Auto-assemblage de formes bidimensionnelles complexes de l'ADN simple brin Tuiles

L'objectif général de l'expérience suivante est de former des nanostructures complexes en ADN à l'aide de tuiles monocaténaires. Cette étape est réalisée en mélangeant des brins d'ADN synthétiques soigneusement conçus dans une solution tampon appropriée afin de former la nanostructure d'ADN souhaitée lors d'une deuxième étape. L'échantillon est incubé, période durant laquelle s'effectue l'auto-assemblage de la structure.

Ensuite, une électrophorèse native sur gel d'agarose et une imagerie par microscopie à force atomique sont réalisées afin de vérifier la formation réussie des nanostructures. Les résultats montrent que les nanostructures d'ADN s'assemblent spontanément, conformément aux analyses par électrophorèse native sur gel d'agarose et par microscopie à force atomique. Généralement, les personnes novices dans cette méthode éprouvent des difficultés, car la préparation des échantillons pour un tel auto-assemblage semble compliquée. Avant de commencer cette procédure, obtenez les brins d'ADN composants aux séquences spécifiées, dissous dans de l'eau exempte d'ARN, auprès d'un fabricant d'oligonucléotides, puis dans des plaques Vbo à 96 puits, pipetez un microlitre depuis chacun des 362 puits destinés aux 24 hélices sur 28 tours.

Placer 100 micromolaire par brin dans un tube à essai de deux millilitres. Ajouter ensuite 138 microlitres d'eau distillée désionisée dans le tube à essai pour préparer une solution mère à une concentration de 200 nanomolaire par brin.

Ajouter 50 microlitres de la solution mère de 200 nanomolaire, 10 microlitres de tampon d’hybridation 10 x A et 40 microlitres d’eau distillée désionisée dans un tube PCR de 0,2 millilitre. Incuber ensuite l’échantillon pendant 17 heures dans un thermocycleur en refroidissant de 90 à 25 degrés Celsius.

Après avoir préparé un gel d'agarose natif à 2 % pré-électrophorésé avec du SYBR safe, faire migrer le gel pendant deux heures à 100 volts dans un bain d'eau glacée. Une fois terminé, imager le gel à l'aide d'un scanner de gel muni d'un filtre approprié pour la coloration SYBR safe sur un transilluminateur à lumière bleue, puis exciser la bande dominante ayant une mobilité similaire à celle de la bande de 1 500 paires de bases de l'échelle d'ADN d'un kilobase à l'aide d'une lame de rasoir propre et aiguisée. Placer les morceaux de gel désirés dans une colonne de centrifugation, puis broyer le gel en petits morceaux à l'aide d'un pilon pour microtube, puis centrifuger à 438 ×g pendant trois minutes à quatre degrés Celsius.

Après la centrifugation, mesurez la concentration de l'ADN à l'aide d'un spectrophotomètre ultraviolet à 260 nanomètres. À ce stade, retirez la mica fixée à un disque métallique d'échantillon à l'aide de ruban adhésif afin d'obtenir une surface plane, puis placez le disque d'échantillon sur le plateau d'imagerie du microscope.

Ajoutez 40 microlitres d'un tampon X et du tampon A suivis de cinq microlitres de l'échantillon purifié des 24 HELOCs par 28 tours rectangle sur une surface fraîchement clivée de Micah. Laissez le mélange se déposer pendant environ deux minutes. Installez une puce de levier en nitrure de silicium AFM sur un porte-levier et imagez l'échantillon en mode tapping dans le fluide en utilisant une taille de balayage de deux micromètres et 1024 lignes pour la résolution.

Et une vitesse de balayage de 0,5 à un hertz pour le marquage interne attaché à un segment de 17 nucléotides en position trois prime, huit tuiles internes et six tuiles limites du rectangle. Mélangez les 28 brins munis de poignées avec le reste des brins composants des 24 HELOCs selon un rectangle de 28 tours pour obtenir une solution mère à 200 nanomolaires destinée au marquage des limites. Mélangez les 14 brins munis de poignées avec le reste des brins composants des 24 mer HELOCs selon un rectangle de 28 tours pour obtenir une solution mère à 200 nanomolaires destinée au marquage interne.

Pour le marquage des extrémités, ajouter 50 microlitres de la solution mère de 200 nanomolaire. 60 microlitres des brins modifiés par biotine à 100 micromolaire. 10 microlitres de tampon de recuit 10 x A et 34 microlitres d'eau distillée désionisée dans un tube PCR.

