5BJournal%5D)">Improved in planta expression of the human islet autoantigen glutamic acid decarboxylase (GAD65).</a> Transgenic Res. 12 (2), 203-212 (2003).</li>
<li>Leuzinger, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+agroinfiltration+of+Plants+for+high-level+transient+expression+of+recombinant+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Efficient agroinfiltration of Plants for high-level transient expression of recombinant proteins.</a> J Vis Exp. (77), (2013).</li>
</ol>

Les auteurs déclarent qu’il n’y a pas de conflit d’intérêts concernant la publication de cet article.

Dans cette étude, trois modes différents ont été comparés pour l&#39;expression d&#39;une protéine recombinante humaine: des cellules bactériennes, des cellules de baculovirus / insectes et de plantes. La plate-forme à base de plantes a été étudiée plus en exploitant trois technologies d&#39;expression largement utilisés (c.-à-transitoire - MagnICON et pK7WG2 base - et stables). La protéine cible choisie pour cette expérience, hGAD65mut, a déjà été exprimé dans différents systèmes 13, et sa productio...

Les protéines recombinantes sont produites commercialement en masse dans des systèmes d’expression hétérologues à l’aide d’outils biotechnologiques émergents. Les facteurs clés à prendre en compte lors du choix du système d’expression hétérologue sont : la qualité des protéines, la fonctionnalité, la vitesse du processus, le rendement et le coût.
Dans le domaine des protéines recombinantes, le marché des produits pharmaceutiques est en pleine expansion et, par conséquent, la plupart des produits biopharmaceutiques produits aujourd’hui sont recombinants. Les protéines peuvent être exprimées dans des cultures cellulaires de bactéries, de levures, de moisissures, de mammifères, de plantes et d’insectes, ainsi que dans des systèmes végétaux (par transformation stable ou transitoire) et des animaux transgéniques ; Chaque système d’expression a ses avantages et ses limites inhérents et pour chaque protéine recombinante cible, le système de production optimal doit être soigneusement évalué.
Les plateformes à base de plantes apparaissent comme une alternative importante aux systèmes traditionnels basés sur des fermenteurs pour une production sûre et rentable de protéines recombinantes. Bien que les coûts de traitement en aval soient comparables à ceux des cellules microbiennes et de mammifères, l’investissement initial moins élevé requis pour la production commerciale de plantes et l’économie d’échelle potentielle, fournie par la culture sur de grandes superficies, sont des avantages clés.
Nous avons évalué des plantes en tant que bioréacteurs pour l’expression de l’isoforme 65 kDa de l’acide glutamique décarboxylase humaine (hGAD65), l’un des principaux auto-antigènes du diabète auto-immun de type 1 (DT1). hGAD65 est largement adopté comme marqueur, à la fois pour classifier et surveiller la progression de la maladie et son rôle dans la prévention du DT1 est actuellement à l’étude dans des essais cliniques. Si ces essais sont couronnés de succès, la demande mondiale de hGAD65 recombinant augmentera considérablement.
Ici, nous nous concentrons sur l’expression de la contrepartie enzymatiquement inactive de hGAD65, hGAD65mut, un mutant généré par substitution du résidu de lysine qui lie le cofacteur PLP (pyridoxal-5'-phosphate) à un résidu d’arginine (K396R)1. 
hGAD65mut conserve son immunogénicité et, dans les cellules de plantes et d’insectes, accumule jusqu’à dix fois plus que hGAD65, son homologue de type sauvage. On a émis l’hypothèse que l’activité enzymatique de hGAD65 interfère avec le métabolisme des cellules végétales à un point tel qu’elle supprime sa propre synthèse, tandis que hGAD65mut, la forme enzymatiquement inactive, peut être accumulée dans les cellules végétales à des niveaux plus élevés.
Pour l’expression de hGAD65mut, l’utilisation de différentes technologies, largement utilisées en biotechnologie végétale, a été explorée ici et comparée aux plateformes d’expression traditionnelles (Escherichia coli et à base de baculovirus/cellules d’insectes).
Dans ce travail, les plateformes recombinantes développées pour l’expression de hGAD65mut comprenant des systèmes traditionnels et à base de plantes ont été examinées et comparées sur la base de la vitesse et du rendement du procédé, ainsi que de la qualité et de la fonctionnalité du produit final.

