Name: Deux photons Imaging of Cellular Dynamics dans la moelle épinière de souris (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-02-22T16:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 44 s
Description: Apprenez l'imagerie à deux photons des cellules souches neurales transplantées et des axones dans la moelle épinière de souris ex vivo. Cette méthode permet l'observation en temps réel des interactions cellulaires pendant dix heures.

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Ce travail a été soutenu en partie par les subventions R01 GM-41514 (à M.D.C.), R39 GM-048071 (à I.P.) et R01 NS-074987 (à T.E.L.) et la bourse de recherche du Centre collaboratif CA1058-A-8 de la National Multiple Sclerosis Society (NMSS) (à C.M.W., T.E.L. et M.D.C.), la subvention NMSS RG4925, la subvention de formation NIH T32-AI-060573 (à M.L.G.), Bourse postdoctorale NMSS FG 1960-A-1 (à J.G.W.), et financement de la Fondation George E. Hewitt pour la recherche médicale (M.P.M.).

NOTE: Éthique Déclaration: Le protocole de manipulation des animaux a été approuvé par le Comité institutionnel de protection des animaux et l&#39;utilisation (IACUC) de l&#39;Université de Californie, Irvine, le protocole # 2010-2943. 1. Suppression de la moelle épinière <ol><li> Placez des serviettes en papier mouillés avec ~ 100% d&#39;isoflurane liquide, USP dans la chambre euthanasie et placer des serviettes en papier sec sur le dessus. Placez la souris dans la chambre au-dessus de serviettes en papier sèche afin souris ne est pas en contact avec le isoflurane et se assurer que la chambre est couverte. Attendre au moins une minute après l&#39;arrêt de la respiration pour que la souris est euthanasiée. </li><li> Effectuez une transection moelle du cou pour se assurer de la souris est euthanasié. Ne pas effectuer une dislocation cervicale car cela pourrait endommager la moelle épinière. </li><li> Pulvériser la souris avec 70% d&#39;éthanol pour mouiller les cheveux. </li><li> Utilisez des ciseaux Beaux pointus pour enlever la peau et les cheveux à l&#39;arrière de la souris pour exposer la colonne vertébrale d&#39;environ 1 lamina cervicale (C1) À lame sacrée 4 (S4). </li><li> En utilisant un scalpel à lame # 10, faire des incisions à gauche et à droite de la colonne vertébrale de la séparer de muscle et la graisse. Cela rendra le retrait de la moelle épinière beaucoup plus facile. </li><li> option: une rongeurs Luer courbes peuvent être utilisés pour ramasser loin chair supplémentaire. </li><li> Tout en maintenant le haut de la colonne vertébrale avec des pinces dentelées Graefe, insérez titane ciseaux courbés Vannas avec le côté bombé vers le haut dans la colonne vertébrale exposée au C1, en faisant attention à ne pas toucher la moelle épinière. </li><li> Faites glisser le titane ciseaux courbes Vannas tout le chemin à droite et faire une petite coupure. Un petit son crunch devrait être entendu et ressenti comme les ciseaux coupent les vertèbres. Répétez cette coupe sur le côté gauche de la corde. Veillez à ne pas aller trop vite ou de faire trop grand d&#39;une coupe car cela risque d&#39;endommager le cordon avec les ciseaux. </li><li> La seule lame doit pouvoir être soulevé avec la pince lorsque les côtés des vertèbres sont coupés. REPEAT cette étape pour chaque lamelle jusqu&#39;à S4, du maintien et tirez les vertèbres de la moelle épinière. REMARQUE: les vertèbres au-dessus du site de greffe viendra probablement une fois qu&#39;il est coupé au site de transplantation. Continuer la procédure de départ juste en dessous du site de transplantation. </li><li> option: jeter les vertèbres bas pour voir où le site de transplantation est et mesure et couper ~ 20 mm rostrale et caudale vers le site de transplantation. REMARQUE: Lors de la transplantation PNJ plus ne sera pas nécessaire que les PNJ transplantés généralement ne migrent pas à plus de 