Name: Auto-assemblage de formes bidimensionnelles complexes de lADN simple brin Tuiles (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-05-08T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 23 s
Description: Découvrez l'auto-assemblage de nanostructures d'ADN complexes à l'aide de tuiles d'ADN simple brin. Cette méthode combine électrophorèse sur gel d'agarose native et microscopie à force atomique pour vérifier la formation des structures.

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Ce travail a été financé par le Bureau du Programme de recherche navale Young Investigator N000141110914 Award, Office of Naval Research Grant N000141010827, NSF CAREER Award CCF1054898, New Innovator Award 1DP2OD007292 de directeur des NIH et l&#39;Institut Wyss pour Biologiquement Inspirée Fonds de démarrage Faculté de génie (PY) et Tsinghua de Pékin-Centre pour le Fonds de démarrage sciences de la vie (BW).

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<li>Yan, H., Park, S. H., Finkelstein, G., Reif, J. H., LaBean, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA-templated+self-assembly+of+protein+arrays+and+highly+conductive+nanowires%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">DNA-templated self-assembly of protein arrays and highly conductive nanowires.</a> Science. 301 (5641), 1882-1884 (2003).</li>
<li>Rothemund, P. W. K., Papadakis, N., Winfree, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Algorithmic+self-assembly+of+DNA+Sierpinski+triangles%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Algorithmic self-assembly of DNA Sierpinski triangles.</a> PLoS Biol. 2 (12), e424(2004).</li>
<li>Shih, W., Quispe, J., Joyce, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+1.7-kilobase+single-stranded+DNA+that+folds+into+a+nanoscale+octahedron%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A 1.7-kilobase single-stranded DNA that folds into a nanoscale octahedron.</a> Nature. 427 (6975), 618-621 (2004).</li>
<li>Chworos, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Building+programmable+jigsaw+puzzles+with+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Building programmable jigsaw puzzles with RNA.</a> Science. 306 (5704), 2068-2072 (2004).</li>
<li>Park, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Finite-size%2C+fully-addressable+DNA+tile+lattices+formed+by+hierarchical+assembly+procedures%5BTitle%5D)+AND+%22Angew.+Chem.+Int.+Ed%22%5BJournal%5D)">Finite-size, fully-addressable DNA tile lattices formed by hierarchical assembly procedures.</a> Angew. Chem. Int. Ed. 45 (5), 735-739 (2006).</li>
<li>Rothemund, P. W. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Folding+DNA+to+create+nanoscale+shapes+and+patterns%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Folding DNA to create nanoscale shapes and patterns.</a> Nature. 440 (7082), 297-302 (2006).</li>
<li>Schulman, R., Winfree, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+of+crystals+with+a+programmable+kinetic+barrier+to+nucleation%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Synthesis of crystals with a programmable kinetic barrier to nucleation.</a> Proc. Natl Acad. Sci. USA. 104 (39), 15236-15241 (2007).</li>
<li>He, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hierarchical+self-assembly+of+DNA+into+symmetric+supramolecular+polyhedra%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Hierarchical self-assembly of DNA into symmetric supramolecular polyhedra.</a> Nature. 452 (7184), 198-201 (2008).</li>
<li>Yin, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Programming+DNA+tube+circumferences%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Programming DNA tube circumferences.</a> Science. 321 (5890), 824-826 (2008).</li>
<li>Sharma, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+self-assembly+of+DNA+tubules+through+integration+of+gold+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Control of self-assembly of DNA tubules through integration of gold nanoparticles.</a> Science. 323 (5910), 112-116 (2009).</li>
<li>Douglas, S. M., Dietz, H., Liedl, T., Högberg, B., Graf, F., Shih, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-assembly+of+DNA+into+nanoscale+three-dimensional+shapes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Self-assembly of DNA into nanoscale three-dimensional shapes.</a> Nature. 459 (7245), 414-418 (2009).</li>
<li>Andersen, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-assembly+of+a+nanoscale+DNA+box+with+a+controllable+lid%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Self-assembly of a nanoscale DNA box with a controllable lid.</a> Nature. 459 (7243), 73-76 (2009).</li>
<li>Dietz, H., Douglas, S. M., Shih, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Folding+DNA+into+twisted+and+curved+nanoscale+shapes%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Folding DNA into twisted and curved nanoscale shapes.</a> Science. 325 (5941), 725-730 (2009).</li>
