Deux photons Imaging of Cellular Dynamics dans la moelle épinière de souris

L’objectif général de l’expérience suivante est d’imager en temps réel les interactions des cellules précurseurs neurales transplantées par fluorescence ou des NPC avec les axones fluorescents de la moelle épinière de la souris. Ceci est réalisé en retirant et en intégrant soigneusement la moelle épinière de souris transplantées avec des NPC dans 5 %aros et en l’attachant à une lamelle. L’orientation de la moelle épinière peut être modifiée pour voir la fluorescence dans n’importe quelle région de la moelle épinière.

Dans la deuxième étape, la préparation de la moelle épinière est placée sur la platine d’imagerie à deux photons pour l’imagerie de NPC viables tout en étant super fusionnée avec un média RPMI chaud et oxygéné jusqu’à 10 heures. Un séparateur de faisceau diique à bord unique approprié est utilisé pour séparer les émissions YFP et GFP. En fin de compte, l’imagerie à deux photons permet de visualiser en temps réel les interactions entre les NPC exprimant la GFP et les axones exprimant la YFP dans la moelle épinière endommagée.

Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la neurogénération, telles que quels sont les signaux de signalisation moléculaires et cellulaires nécessaires à la remyélinisation des axones endommagés par NPC transplantés, et quelle est la cinétique de ces événements de remyélinisation ? Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes telles que l’imagerie intertidale à deux photons, qui ne peut être utilisée que pour imager la moelle épinière dorsale, est que cette méthode permet d’imager des NPC transplantés qui ont migré profondément dans la région ventrale de la moelle épinière. Après avoir confirmé l’euthanasie par transection vertébrale, mouillez la souris avec de l’éthanol à 70 %, puis utilisez des ciseaux fins et tranchants pour enlever les poils et la peau du dos de l’animal, exposant la colonne vertébrale d’environ la lame cervicale un ou C à la lame sacrée quatre ou S quatre.

Ensuite, à l’aide d’un scalpel avec une lame numéro 10, faites des incisions à gauche et à droite de la colonne vertébrale pour la séparer des tissus musculaires et adipeux environnants, coupez également l’excès de tissu autour et au-dessus de la colonne vertébrale. Cela permettra d’enlever plus facilement les vertèbres. Ensuite, tout en tenant le haut des vertèbres vertébrales avec une pince grise dentelée, insérez des ciseaux de fourgonnette incurvés en titane avec le côté incurvé vers le haut dans la colonne vertébrale exposée en C un, en prenant soin de ne pas toucher la moelle épinière.

Faites glisser les ciseaux tout à fait vers la droite et faites une petite coupe. Un petit craquement doit être entendu et ressenti lorsque les ciseaux coupent les vertèbres. Répétez cette coupe sur le côté gauche du cordon en prenant soin de ne pas travailler trop rapidement ou de faire une coupe trop importante, car cela risquerait d’endommager le cordon.

Une fois les côtés des vertèbres coupés, la lamelle unique doit pouvoir être soulevée avec la pince. Répétez les coupes à gauche et à droite pour chaque lame jusqu’à ce que S quatre soit atteint. Continuer à tenir et à tirer vers l’arrière les vertèbres de la moelle épinière.

Les vertèbres au-dessus de la greffe peuvent se détacher une fois que sa colonne vertébrale est coupée jusqu’au site de greffe. Une fois que les vertèbres sont coupées à S quatre, posez les vertèbres pour aider à visualiser où se trouve le site de transplantation et coupez environ 20 millimètres rostral et dorlotez jusqu’au site de transplantation. Utilisez maintenant un scalpel avec une lame numéro 11 pour couper soigneusement les ganglions à droite et à gauche de la face ventrale de la moelle épinière, en commençant par l’extrémité rostrale.

Ensuite, retournez et tenez l’animal vers le haut de manière à ce que la moelle épinière soit tournée vers le bas et utilisez des pinces funéraires dentelées fermées pour décoller soigneusement la moelle épinière de l’extrémité du codage. Ensuite, sans entailler la moelle épinière, coupez soigneusement les ganglions restants pour permettre à la moelle épinière d’être soulevée en un seul morceau intact, et placez la moelle dans un milieu sur de la glace pour préparer la moelle épinière pour l’imagerie. Transférez le tissu nerveux sur une feuille de param avec la face ventrale vers le haut.