15 mm. Le montant de la moelle épinière nécessaire sera fonction des caractéristiques d&#39;expérimentation et de migration de type de cellule transplanté. Faire des coupes rostrale et caudale qui sont équidistants sur le site de transplantation permettra au site de transplantation d&#39;être placées plus facilement lors de l&#39;imagerie. </li><li> Avec un scalpel avec une lame # 11 Découpez soigneusement les ganglions sur la droite et à gauche de la face ventrale de la moelle épinière à partir de la fin rostrale. Ce wmalade permettre la moelle épinière à être présente dans les vertèbres ventral plus facilement. REMARQUE: Fait rapidement (étapes 01.07 à 01.11), la moelle épinière ne se dessèche pas. Cependant, PBS 1x peut être administré à la corde pour garder humide. </li><li> Inverser la souris et maintenez la souris vers le haut de sorte que la moelle épinière est orientée vers le bas. Retirer délicatement sur la moelle épinière en utilisant des pinces dentelées Graefe fermés. Sans entailler la moelle épinière, découpez soigneusement toutes les ganglions restants pour permettre la moelle épinière pour être levée dans une seule pièce intacte. </li><li> Assurez-vous que la moelle épinière est en RPMI-1640 et le placer sur la glace pour le transport vers le microscope 2P. </li></ol> 2. Préparation de la moelle épinière for Imaging <ol><li> Intégration de la moelle épinière dans l&#39;agarose <ol><li> Gardez la moelle épinière isolée dans réfrigérés RPMI-1640 sur la glace avant l&#39;imagerie. </li><li> Peser agarose (à basse température de gélification) et préparer une solution à 5% dans 5 ml de 1 x PBS. Micro-ondes la solution d&#39;agarose à 5% pendant 15 secondes pour dissoudre le agse leva et laissez refroidir la solution à 37 ° C. </li><li> Préparation de la moelle épinière en le plaçant sur une feuille de Parafilm avec la face ventrale vers le haut. </li><li> Pipet environ 5 ml de solution d&#39;agarose 5% par rapport à la face ventrale de la moelle épinière. Soit l&#39;agarose se solidifie par refroidissement à la température ambiante. Solidification complète prend environ 5 min. </li><li> Appliquer une légère couche de colle tissulaire à un couvercle carré glissement 22 mm. </li><li> Inversez la moelle épinière intégré, plaçant la face ventrale sur Parafilm. La face dorsale va maintenant être orientée vers le haut. Respecter la lamelle à la face dorsale, et plonger la moelle épinière / préparation couvercle intégré agarose de glissement dans IPMB pour solidifier l&#39;adhésif. Enlever l&#39;excédent de solidifié agarose en utilisant une lame de rasoir. </li></ol></li><li> Montage de la moelle épinière sur la platine du microscope <ol><li> Appliquez de la gelée de pétrole au fond de la lamelle. Ce sera de stabiliser la préparation pendant la perfusion. </li><li> Placer la préparation de la moelle épinière dans unImagerie bien sur la scène microscope avec la face ventrale vers le haut vers l&#39;objectif de trempage 25X. L&#39;imagerie bien construit sur mesure est d&#39;environ 20 mm de profondeur, 50 mm de long et 50 mm de diamètre. </li><li> Image tout superfusing la préparation avec réchauffé (37 ° C), oxygéné (95: 5 l&#39;oxygène: dioxyde de carbone carbogène) milieu RPMI-1640 sans sérum. <ol><li> Médias Préchauffer à 37 ° C dans le bain d&#39;eau et connectez-le à la pompe à tube en insérant le tube dans la bouteille de médias. </li><li> Maintenir la température du fluide à 37 ° C, un dispositif de chauffage au niveau du raccordement de la tubulure à la chambre. Médias à travers Superfuse bien à 3 ml / min en utilisant un tube relié à la pompe à tube (figure 1B). </li></ol></li></ol></li></ol> 3. 