<li>Zheng, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+molecular+to+macroscopic+via+the+rational+design+of+self-assembled+3D%5BTitle%5D)+AND+%22DNA+crystal.+Nature%22%5BJournal%5D)">From molecular to macroscopic via the rational design of self-assembled 3D.</a> DNA crystal. Nature. 461 (7260), 74-77 (2009).</li>
<li>Han, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+origami+with+complex+curvatures+in+three-dimensional+space%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">DNA origami with complex curvatures in three-dimensional space.</a> Science. 332 (6024), 342-346 (2011).</li>
<li>Liu, W., Zhong, H., Wang, R., Seeman, N. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystalline+two-dimensional+DNA+origami+arrays%5BTitle%5D)+AND+%22Angew.+Chem.+Int.+Ed%22%5BJournal%5D)">Crystalline two-dimensional DNA origami arrays.</a> Angew. Chem. Int. Ed. 50 (1), 264-267 (2011).</li>
<li>Zhao, Z., Liu, Y., Yan, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organizing+DNA+origami+tiles+into+larger+structures+using+preformed+scaffold+frames%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Lett%22%5BJournal%5D)">Organizing DNA origami tiles into larger structures using preformed scaffold frames.</a> Nano Lett. 11 (7), 2997-3002 (2011).</li>
<li>Woo, S., Rothemund, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Programmable+molecular+recognition+based+on+the+geometry+of+DNA+nanostructures%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Chem%22%5BJournal%5D)">Programmable molecular recognition based on the geometry of DNA nanostructures.</a> Nat. Chem. 3 (8), 620-627 (2011).</li>
<li>Delebecque, C. J., Lindner, A. B., Silver, P. A., Aldaye, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organization+of+intracellular+reactions+with+rationally+designed+RNA+assemblies%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Organization of intracellular reactions with rationally designed RNA assemblies.</a> Science. 333 (6041), 470-474 (2011).</li>
<li>Lin, C., Liu, Y., Rinker, S., Yan, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+tile+based+self-assembly%3A+building+complex+nanoarchitectures%5BTitle%5D)+AND+%22ChemPhysChem%22%5BJournal%5D)">DNA tile based self-assembly: building complex nanoarchitectures.</a> ChemPhysChem. 7 (8), 1641-1647 (2006).</li>
<li>Seeman, N. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanomaterials+based+on+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Nanomaterials based on DNA.</a> Annu. Rev. Biochem. 79 (1), 65-87 (2010).</li>
<li>Voigt, N. V., Nangreave, J., Yan, H., Gothelf, K. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+origami%3A+a+quantum+leap+for+self-assembly+of+complex+structures%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Soc.+Rev%22%5BJournal%5D)">DNA origami: a quantum leap for self-assembly of complex structures.</a> Chem. Soc. Rev. 40 (12), 5636-5646 (2011).</li>
<li>Wei, B., Dai, M., Yin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complex+Shapes+self-assembled+from+single+stranded+DNA+tiles%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Complex Shapes self-assembled from single stranded DNA tiles.</a> Nature. 485 (7400), 623-626 (2012).</li>
<li>Wei, B., Wang, Z., Mi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Uniquimer%3A+software+of+de+novo+DNA+sequence+generation+for+DNA+self-assembly%3A+an+introduction+and+the+related+applications+in+DNA+self-assembly%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comput.+Theor.+Nanosci%22%5BJournal%5D)">Uniquimer: software of de novo DNA sequence generation for DNA self-assembly: an introduction and the related applications in DNA self-assembly.</a> J. Comput. Theor. Nanosci. 4 (1), 133-141 (2007).</li>
<li>Seeman, N. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((De+novo+design+of+sequences+for+nucleic+acid+structural+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomol.+Struct.+Dyn%22%5BJournal%5D)">De novo design of sequences for nucleic acid structural engineering.</a> J. Biomol. Struct. Dyn. 8 (3), 573-581 (1990).</li>
<li>Hansma, H. G., Laney, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+binding+to+mica+correlates+with+cationic+radius%3A+assay+by+atomic+force+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">DNA binding to mica correlates with cationic radius: assay by atomic force microscopy.</a> Biophys. J. 70 (4), 1933-1939 (1996).</li>
<li>Seelig, G., Soloveichik, D., Zhang, D. Y., Winfree, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzyme-free+nucleic+acid+logic+circuits%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Enzyme-free nucleic acid logic circuits.</a> Science. 314 (5805), 1585-1588 (2006).</li>
<li>Yin, P., Choi, H. M. T., Calvert, C. R., Pierce, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Programming+biomolecular+self-assembly+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Programming biomolecular self-assembly pathways.</a> Nature. 451 (7176), 318-322 (2008).</li>
</ol>

