Préparation de Suspensions de cellules uniques pour l'analyse cytofluorimétrie de différentes régions de la peau de souris

L'objectif général de cette procédure est de préparer une suspension monocellulaire à partir de la peau de souris afin d'identifier les différentes populations de cellules immunitaires résidentes par analyse cytofluorimétrique, pour identifier et isoler les diverses populations de cellules immunitaires résidentes dans la peau. Grâce à cette technique, les chercheurs peuvent facilement digérer les échantillons provenant de différentes régions de la peau de souris sans endommager les marqueurs de surface des cellules immunitaires d'intérêt.

Pour obtenir des échantillons de peau à partir de l'oreille de la souris, couper les parties sans poils des oreilles et utiliser une pince pour séparer les faces dorsale et ventrale des organes. Ensuite, racler doucement l'intérieur de l'oreille afin d'éliminer tout cartilage résiduel. Pour obtenir des échantillons de peau en morceaux, raser entièrement le poil de l'animal à l'aide d'une tondeuse, puis appliquer une lotion dépilatoire.

Après quelques minutes, essuyez soigneusement l'onguent et pratiquez une incision verticale au milieu du dos de la souris, en prolongeant la coupure le long des limites des zones rasées autour du corps de l'animal. À l’aide de pinces, maintenez la peau en place tout en séparant l’échantillon à l’aide des extrémités fermées et arrondies de ciseaux chirurgicaux ou d’un scalpel, puis détachez délicatement la peau du péritoine et des muscles du dos. Plongez ensuite la peau dans une plaque de culture cellulaire de 100 mm contenant 10 ml de PBS glacé, et utilisez les pinces pour gratter la graisse sous-cutanée.

Pour obtenir un échantillon de peau de queue, coupez la queue et utilisez des ciseaux chirurgicaux pour effectuer une incision verticale à partir de la base de la queue jusqu'au bout. À l'aide d'une pince, saisissez le bord de l'incision à la base de la queue, puis, en maintenant le corps de la queue avec une autre pince, tirez doucement la peau vers l'extrémité. Enlevez tout excès de graisse en grattant délicatement l'échantillon de peau.

Le pied de la souris est coupé, puis pour obtenir un échantillon de peau à partir de la plante du pied, utilisez des ciseaux chirurgicaux pour inciser longitudinalement la peau du pied depuis la cheville jusqu'au début des orteils, en prenant soin d'éviter de couper les poils. Ensuite, saisissez les os de la cheville avec une pince tout en attrapant la peau avec l'autre main, puis tirez la peau vers les orteils, comme lorsqu'on retire un gant. Pour marquer les cellules cutanées, transférez à tour de rôle chaque échantillon dans une boîte de Pétri de 35 millimètres contenant 2 millilitres de cocktail de digestion fraîchement préparé.

À l’aide de ciseaux, hacher l’échantillon en petits morceaux et incuber les fragments de tissu à 37 degrés Celsius pendant 90 minutes, en effectuant un à deux secouages doux durant la période d’incubation. Ensuite, verser le tissu cutané digéré sur un tamis cellulaire de 70 microns dans une boîte de Pétri de 66 millimètres contenant 1 millilitre de RPMI 1640 enrichi avec du FBS par boîte. Laver le tamis avec cinq millilitres de milieu frais, puis utiliser le piston d’une seringue pour faire passer les échantillons à travers le maillage du tamis.

Rincez le piston, le récipient et le tamis avec 20 millilitres de milieu frais et transférez la suspension tissulaire dans un tube conique de 50 millilitres. Une fois tous les échantillons traités, centrifugez les cellules et remettez en suspension les culots dans 100 microlitres par échantillon d'anticorps bloquant anti-CD16/CD32 à deux microgrammes par millilitre dans du PBS contenant 1 % de FBS. Après 15 minutes à quatre degrés Celsius, ajoutez 100 microlitres d'anticorps selon le tableau aux échantillons appropriés pendant 30 minutes à quatre degrés Celsius, à l'abri de la lumière.

À la fin de l'incubation, laver les cellules dans un millilitre de PBS contenant du FBS et re-suspendre les culots dans 300 microlitres de PBS avec FBS. Ensuite, marquer les cellules avec 2 microgrammes par millilitre de DAPI pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius, à l'abri de la lumière. Pour isoler les leucocytes, commencer par sélectionner la population positive au DAPI afin d'éliminer les cellules mortes.

Ensuite, sélectionnez les événements simples (singlets) dans un graphique de surface de dispersion directe par largeur de dispersion directe, puis délimitez les cellules selon leur taille et leur granularité, correspondant aux leucocytes d'intérêt. Ensuite, sélectionnez les cellules positives pour CD45, puis identifiez, pour chaque échantillon, les populations de cellules dendritiques cutanées selon leur expression de CD11C et de la molécule de classe II du CMH. Identifiez les macrophages par leur expression de CD64 et de F480, les cellules B par leur expression de CD19 et de la molécule de classe II du CMH, et les cellules T par leur expression de CD4 ou de CD8.

L'isolement des cellules immunitaires cutanées, tel que vient d'être démontré, permet d'obtenir une population composée de plus de 50 % de cellules viables provenant de toutes les régions de la peau, entre 5 000 et 15 000 par centimètre carré, dont les cellules positives pour CD45. Un nombre suffisant de cellules dendritiques, de macrophages, de cellules B et de cellules T peut également être obtenu pour une analyse en aval à partir d'un centimètre carré de peau de souris, comme indiqué. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment digérer un tissu cutané non inflammé et isoler les leucocytes pour une analyse par cytométrie en flux.