2P imagerie de la moelle épinière ventrale <ol><li> Configuration de Microscope <ol><li> Acquérir des images à partir Thy1-EYFP la moelle épinière à l&#39;aide d&#39;un Ultra Chameleon Ti: Saphir laser réglé à 900 nm. Atténuer la puissance du laser à laspécimen à &lt;5% pour assurer un minimum de 16 phototoxicité. Maintenir la température de l&#39;oxygène en perfusant perfusé RPMI-1640 à une température constante de 37 ° C en utilisant un seul dispositif de chauffage de la solution en ligne pour assurer l&#39;imagerie stable, et pour empêcher la dérive des tissus et des dommages cellulaires. </li><li> Pour séparer eGFP et EYFP signal fluorescent, placer un dichroïque 520 nm bord unique et un nm bord unique diviseur 560 de faisceau dichroïque en série pour séparer 2P émission dans trois canaux, diviser volontairement l&#39;émission verte pour améliorer la visibilité. NOTE: Ce canal sont appelés bleu-vert (émission &lt;520 nm), vert-jaune (520-560 nm) et rouge (émission&gt; 560 nm). tubes photomultiplicateurs détectent la lumière émise dans chaque canal. </li></ol></li><li> Localiser les zones d&#39;imagerie d&#39;intérêt <ol><li> Utilisation de l&#39;oculaire et une source lumineuse de la lumière de champ, se concentrer l&#39;objectif de trempage à la partie ventrale de la moelle épinière pour définir un point de référence. </li><li> Assurez-vous que la source de lumière ambiante est éteint et swdémangeaison de 2P excitation en ouvrant l&#39;obturateur laser. </li><li> Si possible, lors de la recherche de tissus pour les zones d&#39;intérêt, utilisez un cadre de résolution inférieure, le volume plus élevé sans zoom numérique, et le taux de balayage plus élevé que lors de l&#39;acquisition des images finales. Paramètres typiques avec ce système lors de la recherche de tissus pour une région d&#39;intérêt sont: la résolution: 256 pixels; volume: x = 600 um, y = 600 um, z = 0 à 300 um. </li><li> Respecter les axones EYFP près du bord ventral de la moelle épinière. Signal de second harmonique à partir de collagène (bleu) sera plus brillante au bord de la moelle tissu de la moelle. Situez les axones EYFP juste dorsale au second signal harmonique à partir du collagène et le signal est EYFP visualisées dans le canal vert-jaune. </li><li> Localiser le site de transplantation dans le centre longitudinal de la préparation de la moelle épinière 14. Pour les souris un jour suivant la transplantation eGFP-NPC, localiser le site de transplantation en se concentrant la trajectoire du faisceau dans le plan z profondément dans les tissus. Le site de transplantation will varier légèrement entre les animaux mais il est généralement situé ~ 200 um du bord ventral. Respecter les grappes de eGFP-PNJ dans les secteurs de la substance blanche, plus proche des bords ventrales et latérales chez la souris après une jours post-transplantation. </li></ol></li><li> Acquisition d&#39;images finales <ol><li> Acquérir une résolution d&#39;image de 512 pixels; volume: x = 270 um, y = 212 um, et z = 100 um logiciel à l&#39;aide Slidebook 6. Compiler z-piles par l&#39;acquisition de plans focaux séquentiels dans 2,5 um incréments. </li><li> Effectuez un balayage entrelacé bidirectionnelle avec bon décalage pour assurer une quantification rapide de tous les objets qui migrent dans la moelle épinière. Assurez-vous que le taux idéal de trame d&#39;acquisition pour déterminer la vitesse cellulaire dans la moelle épinière est d&#39;environ 1 image / sec. REMARQUE: Les paramètres d&#39;imagerie peuvent être changés pour les préférences des utilisateurs individuels, tels que la cadence d&#39;acquisition, la résolution de l&#39;imagerie et des volumes d&#39;imagerie. Volumes d&#39;imagerie plus grands prendront généralement plus de temps à acquérir à un GIVen résolution. </li><li> Analyser, cultures, lisse et pseudocolor fichiers image Slidebook avec le logiciel d&#39;analyse d&#39;image tels que Bitplane Imaris 7,7. Produire finales vidéos time-lapse en peignant volumes d&#39;imagerie consécutifs à l&#39;aide d&#39;un processus automatisé dans Slidebook et Imaris. </li></ol></li></ol>