<table><tbody><tr><td>Extrait de levure</td><td>Sigma</td><td>Y1333</td><td></td></tr><tr><td>Tryptone</td><td>Formedium</td><td>TRP03</td><td></td></tr><tr><td>Agar Bacteriological Grade</td><td>Applichem</td><td>A0949</td><td></td></tr><tr><td>Sf-900 II SFM medium</td><td>Gibco</td><td>10902-088</td><td></td></tr><tr><td>Grace' s Milieu insecte, non supplémenté</td><td>Gibco</td><td>11595-030</td><td></td></tr><tr><td>Réactif Cellfectin II</td><td>Invitrogen</td><td>10362-100</td><td></td></tr><tr><td>Milieu MS avec vitamines</td><td>Duchefa Biochemie</td><td>M0222</td><td></td></tr><tr><td>Saccharose</td><td>Duchefa Biochemie</td><td>S0809</td><td></td></tr><tr><td>Gélose végétale</td><td>Duchefa Biochemie</td><td>P1001</td><td></td></tr><tr><td>Ampicilline sodique</td><td>Duchefa Biochemie</td><td>A0104</td><td>Sulfate de</td></tr><tr><td>gentamycine</td> toxique <td>Duchefa Biochemie</td><td>G0124</td><td></td></tr><tr><td>Toxique Ganciclovir</td><td>Invitrogen</td><td>I2562-023</td><td></td></tr><tr><td>Carbenicilline disodique</td><td>Duchefa Biochemie</td><td>C0109</td><td>Sulfate</td></tr> de <tr><td>kanamycine</td> toxique <td>Sigma</td><td>K4000</td><td></td></tr><tr><td>Rifampicine</td> toxique <td>Duchefa Biochemie</td><td>R0146</td><td>Toxique et ndash ; 25 mg/ml de DMSO</td></tr><tr><td>Sulfate de streptomycine</td><td>Duchefa Biochemie</td><td>S0148</td><td>Chlorhydrate de</td></tr><tr><td>spectinomycine</td> toxique <td>Duchefa Biochemie</td><td>S0188</td><td></td></tr><tr><td>IPTG (isopropil-&beta ;-D-1-tiogalattopiranoside)</td><td>Sigma</td><td>I5502</td><td></td></tr><tr><td>Hydrate de MES</td> toxique <td>Sigma</td><td>M8250</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Biochemical</td><td>436994U</td><td></td></tr><tr><td>Acétosyringone</td><td>Sigma</td><td>D134406</td><td>Toxique &ndash ; 0,1 M stock dans une seringue DMSO</td></tr><tr><td>(1 ml)</td><td>Terumo</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Fluka</td><td>63136</td><td></td></tr><tr><td>BAP (6-Benzylaminopurine)</td><td>Sigma</td><td>B3408</td><td>NAA toxique</td></tr><tr><td>(Acide naphtalène acétique)</td><td>Duchefa Biochemie</td><td>N0903</td><td></td></tr><tr><td>Irritant Cefatrome</td><td>Mylan Génériques</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Trizma base</td><td>Sigma</td><td>T1503</td><td>Ajuster le pH avec 1 N HCl pour faire un tampon Tris-HCl</td></tr><tr><td></td><td>Sigma</td><td>H1758</td><td>Corrosif</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S3014</td><td>1 M stock</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P9541</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>Sigma</td><td>S7907</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Sigma</td><td>P9791</td><td></td></tr><tr><td>PMSF (fluorure de phénylméthanesulfonyle)</td><td>Sigma</td><td>P7626</td><td>Corrosif, toxique</td></tr><tr><td>Urea</td><td>Sigma</td><td>U5378</td><td></td></tr><tr><td>&beta ;-mercaptoethanol</td><td>Sigma</td><td>M3148</td><td>Toxic</td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma</td><td>P5927</td><td></td></tr><tr><td>Hepes</td><td>Sigma</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>DTT (Dithiothreitol)</td><td>Sigma</td><td>D0632</td><td>Toxique &ndash ; 1 M stock, stocker à -20 &deg ; C</td></tr><tr><td>CHAPS</td><td>Duchefa Biochemie</td><td>C1374</td><td></td></tr><tr><td>Toxique Cocktail inhibiteur de protéase végétale</td><td>Sigma</td><td>P9599</td><td>Ne pas congeler/décongeler trop de fois</td></tr><tr><td>SDS (Sodium dodecyl sulfate)</td><td>Sigma</td><td>L3771</td><td>Inflammable, toxique, corrosif &ndash ; 10 % stock</td></tr><tr><td>Glycérol</td><td>Sigma</td><td>G5516</td><td></td></tr><tr><td>Bleu brillant R-250</td><td>Sigma</td><td>B7920</td><td></td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td>Sigma</td><td>24137</td><td>Inflammable</td></tr><tr><td>Acide acétique</td><td>Sigma</td><td>27221</td><td>Corrosif</td></tr><tr><td>Anti-Glutamic acid decarboxylase 65/67</td><td>Sigma</td><td>G5163</td><td>Ne pas congeler/décongeler trop de fois</td></tr><tr><td>Anticorps anti-lapin conjugué à la peroxydase de raifort (HRP)</td><td>Sigma</td><td>A6154</td><td>Ne pas congeler/décongeler trop de fois</td></tr><tr><td>Sf9 Cellules</td><td>Vie Technologies</td><td>11496</td><td></td></tr><tr><td>BL21 Compétent E. coli</td><td>New England Biolabs</td><td>C2530H</td><td></td></tr><tr><td>Protéine A Sepharose</td><td>Sigma</td><td>P2545</td><td></td></tr><tr><td>Plaques de culture cellulaire</td><td>Sigma</td><td>CLS3516</td><td></td></tr><tr><td>Kit d’immuno-immuno</td><td>Techno Génétique</td><td>12650805</td><td>Matière radioactive</td></tr></tbody></table>