Pour le marquage interne, ajouter 50 microlitres de la solution mère de 200 nanomolaire. Trois microlitres de la chaîne interne anti-handle modifiée par la biotine à 100 micromolaire. 10 microlitres de tampon de recuit 10 x A et 37 microlitres d'eau distillée désionisée dans un tube PCR.

Ensuite, peser 0,06 gramme de formiate d'urane dans trois millilitres d'eau distillée. Pour préparer une solution aqueuse de colorant au formiate d'urane à 2 %, filtrer la solution de coloration à l'aide d'un filtre de 0,2 microlitre fixé à la seringue. Ajouter cinq microlitres de soude à cinq normaux à un millilitre de la solution de colorant filtrée.

Après avoir vortexé brièvement la solution, centrifuger à 20 000 G. Décharger les grilles recouvertes de carbone avec le côté revêtu orienté vers le haut en utilisant les paramètres suivants. Une fois terminé, pipeter 3,5 microlitres d'échantillon sur la grille traitée par décharge luminescente. Après quatre minutes, utiliser un morceau de papier filtre pour éliminer l'échantillon en mettant le papier filtre en contact avec la grille sur le côté.

Ajouter immédiatement 3,5 microlitres de la solution de colorant sur la grille. Après une minute, absorber le colorant et maintenir le papier filtre contre la grille pendant une à deux minutes. Transférer la grille dans un porte-objet pour MET.

Une image réalisée à l’aide du microscope A-J-E-O-L GM 1400, fonctionnant à 80 kilovolts avec un grossissement compris entre 10 K et 80 K. Une fois la forme identifiée, sélectionnez les brins correspondant à cette forme sur la toile moléculaire. Remplacez le domaine exposé par un segment poly T de 10 à 11 nucléotides de longueur, ou ajoutez un protecteur de bord complémentaire au domaine exposé et terminez-le par un segment poly T de 10 à 11 nucléotides de long. Pour éviter l’agrégation, créez une bibliothèque de brins pour la toile moléculaire de 310 pixels, incluant le corset.

Placez un ensemble étoile, deux ensembles étoile, trois ensembles étoile et quatre ensembles étoile pour obtenir un total de 1 344 protecteurs de bord. Après centrifugation des plaques de 96 puits pour les différents ensembles, pipetez un microlitre de 206 brins provenant de l'ensemble de base, zéro provenant de l'ensemble un étoile, zéro provenant de l'ensemble deux étoile, zéro provenant de l'ensemble trois étoile et 24 brins provenant de l'ensemble quatre étoile dans un tube de centrifugation de deux millilitres. Ajoutez 20 microlitres d'eau distillée désionisée au tube afin d'obtenir une solution mère de 400 nanomolaire des brins d'ADN.

Ensuite, ajoutez 50 microlitres de la solution mère de 400 nanomolaires. Ajoutez 10 microlitres de tampon de recuit 10 x B et 40 microlitres d'eau distillée désionisée dans un tube PCR de 0,2 millilitre, puis incubez le mélange dans le thermocycleur pendant 17 heures comme décrit précédemment. Après purification de l'échantillon et mesure de la concentration en ADN, imagez l'échantillon à l'aide d'un microscope à force atomique (FM) de la même manière qu'auparavant, puis construisez finalement des rectangles de tailles différentes en modifiant simplement le nombre de brins parallèles et le nombre de tours hélicoïdaux.

L'auto-assemblage de tuiles monocaténaires produira un rectangle de 24 HELOC sur 28 tours ; les séquences d'ADN des différentes tuiles monocaténaires peuvent être modifiées et optimisées afin de permettre une division par strep et un marquage, ainsi que la transformation d'un rectangle en un tube. L'auto-assemblage programmable de tuiles monocaténaires permettant de former des tubes et des rectangles de tailles variables, ainsi que la construction de formes arbitraires bidimensionnelles à l'aide de la toile moléculaire, a été testé. La conception par substitution de domaine et la conception par protecteur de bord ont été évaluées comme solutions pour prévenir l'agrégation au niveau des domaines exposés des formes arbitraires. Les deux conceptions présentent un rendement électrophorétique et une intégrité structurale comparables, mais la conception par protecteur de bord est plus économique, car elle nécessite moins d'espèces auxiliaires.

Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment fabriquer des nanostructures d'ADN complexes basées sur des tuiles monocaténaires.