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Les auteurs n’ont pas d’intérêts concurrents.

En temps réel 2P imagerie du tissu intact est nécessaire pour enquêter sur la cinétique et interactions NPC après la transplantation dans la moelle épinière de souris démyélinisée. Imagerie intravitale 2P est couramment utilisé pour déterminer la dynamique cellulaire sur la face dorsale de la moelle épinière chez les souris vivant, et a été utilisé pour étudier dorsale démyélinisation maladie démyélinisante 17-19. Toutefois, en raison des PNJ transplantées migrent à la matière blanche ventrale, qui se trouve ...

Des modèles murins de démyélinisation, y compris l&#39;encéphalomyélite auto-immune expérimentale (EAE) et l&#39;infection par le virus intracrânienne neuroadapted de l&#39;hépatite de la souris (MHV), sont d&#39;excellents outils pour étudier les voies moléculaires et interactions cellulaires associés à la maladie. Ils ont mené et soutenu l&#39;efficacité des thérapies pharmaceutiques approuvé par la FDA, ciblant principalement la cessation de l&#39;auto-immunité et l&#39;inflammation 1. Cependant, une fois la remyélinisation endogène a échoué, les thérapies actuellement approuvés ne réparent pas efficacement les lésions démyélinisées dans le système nerveux central. Par conséquent, les thérapies de réparation axé à ce stade de la maladie sont décisifs pour le soulagement des symptômes chroniques et l&#39;amélioration de la qualité de vie. Récemment, des cellules précurseurs neurales (PNJ) sont venus à l&#39;avant-garde comme une modalité thérapeutique régénérative potentiel pour cibler des zones d&#39;inflammation et de démyélinisation. Plusieurs études ont mis en évidence la capacité des PNJ pour induire endógenonous remyélinisation et participer directement à la remyélinisation 2-8. Parce que les PNJ sont impliqués dans la remyélinisation directe, il est impératif de comprendre leur cinétique et les interactions avec des cellules endogènes après la transplantation. Après la transplantation, NPC migrent ventralement à des zones de blanc atteinte de la substance, puis rostrale et caudale par rapport au site de transplantation 5,9. La cinétique de la migration diffèrent en réponse aux signaux environnementaux; NPCs transplantées dans la moelle épinière non endommagés ont de plus grandes vitesses que PNJ transplantées dans la moelle épinière endommagée 6. Après une période de migration, transférés PNJ prolifèrent abondamment, à un taux supérieur dans une moelle épinière endommagée par rapport à une moelle épinière intacte 6. Enfin, la majorité des PNJ se différencier en oligodendrocytes et initier 4,6,9 de la remyélinisation directe. La lésion démyélinisée est complexe et peut comprendre une population diverse de cellules à divers stades d&#39;unctivation. Par exemple, une lésion active la sclérose en plaques (MS) peut comprendre une importante population de cellules T activées, la microglie et des macrophages M1 M1, mais une lésion chronique silencieux MS peut être composée essentiellement d&#39;astrocytes réactifs avec quelques cellules inflammatoires 10-13. En raison de la diversité des cellules effectrices, à deux photons (2P) imagerie dans des modèles murins de démyélinisation est un outil extrêmement utile pour aider à comprendre les interactions cellulaires locales au sein de la lésion. Dans la SEP et de nombreux modèles de recherche de MS largement utilisées, la majorité des lésions sont situées sur la face ventrale de la moelle épinière, une région inaccessible à l&#39;imagerie intravitale 2P en raison de la profondeur de la lésion et la forte teneur en lipides de la moelle épinière. Pour contourner ces problèmes et interactions étude cellule-cellule au sein de lésions long de la moelle épinière ventrale nous avons développé simple vivo 2P préparation d&#39;imagerie 6 ex. Cette étude fait suite à une précédente publication méthodes, qui a montréla procédure de transplantation protéine fluorescente verte améliorée (eGFP) PNJ dites-vous dans la moelle épinière de souris après souche JHMV de démyélinisation MHV-induite 14. Souris âgées de cinq semaines sont infectées par JHMV et transplantées avec eGFP-PNJ au niveau thoracique 9 sur 14 jours post-infection. Le protocole présenté ici fournit des instructions détaillées sur la façon d&#39;extraire la moelle épinière, faire une préparation ex vivo agarose et image transplanté interactions eGFP-NPC avec la protéine fluorescente jaune améliorée (EYFP) des axones dites-vous. Les souris exprimant sous la EYFP Thy1 promoteur spécifique de neurones ont été utilisés dans cette procédure 15. Seuls quelques-uns des axones exprimer EYFP, le rendant utile pour l&#39;imagerie axones individuels. Ici, nous montrons la moelle épinière prélevés à sept jours post-transplantation; Toutefois, la moelle épinière peuvent être extraites à tout point de temps après la transplantation. Bien que nous montrons interactions avec des PNJ axones endommagés, notre protocole peut être utilisé en combinaison avec des marqueurs fluorescents génétiquesd&#39;autres types de cellules à examiner une multitude d&#39;interactions cellulaires qui se produisent tout au long de la moelle épinière de souris.