Les auteurs déclarent des intérêts financiers concurrents.

Dans l&#39;étape de formation de la structure, il est important de maintenir une concentration appropriée de cations de magnésium (par ex., 15 mM) dans le mélange de brin d&#39;ADN de nanostructures d&#39;ADN auto-assembler. De même, dans l&#39;étape de caractérisation gel d&#39;agarose / purification, il est important de maintenir une concentration de cations de magnésium approprié (par ex., 10 mM) dans le gel et le tampon du gel de fonctionnement pour retenir les nanostructures d&#39;ADN durant l&#39...

Acide nucléique précédent travail d&#39;auto-assemblage 1-25 a conduit à la construction réussie d&#39;une variété de structures complexes, y compris l&#39;ADN 2 - 5,8,10 - 13,17,23 ou d&#39;ARN 7,22 3,4,7 périodique, 22 et algorithmique 5 bidimensionnelles treillis, rubans 10,12 et tubes 4,12,13, cristaux 3D 17, 11 et polyèdres finis, formes 2D 7,8. Une méthode particulièrement efficace est échafaudée l&#39;ADN origami, par lequel un seul brin d&#39;échafaudage est plié par de nombreux courts brins de base auxiliaires pour former une forme complexe 9,14 - 16,18 - 21,25. Nous avons récemment rapporté une méthode pour construire des nanostructures discrètes avec des formes 2D prescrites en utilisant les tuiles simple brin (SST), et démontré la complexité des structures comparables à l&#39;ADN origami 26. Cette article est une adaptation de notre travail antérieur 26 et décrit des protocoles détaillés pour organiser SST adressables individuellement dans des formes 2D finis sophistiqués avec des dimensions précisément prescrites (largeurs et longueurs) et morphologies. Un avantage clé de la méthode SST est sa modularité. Chaque SST composant d&#39;une structure sert d&#39;unité de construction modulaire dans l&#39;assemblée, et les différents sous-ensembles de ces SST produire des formes distinctes. Ainsi, nous avons créé une plate-forme générale pour construire des nanostructures avec des tailles et des formes prescrites à partir de courts brins d&#39;ADN synthétiques. SST contiennent quatre domaines, chacun 10 ou 11 nucléotides de long (figure 1A). Les SST lient de telle sorte que leurs hélices parallèles créent un réseau d&#39;ADN maintenus ensemble par des liens croisés. Chaque croisement est le phosphate entre les domaines 2 et 3. Le phosphate est étiré artificiellement dans les schémas pour la clarté visuelle. Les croisements sont espacés deux spires hélicoïdales (21 bases) d&#39;intervalle (&lt;strong&gt; Figure 1B). Les rectangles composites sont désignés par leurs dimensions dans le nombre d&#39;hélices et les spires hélicoïdales. Par exemple, un rectangle qui est six hélices de large et huit spires hélicoïdales longue est référencé comme un rectangle 6H × 8T. SST peut être omis, ajoute, ou autrement réarrangés pour créer des structures de formes et de tailles (figure 1C) arbitraires. Par exemple, une forme rectangulaire peut être enroulée dans un tube à une longueur souhaitée et du rayon (figure 1D). Alternativement, le SST réseau rectangulaire peut être considérée comme une toile moléculaire constitué de SST pixels, chaque 3 nm de 7 nm. Dans cette étude, nous utilisons une toile moléculaire de 310 pleine longueur SST internes, 24 SST-métrages qui composent les limites gauche et droite, et 28 demi-longueur SST constituent les limites supérieure et inférieure. La toile a 24 doubles hélices reliées par des croisements et chaque hélice contient 28 spires hélicoïdales (294 bases) et est donc appeléune 24H × 28T toile rectangulaire. Le 24H × toile 28T a un poids moléculaire similaire à celle d&#39;une structure de l&#39;ADN origami créé à partir d&#39;un phage M13 échafaudage.