une analyse comparative des recombinant expression des protéines dans différents bio-usines: bactéries, cellules d&#39;insectes et plant systems

A Comparative Analysis of Recombinant Protein Expression in Different Biofactories: Bacteria, Insect Cells and Plant Systems

Systèmes à base de plantes sont considérées comme une plate-forme précieuse pour la production de protéines recombinantes en raison de leur potentiel bien documenté pour la production à faible coût flexible de haute qualité, produits bioactifs. Dans cette étude, nous avons comparé l&#39;expression d&#39;une protéine cible recombinante humaine dans les cultures traditionnelles à base de fermentation de cellules (bactériennes et d&#39;insectes) avec les systèmes d&#39;expression à base de plantes, à la fois transitoires et stables. Pour chaque plate-forme, nous avons décrit la mise en place, l&#39;optimisation et la longueur du processus de production, la qualité du produit final et les rendements et nous avons évalué les coûts de production provisoires, spécifiques de la protéine recombinante cible sélectionnée. Dans l&#39;ensemble, nos résultats indiquent que les bactéries ne sont pas appropriés pour la production de la protéine cible en raison de son accumulation dans les corps d&#39;inclusion insolubles. D&#39;autre part, les systèmes à base de plantes sont des plateformes polyvalentes tchapeau permet la production de la protéine choisie à plus faibles que les coûts-baculovirus / système de cellule d&#39;insecte. En particulier, les lignées transgéniques stables affichent le plus haut rendement du produit final et transitoires plantes exprimant le processus de développement plus rapide. Cependant, toutes les protéines recombinantes peuvent bénéficier de systèmes à base de plantes, mais la meilleure plate-forme de production devraient être déterminées empiriquement avec une approche au cas par cas, comme décrit ici.

Un modèle expérimental pour l&#39;expression hétérologue d&#39;une protéine recombinante cible dans différents systèmes de production est décrite ici. Le premier objectif était la mise en place des différentes plates-formes mettant en place les conditions optimales pour l&#39;expression de la protéine cible dans chaque système. L&#39;expression de la protéine cible, hGAD65mut, a été induite en triple E. coli cultures. A la suite de l&#39;expression 3 h à 37 ° C, les cellules bactéri...

Dans cette étude, l’expression d’une protéine recombinante humaine cible dans différentes plateformes de production a été comparée. Nous nous sommes concentrés sur les cultures traditionnelles à base de fermenteurs et sur les plantes, en décrivant la configuration de chaque système et en mettant en évidence, sur la base des résultats rapportés, les limites et les avantages inhérents à chaque plateforme.

Une analyse comparative des recombinant expression des protéines dans différents bio-usines: bactéries, cellules d&#39;insectes et Plant Systems

Plant-based systems are considered a valuable platform for the production of recombinant proteins as a result of their well-documented potential for the ...

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