<table><tbody><tr><td>Isoflurane, USP</td><td>Piramal Critical Care, Inc</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Ciseaux fins</td><td>Outils de science fine</td><td>14060-09</td> lame de scalpel <td>tranchante</td></tr><tr><td>#10</td><td>Outils de science fine</td><td>10010-00</td><td></td></tr><tr><td>manche de scalpel</td><td>Outils de science fine</td><td>10003-12</td><td></td></tr><tr><td>Luer rongeurs</td><td>Outils de science fine</td><td>16001-15</td><td></td></tr><tr><td>Graefe pince</td><td>Fine Science Tools</td><td>11052-10</td><td></td></tr><tr><td>Ciseaux Vannas</td><td>Fine Science Tools</td><td>15615-08</td><td></td></tr><tr><td>lame de scalpel #11</td><td>Fine Science Tools</td><td>10011-00</td><td></td></tr><tr><td>RPMI-1640</td><td>Gibco</td><td>12-115F</td><td></td></tr><tr><td>agarose, basse température de gélification</td><td>Sigma</td><td>A9414-25G</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-374-12</td><td></td></tr><tr><td>Vetbond (adhésif tissu)</td><td>3M</td><td>1469SB</td><td></td></tr><tr><td>22 mm Lentille de recouvrement carrée</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-547</td><td></td></tr><tr><td>Objectif plongeur 25X, 1.1 NA</td><td>Nikon</td><td>CFI Apo LWD 25XW</td><td></td></tr><tr><td>Réchauffeur de solution unique en ligne</td><td>Warner Instruments</td><td>64-0102</td><td></td></tr><tr><td>520 nm Séparateur de faisceau dichroïque à un bord</td><td>Semrock</td><td>FF520-Di02-25x36</td><td></td></tr><tr><td>Brightline 560 nm séparateur de faisceau dichroïque à un seul bord</td><td>Semrock</td><td>FF560-FDi01-25x36</td><td>Tubes</td></tr><tr><td>photomultiplicateurs</td><td>Brightline Hamamatsu</td><td>R928</td><td></td></tr><tr><td>C/L pompe à tube à vitesse variable</td><td>Masterflex</td><td>77122-22</td><td></td></tr><tr><td>Thermomètre numérique</td><td>Comar Instruments</td><td>3501</td><td></td></tr><tr><td>Chameleon Ultra Ti :Sapphire laser&nbsp ;</td><td>Cohérent</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Slidebook 6 logiciel</td><td>3i</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Imaris 7.7 logiciel</td><td>Bitplane</td><td>N/A</td><td></td></tr></tbody></table>

deux photons imaging of cellular dynamics dans la moelle épinière de souris

Two-photon Imaging of Cellular Dynamics in the Mouse Spinal Cord

La microscopie à deux photons (2P) est utilisée pour révéler la dynamique cellulaire et les interactions profondes dans les tissus vivants et intacts. Ici, nous présentons une méthode d’imagerie de cellules vivantes dans la moelle épinière murine. Cette technique est particulièrement adaptée pour analyser la dynamique des cellules précurseurs neurales (NPC) après une transplantation dans la moelle épinière souffrant de troubles démyélinisants neuro-inflammatoires. Les NPC migrent vers les sites de lésions axonales, prolifèrent, se différencient en oligodendrocytes et participent à la remyélinisation directe. Les NPC constituent donc un traitement thérapeutique prometteur pour améliorer les maladies démyélinisantes chroniques. Étant donné que les NPC transplantés migrent vers les zones endommagées de la face ventrale de la moelle épinière, l’imagerie intravitale 2P traditionnelle est impossible, et seules les informations sur les interactions statiques étaient auparavant disponibles en utilisant les approches de coloration histochimique. Bien que cette méthode ait été générée pour imager des NPC transplantés dans la moelle épinière ventrale, elle peut être appliquée à de nombreuses études de cellules transplantées et endogènes dans toute la moelle épinière. Dans cet article, nous démontrons la préparation et l’imagerie d’une moelle épinière avec des axones exprimant des protéines fluorescentes jaunes améliorées et des NPC transplantés exprimant des protéines fluorescentes vertes améliorées.

<html> Alors que le protocole d&#39;imagerie de la moelle épinière explantées peut être utilisé pour visualiser ne importe quel fluorescence de la moelle épinière, nos résultats démontrent représentatifs interactions avec eGFP-NPC-EYFP axones. Premièrement, nous montrons la préparation de la moelle épinière ventrale intégré à la figure 1A. Ensuite, on montre la configuration 2P du microscope et des éléments clés sur la figure 1B. La figure 2 illustre la fluorescence EGFP et l&#39;EYFP da...

Une nouvelle préparation ex vivo pour l&#39;imagerie de la moelle épinière de souris. Ce protocole permet l&#39;imagerie à deux photons d&#39;interactions cellulaires vivants tout au long de la moelle épinière.