<table><tbody><tr><td>Brins d’ADN°</td><td>Technologie</td><td></td> ADN intégrée <td>Section 3.1</td></tr><tr><td>SYBR Coloration sûre au gel d’ADN</td><td>Invitrogen</td><td>S33102</td><td>Section 3.4.2</td></tr><tr><td>Colonnes de spin d’extraction de gel d’ADN Freeze’N Squeeze BIO-RAD</td><td></td><td>731-6166</td><td>Section 3.6</td></tr><tr><td>Sondes à levier de nitrure tranchant de Bruker Sondes</td><td>AFM Bruker SNL10</td><td></td><td>Section 4.3</td></tr><tr><td>Safe Imager 2.0 Transilluminateur de lumière bleue</td><td>Invitrogen</td><td>G6600</td><td>Section 3.6</td></tr><tr><td>Centrifugeuse 5430R</td><td>Eppendorf</td><td>5428 000.414</td><td>Section 3.6</td></tr><tr><td>Microscope électronique à transmission&nbsp ;</td><td>Jeol</td><td>Jem 1400</td><td>Section 7.4</td></tr><tr><td>Multimode 8</td><td>Veeco</td><td></td><td>Section 4</td></tr><tr><td>Typhoon FLA 9000 Scanner laser</td><td>GE Heathcare Life Sciences</td><td>28-9558-08</td><td>Section 3.5</td></tr><tr><td>Eau distillée ultrapure</td><td>Invitrogen</td><td>10977-023</td><td>Section 3.7.1</td></tr><tr><td>Disque de mica</td><td>SPI Supplies</td><td>12001-26-2</td><td>Section 4.1</td></tr><tr><td>Disque de montage en acier</td><td>Ted Pella, Inc.</td><td>16218</td><td>Section 4.1</td></tr><tr><td>grille en cuivre revêtue de carbone pour</td><td>TEM Microscopie électronique Sciences</td><td>FCF400-Cu</td><td>Section 7.2</td></tr><tr><td>pince à épiler</td><td>Dumont</td><td>0203-N5AC-PO</td><td>Section 7.31</td></tr><tr><td>système de décharge lumineuse</td><td>Quorum Technologies</td><td>K100X</td><td>Section 7.2</td></tr><tr><td>Moteur d’ADN Tetrad 2 Thermocycleur Peltier</td><td>BIO-RAD</td><td>PTC&ndash ; 0240G</td><td>Section 3.3</td></tr><tr><td>Owl Easycast B2 Mini Gel Electrophoresis</td><td>Systems ThermoScientific</td><td>B2</td><td>Section 3.4.3</td></tr><tr><td>Seekam LE Agarose 500G</td><td>Lonza</td><td>50004</td><td>Section 3.4.1</td></tr><tr><td>GeneRuler 1kb Plus Échelle d’ADN, prête à l’emploi 75-20000bp</td><td>ThermoScientific</td><td>SM1333</td><td>Section 3.4.4</td></tr><tr><td>Nanodrop 2000c Spectrophotomètre UV-vis</td><td>ThermoScientific</td><td></td><td>Paragraphe 3.7</td></tr><tr><td>0,2 um filtre</td><td>Corning Inc.</td><td>431219</td><td>Section 7.1.2</td></tr></tbody></table>