Ensuite, pipetez environ cinq millilitres de solution agricole fraîchement préparée à 37 degrés Celsius, 5 % sur le cordon et laissez-le se solidifier à température ambiante. Après environ cinq minutes, appliquez une légère couche d’adhésif tissulaire sur une lamelle de 22 millimètres carrés et inversez la moelle épinière encastrée côté ventral vers le bas sur un nouveau morceau de perfil. Collez la lamelle sur la face dorsale exposée et immergez toute la préparation dans un milieu frais pour solidifier l’adhésif.

Ensuite, utilisez une lame de rasoir pour enlever l’excès d’aga rose solidifié. Ensuite, insérez le tube connecté à la pompe de tube dans une bouteille de média, conservée dans un bain-marie pour super fusionner 37 degrés Celsius. Milieu assez réchauffé grâce à un puits d’imagerie construit sur mesure sur la platine du microscope à trois millilitres par minute.

Placez ensuite la préparation de la moelle épinière dans le puits avec la face ventrale vers le haut vers l’objectif de trempage 25 x. Pour imager la moelle épinière ventrale par microscopie à deux photons, utilisez un laser saphir ultra-titane réglé à 900 nanomètres avec une puissance laser atténuée à moins de 5 % pour assurer une phototoxicité minimale. Ensuite, à l’aide de l’oculaire et d’une source lumineuse à champ vif, focalisez l’objectif plongeant sur le bord ventral de la moelle épinière.

Pour définir un point de référence, assurez-vous que la source de lumière ambiante est éteinte. Ouvrez ensuite l’obturateur laser pour basculer les deux citations photoniques si disponibles. Lorsque vous recherchez des zones d’intérêt dans le tissu, utilisez un réglage de résolution plus faible, un volume plus élevé sans zoom numérique et une fréquence de balayage plus élevée que lors de l’acquisition des images finales.

Pour trouver les cellules, il est préférable de se concentrer sur l’échantillon sous un éclairage en fond clair au bord du tissu, d’abord au site de greffe, puis de passer à la fluorescence. Un grand champ X et Y avec une faible résolution peut alors être utilisé pour permettre la visualisation rapide d’une grande zone lorsque la mise au point se déplace plus profondément dans le tissu. Observez les axones de l’EYFP près du bord ventral de la moelle épinière.

Le deuxième signal harmonique du collagène observé ici en bleu sera le plus brillant au bord du tissu de la moelle épinière. Maintenant, utilisez le logiciel de capture d’image approprié pour acquérir les images finales de plus haute résolution dans des plans focaux séquentiels par incréments de 2,5 microns afin de compiler des piles Z. Dans cette représentation, les NPC GFP sont observés comme bleus et les axones YFP endommagés sont observés comme jaunes, la pseudo-coloration peut être effectuée plus tard à l’aide d’un logiciel d’édition, puis effectuer un balayage bidirectionnel avec le décalage d’intercalaire approprié pour assurer la quantification rapide de tout objet migrant dans la moelle épinière, garantissant que la fréquence d’images d’acquisition idéale pour déterminer la vitesse cellulaire dans la moelle épinière est réglée à environ 1,7 images par seconde.

Enfin, analysez le recadrage, le lissage et la pseudo-coloration des fichiers image avec le logiciel approprié, et utilisez les processus automatisés pour passer au peigne fin les volumes d’imagerie consécutifs afin de produire les vidéos finales en accéléré. Bien que ce protocole d’imagerie de la moelle épinière explantée puisse être utilisé pour visualiser n’importe quelle fluorescence dans la moelle épinière, ces images démontrent des interactions représentatives des cellules précurseurs neurales de l’EGFP avec les axones de l’EYFP dans un seul empilement Z au sein de la moelle épinière ventrale. L’acquisition de Zacks consécutifs peut ensuite être compilée pour produire des vidéos en accéléré afin d’analyser la dynamique cellulaire en temps réel dans le tissu intact.

En effet, l’utilisation d’un séparateur de faisceau dichroïque à bord unique de 520 nanomètres et d’un séparateur de faisceau dichroïque à bord unique de 560 nanomètres peut séparer les signaux EGFP et EYFP, permettant une pseudo-coloration des canaux individuels en vert et jaune avec le logiciel d’imagerie comme démontré ici, Lors de la tentative de cette procédure, il est important de se rappeler de s’assurer du retrait correct de la moelle épinière de la souris sans étirement excessif, compression, ou coupe accidentelle du tissu nerveux. Grâce à cette procédure, toute combinaison de cellules ou d’axones marqués par fluorescence peut être imagée en temps réel pour répondre à des questions supplémentaires, notamment quelle est la cinétique de migration ou de remyélinisation dans le cadre de divers traitements ou conditions médicamenteux.