Deux photons Imaging of Cellular Dynamics dans la moelle épinière de souris

Two-photon (2P) microscopy is utilized to reveal cellular dynamics and interactions deep within living, intact tissues. Here, we present a method for ...

L'objectif général de l'expérience suivante est d'observer en temps réel les interactions entre des cellules souches neurales transplantées, ou CSN, marquées par fluorescence, et des axones fluorescents dans la moelle épinière de souris. Cette observation est réalisée en retirant soigneusement la moelle épinière de souris ayant reçu une greffe de CSN, en l'incorporant dans 5 % aros, puis en la fixant sur un lamelle. L'orientation de la moelle épinière peut être modifiée afin de visualiser la fluorescence dans n'importe quelle région de celle-ci.Dans la deuxième étape, la préparation de la moelle épinière est placée sur la platine d'imagerie à deux photons pour l'observation des CPN viables tout en étant perfusée avec un milieu RPMI chaud et oxygéné pendant jusqu'à 10 heures. Un séparateur de faisceau diic à bord unique approprié est utilisé pour séparer les émissions de YFP et de GFP. En fin de compte, l'imagerie à deux photons permet de visualiser en temps réel les interactions entre les CPN exprimant GFP et les axones exprimant YFP dans la moelle épinière lésée.Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la neurogénération, telles que quelles sont les signaux moléculaires et cellulaires nécessaires à la remyélinisation par des NPCs transplantés des axones lésés, et quelle est la cinétique de ces événements de remyélinisation ? Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes, comme l'imagerie biphotonique intertidale, qui ne peut être utilisée que pour imager la moelle épinière dorsale, est qu'elle permet d'observer des NPCs transplantés ayant migré profondément dans la région ventrale de la moelle épinière. Après avoir confirmé l'euthanasie par transection rachidienne, humidifiez la souris avec de l'éthanol à 70 %, puis utilisez des ciseaux fins et tranchants pour retirer les poils et la peau du dos de l'animal, exposant ainsi la colonne vertébrale depuis environ la lame cervicale un ou C un jusqu'à la lame sacrée quatre ou S quatre.Ensuite, à l’aide d’un scalpel équipé d’une lame n°10, pratiquez des incisions à gauche et à droite de la colonne vertébrale afin de la séparer du muscle et du tissu adipeux environnants, et retirez également les tissus excédentaires situés autour et au-dessus de la colonne vertébrale. Cela facilitera l’extraction des vertèbres. Puis, tout en maintenant le sommet des vertèbres rachidiennes avec une pince hémostatique grise à mâchoires cannelées, insérez des ciseaux courbes en titane, côté courbe vers le haut, dans la colonne vertébrale exposée au niveau de C1, en prenant soin de ne pas toucher la moelle épinière.Faites glisser les ciseaux complètement vers la droite et effectuez une petite incision. Un léger craquement doit être entendu et ressenti lorsque les ciseaux coupent les vertèbres. Répétez cette incision du côté le plus à gauche de la moelle, en prenant soin de ne pas travailler trop rapidement ni de faire une incision trop large, car cela risquerait d'endommager la moelle.Une fois les côtés des vertèbres découpés, la lame unique devrait pouvoir être soulevée à l’aide de la pince. Répéter les incisions gauche et droite pour chaque lame jusqu’à atteindre S4. Continuer à maintenir et tirer en arrière les vertèbres de la moelle épinière.Les vertèbres situées au-dessus de la greffe pourraient se détacher une fois que la colonne vertébrale aura été sectionnée jusqu'au site de greffe. Une fois que les vertèbres auront été sectionnées jusqu'à S4, disposez les vertèbres pour visualiser l'emplacement du site de greffe, puis effectuez une incision d'environ 20 millimètres en direction rostrale et caudale par rapport au site de greffe. Utilisez maintenant un scalpel muni d'une lame n°11 pour couper soigneusement les ganglions situés à droite et à gauche de la face ventrale de la moelle épinière, en partant de l'extrémité rostrale.Ensuite, retournez l'animal et tenez-le de manière à ce que la moelle épinière soit orientée vers le bas, puis utilisez une pince hémostatique cannelée pour extraire délicatement la moelle épinière à partir de l'extrémité coddle. Sans entailler la moelle épinière, coupez soigneusement les ganglions résiduels afin de pouvoir soulever la moelle épinière en un seul morceau intact, puis placez le cordon dans un milieu placé sur de la glace pour préparer la moelle épinière à l'imagerie. Transférez le tissu nerveux sur une feuille de parafilm, avec la face ventrale orientée vers le haut.Ensuite, pipeter environ cinq millilitres d'une solution d'agarose fraîchement préparée à 37 degrés Celsius, 5 % au-dessus du