auto-assemblage de formes bidimensionnelles complexes de l&#39;adn simple brin tuiles

Self-assembly of Complex Two-dimensional Shapes from Single-stranded DNA Tiles

Les méthodes actuelles en nano-architecture de l’ADN ont réussi à concevoir une variété de structures 2D et 3D en utilisant les principes de l’auto-assemblage. Dans cet article, nous décrivons des protocoles détaillés sur la façon de fabriquer des formes 2D sophistiquées grâce à l’auto-assemblage de tuiles d’ADN monocaténaire adressables de manière unique qui agissent comme des pixels moléculaires sur une toile moléculaire. Chaque tuile simple brin (SST) est un brin d’ADN à 42 nucléotides composé de quatre domaines modulaires concaténés qui se lient à quatre voisins lors de l’auto-assemblage. Le canevas moléculaire est une structure rectangulaire auto-assemblée à partir de SST. Une forme 2D complexe prescrite est formée en sélectionnant les pixels moléculaires constitutifs (SST) à partir d’un canevas moléculaire de 310 pixels, puis en soumettant les brins correspondants à un recuit en un seul pot. En raison de la nature modulaire de l’approche SST, nous démontrons l’évolutivité, la polyvalence et la robustesse de cette méthode. Par rapport à d’autres méthodes, la méthode SST permet une plus grande sélection de polymères et de séquences d’information grâce à l’utilisation de brins d’ADN courts conçus et synthétisés de novo.

L&#39;auto-assemblage de SST (figure 1) donnera une 24H x 28T rectangle, comme illustré sur la Figure 2. Les séquences d&#39;ADN pour les différents TDDS peuvent être modifiés / optimisé pour permettre l&#39;étiquetage de la streptavidine (figure 3 et 4), la transformation d&#39;un rectangle dans un tube (figure 5), l&#39;auto-assemblage programmable de SST pour former des tubes et des rectangles de différentes tailles (figure 1...

Le pavage d’ADN est une approche efficace pour fabriquer des nanostructures programmables. Nous décrivons les protocoles permettant de construire des formes bidimensionnelles complexes par l’auto-assemblage de tuiles d’ADN simple brin.

Auto-assemblage de formes bidimensionnelles complexes de l&#39;ADN simple brin Tuiles

Current methods in DNA nano-architecture have successfully engineered a variety of 2D and 3D structures using principles of self-assembly. In this ...