cordon, et laisser durcir à température ambiante. Après environ cinq minutes, appliquer une fine couche d'adhésif tissulaire sur un coverslip carré de 22 millimètres et retourner le cordon spinal, côté ventral vers le bas, sur un nouveau morceau de perfil. Fixer le coverslip au côté dorsal exposé et plonger l'ensemble de la préparation dans un milieu frais afin de solidifier l'adhésif.Ensuite, utilisez une lame de rasoir pour retirer l'excès d'agarose solidifiée. Insérez ensuite le tube raccordé à la pompe péristaltique dans une bouteille de milieu, maintenue dans un bain-marie à 37 degrés Celsius afin de la réchauffer. Faites circuler le milieu préchauffé à travers un puits d'imagerie sur mesure placé sur la platine du microscope, à un débit de trois millilitres par minute.Placez ensuite la préparation de la moelle épinière dans la cavité avec le côté ventral orienté vers le haut, en direction de l'objectif d'immersion 25 x. Pour observer la moelle épinière ventrale par microscopie à deux photons, utilisez un laser au saphir ultrarapide réglé à 900 nanomètres, en atténuant la puissance du laser au niveau de l'échantillon à moins de 5 % afin de garantir une phototoxicité minimale. Puis, à l’aide de l’oculaire et d’une source de lumière en champ clair, focalisez l’objectif d’immersion sur le bord ventral de la moelle épinière.Pour définir un point de référence, assurez-vous que la source de lumière ambiante est éteinte. Ouvrez ensuite l'obturateur laser pour activer les deux citations photoniques, si disponibles. Lors de la recherche dans le tissu de zones d'intérêt, utilisez un réglage de résolution plus faible, un volume plus élevé sans zoom numérique et une fréquence de balayage plus élevée que lors de l'acquisition des images finales.Pour repérer les cellules, il est préférable de se focaliser sur l'échantillon en éclairage en champ clair au niveau du bord du tissu, d'abord au site de greffe, puis de passer en fluorescence. Un grand champ en X et Y avec une faible résolution peut ensuite être utilisé afin de visualiser rapidement une vaste zone tout en déplaçant le plan de mise au point plus profondément dans le tissu. Observer les axones EYFP près du bord ventral de la moelle épinière.Le signal de seconde harmonique provenant du collagène, observé ici en bleu, sera le plus intense au niveau du bord du tissu de la moelle épinière. Utilisez maintenant un logiciel d'acquisition d'images approprié pour acquérir les images finales à plus haute résolution selon des plans focaux séquentiels par incréments de 2,5 micromètres, afin de constituer des empilements en Z. Dans cette représentation, les NPCs GFP sont observées en bleu et les axones YFP endommagés apparaissent en jaune ; une coloration pseudo-colorée peut être effectuée ultérieurement à l’aide d’un logiciel de retouche. Effectuez ensuite une numérisation bidirectionnelle avec le décalage d’interlacement approprié pour assurer une quantification rapide de tout objet migrant dans la moelle épinière, en veillant à régler la fréquence idéale d’acquisition pour déterminer la vitesse cellulaire dans la moelle épinière à environ 1,7 image par seconde.Enfin, analysez les images en ajustant le lissage et en appliquant une coloration pseudo-couleur à l’aide du logiciel approprié, puis utilisez les processus automatisés pour parcourir les volumes d’imagerie consécutifs afin de produire les vidéos finales en accéléré. Bien que ce protocole d’imagerie de la moelle épinière explantée puisse être utilisé pour visualiser toute fluorescence au sein de la moelle épinière, ces images illustrent des interactions représentatives entre des cellules souches neurales exprimant EGFP et des axones exprimant EYFP dans un seul empilement Z de la moelle épinière ventrale. L’acquisition d’empilements Z consécutifs peut ensuite être regroupée pour produire des vidéos en accéléré permettant d’analyser la dynamique cellulaire en temps réel au sein du tissu intact.En effet, l'utilisation d'un dichroïque à bord unique de 520 nanomètres et d'un séparateur de faisceau dichroïque à bord unique de 560 nanomètres permet de séparer les signaux d'EGFP et d'EYFP, autorisant une coloration pseudo-couleur des canaux individuels en vert et en jaune à l'aide du logiciel d'imagerie, comme illustré ici. Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de veiller à retirer correctement la moelle épinière de la souris sans étirement excessif, compression ou coupure accidentelle du tissu nerveux. Grâce à cette méthode, toute combinaison de cellules ou d'axones marqués par fluorescence peut être observée en temps réel afin de répondre à d'autres questions, notamment quelles sont les cinétiques de migration ou de remyélinisation sous divers traitements médicamenteux ou conditions expérimentales.