L'objectif général de l'expérience suivante est de former des nanostructures complexes en ADN à l'aide de tuiles monocaténaires. Cette étape est réalisée en mélangeant des brins d'ADN synthétiques soigneusement conçus dans une solution tampon appropriée afin de former la nanostructure d'ADN souhaitée lors d'une deuxième étape. L'échantillon est incubé, période durant laquelle s'effectue l'auto-assemblage de la structure.Ensuite, une électrophorèse native sur gel d'agarose et une imagerie par microscopie à force atomique sont réalisées afin de vérifier la formation réussie des nanostructures. Les résultats montrent que les nanostructures d'ADN s'assemblent spontanément, conformément aux analyses par électrophorèse native sur gel d'agarose et par microscopie à force atomique. Généralement, les personnes novices dans cette méthode éprouvent des difficultés, car la préparation des échantillons pour un tel auto-assemblage semble compliquée. Avant de commencer cette procédure, obtenez les brins d'ADN composants aux séquences spécifiées, dissous dans de l'eau exempte d'ARN, auprès d'un fabricant d'oligonucléotides, puis dans des plaques Vbo à 96 puits, pipetez un microlitre depuis chacun des 362 puits destinés aux 24 hélices sur 28 tours.Placer 100 micromolaire par brin dans un tube à essai de deux millilitres. Ajouter ensuite 138 microlitres d'eau distillée désionisée dans le tube à essai pour préparer une solution mère à une concentration de 200 nanomolaire par brin.Ajouter 50 microlitres de la solution mère de 200 nanomolaire, 10 microlitres de tampon d’hybridation 10 x A et 40 microlitres d’eau distillée désionisée dans un tube PCR de 0,2 millilitre. Incuber ensuite l’échantillon pendant 17 heures dans un thermocycleur en refroidissant de 90 à 25 degrés Celsius.Après avoir préparé un gel d'agarose natif à 2 % pré-électrophorésé avec du SYBR safe, faire migrer le gel pendant deux heures à 100 volts dans un bain d'eau glacée. Une fois terminé, imager le gel à l'aide d'un scanner de gel muni d'un filtre approprié pour la coloration SYBR safe sur un transilluminateur à lumière bleue, puis exciser la bande dominante ayant une mobilité similaire à celle de la bande de 1 500 paires de bases de l'échelle d'ADN d'un kilobase à l'aide d'une lame de rasoir propre et aiguisée. Placer les morceaux de gel désirés dans une colonne de centrifugation, puis broyer le gel en petits morceaux à l'aide d'un pilon pour microtube, puis centrifuger à 438 ×g pendant trois minutes à quatre degrés Celsius.Après la centrifugation, mesurez la concentration de l'ADN à l'aide d'un spectrophotomètre ultraviolet à 260 nanomètres. À ce stade, retirez la mica fixée à un disque métallique d'échantillon à l'aide de ruban adhésif afin d'obtenir une surface plane, puis placez le disque d'échantillon sur le plateau d'imagerie du microscope.Ajoutez 40 microlitres d'un tampon X et du tampon A suivis de cinq microlitres de l'échantillon purifié des 24 HELOCs par 28 tours rectangle sur une surface fraîchement clivée de Micah. Laissez le mélange se déposer pendant environ deux minutes. Installez une puce de levier en nitrure de silicium AFM sur un porte-levier et imagez l'échantillon en mode tapping dans le fluide en utilisant une taille de balayage de deux micromètres et 1024 lignes pour la résolution.Et une vitesse de balayage de 0,5 à un hertz pour le marquage interne attaché à un segment de 17 nucléotides en position trois prime, huit tuiles internes et six tuiles limites du rectangle. Mélangez les 28 brins munis de poignées avec le reste des brins composants des 24 HELOCs selon un rectangle de 28 tours pour obtenir une solution mère à 200 nanomolaires destinée au marquage des limites. Mélangez les 14 brins munis de poignées avec le reste des brins composants des 24 mer HELOCs selon un rectangle de 28 tours pour obtenir une solution mère à 200 nanomolaires destinée au marquage interne.Pour le marquage des extrémités, ajouter 50 microlitres de la solution mère de 200 nanomolaire. 60 microlitres des brins modifiés par biotine à 100 micromolaire. 10 microlitres de tampon de recuit 10 x A et 34 microlitres d'eau distillée désionisée dans un tube PCR.Pour le marquage interne, ajouter 50 microlitres de la solution mère de 200 nanomolaire. Trois microlitres de la chaîne interne anti-handle modifiée par la biotine à 100 micromolaire. 10 microlitres de tampon de recuit 10 x A et 37 microlitres d'eau distillée désionisée dans un tube PCR.Ensuite, peser 0,06 gramme de formiate d'urane dans trois millilitres d'eau distillée. Pour préparer une solution aqueuse de colorant au formiate d'urane à 2 %, filtrer la solution de coloration à l'aide d'un filtre de 0,2 microlitre fixé à la seringue. Ajouter cinq microlitres de soude à cinq normaux à un millilitre de la solution de colorant filtrée.Après avoir vortexé brièvement la solution, centrifuger à 20 000 G. Décharger les grilles recouvertes de carbone avec le côté revêtu orienté vers le haut en utilisant les paramètres suivants. Une fois terminé, pipeter 3,5 microlitres d'échantillon sur la grille traitée par décharge luminescente. Après quatre minutes, utiliser un morceau de papier filtre pour éliminer l'échantillon en mettant le papier filtre en contact avec la grille sur le côté.Ajouter immédiatement 3,5 microlitres de la solution de colorant sur la grille. Après une minute, absorber le colorant et maintenir le papier filtre contre la grille pendant une à deux minutes. Transférer la grille dans un porte-objet pour MET.Une image réalisée à l’aide du microscope A-J-E-O-L GM 1400, fonctionnant à 80 kilovolts avec un grossissement compris entre 10 K et 80 K. Une fois la forme identifiée, sélectionnez les brins correspondant à cette forme sur la toile moléculaire. Remplacez le domaine exposé par un segment poly T de 10 à 11 nucléotides de longueur, ou ajoutez un protecteur de bord complémentaire au domaine exposé et terminez-le par un segment poly T de 10 à 11 nucléotides de long. Pour éviter l’agrégation, créez une bibliothèque de brins pour la toile moléculaire de 310 pixels, incluant le corset.Placez un ensemble étoile, deux ensembles étoile, trois ensembles étoile et quatre ensembles étoile pour obtenir un total de 1 344 protecteurs de bord. Après centrifugation des plaques de 96 puits pour les différents ensembles, pipetez un microlitre de 206 brins provenant de l'ensemble de base, zéro provenant de l'ensemble un étoile, zéro provenant de l'ensemble deux étoile, zéro provenant de l'ensemble trois étoile et 24 brins provenant de l'ensemble quatre étoile dans un tube de centrifugation de deux millilitres. Ajoutez 20 microlitres d'eau distillée désionisée au tube afin d'obtenir une solution mère de 400 nanomolaire des brins d'ADN.Ensuite, ajoutez 50 microlitres de la solution mère de 400 nanomolaires. Ajoutez 10 microlitres de tampon de recuit 10 x B et 40 microlitres d'eau distillée désionisée dans un tube PCR de 0,2 millilitre, puis incubez le mélange dans le thermocycleur pendant 17 heures comme décrit précédemment. Après purification de l'échantillon et mesure de la concentration en ADN, imagez l'échantillon à l'aide d'un microscope à force atomique (FM) de la même manière qu'auparavant, puis construisez finalement des rectangles de tailles différentes en modifiant simplement le nombre de brins parallèles et le nombre de tours hélicoïdaux.L'auto-assemblage de tuiles monocaténaires produira un rectangle de 24 HELOC sur 28 tours ; les séquences d'ADN des différentes tuiles monocaténaires peuvent être modifiées et optimisées afin de permettre une division par strep et un marquage, ainsi que la transformation d'un rectangle en un tube. L'auto-assemblage programmable de tuiles monocaténaires permettant de former des tubes et des rectangles de tailles variables, ainsi que la construction de formes arbitraires bidimensionnelles à l'aide de la toile moléculaire, a été testé. La conception par substitution de domaine et la conception par protecteur de bord ont été évaluées comme solutions pour prévenir l'agrégation au niveau des domaines exposés des formes arbitraires. Les deux conceptions présentent un rendement électrophorétique et une intégrité structurale comparables, mais la conception par protecteur de bord est plus économique, car elle nécessite moins d'espèces auxiliaires.Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment fabriquer des nanostructures d'ADN complexes basées sur des tuiles monocaténaires.

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