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Un protocole minimalement invasive pour stabiliser la colonne vertébrale de souris et d'effectuer...

Dans l&#39;imagerie in vivo de la moelle épinière de souris utilisant microscopie à deux photons

Source : Maruoka, H., et. al.  Imagerie simultanée de la dynamique microgliale et de l’activité neuronale chez les souris éveillées. J. vis. exp..  (2022) Cette vidéo montre une procédure de microscopie à deux photons pour imager l’activité neuronale et la dynamique microgliale chez une souris éveillée pendant une stimulation visuelle, en mettant en évidence les transitoires calciques et les interactions cellulaires.

Imagerie simultanée de la dynamique microgliale et de l’activité neuronale chez une souris éveillée

L’imagerie en accéléré chez l’animal vivant fournit des informations précieuses sur la réorganisation structurelle du cerveau intact. Ici, nous introduisons une préparation de crâne aminci qui permet l’imagerie transcrânienne de structures synaptiques marquées par fluorescence dans le cortex de souris vivantes par microscopie à deux photons.

Deux-Photon<em&gt; In vivo</em&gt; Imagerie des épines dendritiques dans le cortex de souris utilisant un crâne-Diluée Préparation

Dans cette vidéo, nous décrivons une procédure pour l'implantation d'une chambre d'imagerie optique chronique sur la moelle épinière dorsale d'une souris vivante. La chambre, la procédure chirurgicale, et l'imagerie chronique sont examinées et démontrées.

Une procédure pour l'implantation d'une chambre pour la colonne vertébrale longitudinale In Vivo Imagerie du cordon spinal de souris

L’imagerie intravitale à deux photons peut être utilisée pour étudier les interactions entre différents types de cellules de la moelle épinière dans leur environnement tissulaire natif chez un animal chimérique de moelle osseuse présentant une lésion traumatique par écrasement de la moelle épinière de la colonne dorsale.

Imagerie intravitale de axonales Interactions avec microglie et les macrophages de souris dans une colonne dorsale Crush blessures

Nous introduisons une in vivo utilisant deux fluorochromes différents pour suivre la dynamiques changements vasculaires de la colonne vertébrale suite à une contusion médullaire chez les rats Sprague-Dawley adultes de méthode d’imagerie.

Un In Vivo Duo-color méthode d’imagerie vasculaire dynamique après contusion médullaire

Ce protocole décrit l'implantation d'une fenêtre en verre sur la moelle épinière d'une souris pour faciliter la visualisation par microscopie intravitale.

Laminectomy et implantation de fenêtre de moelle épinière dans la souris

Cette méthode décrit une préparation chronique qui permet un accès optique à l'hippocampe de souris vivantes. Cette préparation peut être utilisée pour effectuer l'imagerie optique longitudinale de la plasticité structurale neuronale et de la plasticité cellulaire suscitée par l'activité sur une période de plusieurs semaines.

Imagerie longitudinale à deux photons de l'hippocampe dorsal CA1 chez les souris vivantes

La microscopie à diffusion Raman stimulée (SRS) permet une imagerie sans étiquette des biomolécules en fonction de leur vibration intrinsèque de liaisons chimiques spécifiques. Dans ce protocole, la configuration instrumentale d’un SRS intégré et d’un microscope à fluorescence à deux photons est décrite pour visualiser les structures cellulaires dans la moelle épinière de souris vivantes.

In vivo Imagerie de tissus biologiques avec fluorescence combinée à deux photons et microscopie à diffusion Raman stimulée

Ici, nous décrivons un protocole combinant l’injection de virus adéno-associés avec l’implantation de fenêtres crâniennes pour l’imagerie simultanée de la dynamique microgliale et de l’activité neuronale chez la souris éveillée.

Imagerie simultanée de la dynamique microgliale et de l’activité neuronale chez des souris éveillées

Apprenez l'imagerie à deux photons des cellules souches neurales transplantées et des axones dans la moelle épinière de souris ex vivo. Cette méthode permet l'observation en temps réel des interactions cellulaires pendant dix heures.

Deux photons Imaging of Cellular Dynamics dans la moelle épinière de souris

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