Name: Préparation de Suspensions de cellules uniques pour lanalyse cytofluorimétrie de différentes régions de la peau de souris (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-04-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 58 s
Description: Apprenez à préparer des suspensions de cellules uniques à partir de la peau de souris pour l'analyse cytofluorimétrique des populations de cellules immunitaires résidentes. Cette méthode préserve les marqueurs de surface pour une identification précise.

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Ce travail a été soutenu par des subventions de l’Associazione Italiana per la Ricerca sul Cancro (AIRC, IG14593, MFAG13235), de la Fondazione Cariplo (Grant 2010-0678 et NANOVAC) et de la Fondazione Regionale per la Ricerca Biomedica.

l&#39;approbation de l&#39;étude: Les protocoles expérimentaux ont été approuvés par le ministère italien de la santé (Rome, Italie) selon le décret législatif 27 gennaio 1992, n. 116 &quot;della Direttiva de attuazione n. 86/609 / CEE en materia di protezione degli animali utilizzati un fini Sperimentali o ad altri fini Scientifici.&quot; 1. Obtenir des échantillons de peau <ol><li> Euthanize la souris par dislocation cervicale. </li><li> Oreille: <ol><li> Découpez la partie glabre des oreilles de souris. </li><li> dorsale séparée et face ventrale en les tirant avec une pince. Retirez tous les cartilages restants en grattant doucement la partie intérieure des oreilles avec une pince. </li></ol></li><li> Trunk peau: <ol><li> Raser l&#39;ensemble de la peau de l&#39;animal à la fois avec un rasoir électrique et avec une lotion dépilatoire délicate. </li><li> Couper l&#39;échantillon de peau désirée (de 2 cm 2 à l&#39;ensemble de la peau des animaux). <ol><li> Si coupant l&#39;ensemble dorsale et êmela peau de la souris trale, faire une coupe verticale au milieu de la souris en arrière et puis couper le long des frontières des zones rasées autour du corps de la souris. </li><li> Séparez délicatement la peau du péritoine et les muscles du dos, en gardant l&#39;échantillon de peau encore avec la pince tout en séparant l&#39;échantillon de peau avec les pointes à bords arrondis fermés de ciseaux chirurgicaux ou un scalpel. </li></ol></li><li> Préparer une plaque de culture cellulaire de 100 mm contenant 10 ml de PBS glacé. </li><li> Éliminer la graisse sous-cutanée en immergeant l&#39;échantillon de peau dans du PBS dans la plaque préparée à l&#39;étape 1.3.3 et racler l&#39;échantillon de peau avec des pinces. </li></ol></li><li> Queue: <ol><li> Couper la queue de la souris. </li><li> Faire une coupe verticale sur la queue avec des ciseaux chirurgicaux ou d&#39;un scalpel chirurgical, à partir de la base de la queue et atteignant à la pointe de la queue. </li><li> Utilisez une pince pour détacher la peau de la queue. Prenez le bord de la coupe à la base de la queue et tirez doucement vers la pointe tout en maintenant lale corps de la queue avec une pince. </li><li> Retirez tout excès de graisse en grattant doucement l&#39;échantillon de peau. </li></ol></li><li> bandit <ol><li> Découpez le pied de la souris entière avec des ciseaux chirurgicaux. Éviter couper toute peau velue. </li><li> Couper la peau du pied longitudinal de la cheville au début des chiffres. </li><li> Tenir les os de la cheville avec une pince ou à la main tout en saisissant la peau avec une pince et tirer la peau vers les chiffres comme si le décollage d&#39;un gant. </li></ol></li></ol> 2. Digestion <ol><li> Préparer le cocktail de digestion de la solution mère (préparée comme dans la liste des matériaux) avec la recette suivante: Enzyme mix (voir la liste des matériaux pour les spécifications) 300 pg / ml, DNAse1 50 U / ml. Diluer dans RPMI 5% de FBS. </li><li> Hacher les échantillons de peau avec des ciseaux en petits morceaux dans un plat de 35 mm de Pétri avec 2 ml de cocktail Digestion (Pour la peau du tronc: 2 ml de cocktail de Digestion tous les 2 cm 2 de peau, jusqu&#39;à 3 ml au total). </li><li>Incuber à 37 ° C pendant 90 min. Secouer doucement la boîte de Pétri 1-2 fois pendant l&#39;incubation. </li><li> Verser les échantillons digérés de la peau sur un tamis de 70 um cellulaire dans 66 mm plat de Pétri contenant 1 ml de RPMI1640 5% de FBS. </li><li> Laver le filtre avec 5 ml de RPMI 1640 5% de FBS. </li><li> Presser l&#39;échantillon à travers le tamis cellulaire, avec un piston de seringue. </li><li> plongeur Flush, boîte de Pétri et la crépine avec 20 ml de RPMI1640 5% de FBS, transférer dans 50 ml tube. </li></ol> 3. Anticorps et étiquetage <ol><li> Laver la suspension obtenue deux fois avec 5 ml de PBS 1% de SFB (ou BSA). </li><li> L&#39;étiquette de la suspension cellulaire obtenue avec les anticorps désirés. <ol><li> Remettre en suspension les échantillons dans 100 ul / échantillon d&#39;un mélange contenant 2 pg / ml d&#39;aCD16 / CD32 (clone 2.4G2) dilué dans du PBS 1% de FBS. </li><li> Incuber pendant 15 min à 4 ° C afin de bloquer la liaison non spécifique des anticorps désirés par l&#39;intermédiaire des récepteurs Fc. </li><li> Ajouter les anticorps indiqués dans le Tableau1. <ol><li> Préparer un mélange en diluant les anticorps souhaités dans 100 ul / échantillon de PBS 1% de FBS à une concentration de 4 pg / ml. </li><li> Ajouter 100 ul du mélange préparé à l&#39;étape 3.2.3.1 à chaque échantillon de telle sorte que dans le tube, il y aura un volume de 200 ul d&#39;anticorps mélange à une concentration finale de 2 pg / ml. </li></ol></li><li> Incuber pendant 30 min à 4 ° C et couvrir de la lumière. </li></ol></li><li> Laver avec 1 ml de PBS 1% de FBS, centrifuger pendant 5 min à 400 g, éliminer le surnageant et remettre en suspension dans 300 pi de PBS 1% de FBS. </li><li> Ajouter DAPI à une concentration finale de 2 pg / ml et on incube à 4 ° C, à l&#39;abri de la lumière pendant 10 min. </li><li> Analyser les échantillons obtenus par FACS. <ol><li> Afin d&#39;isoler les leucocytes, utilisez la stratégie de déclenchement suivant: <ol><li> Tout d&#39;abord éliminer les cellules mortes par gating sur la population de DAPI-. </li><li> Sélectionnez singulets dans le FSC-A vs. FSC W parcelle tel qu&#39;indiqué dans la Figure 1 </strong&gt;. </li><li> Porte les cellules en fonction de la taille et de la granularité typique des leucocytes d&#39;intérêt. </li><li> Sélectionnez CD45 + cellules dans le FSC Une parcelle de CD45 comme indiqué sur la figure 1. </li></ol></li><li> La distinction entre les différentes populations de leucocytes par l&#39;expression de marqueurs de surface comme suit: <ol><li> Identifier les PED comme CD11c + cellules MHC II +. Ceux-ci peuvent être analysés plus tard pour l&#39;expression de CD207 pour distinguer les cellules de Langerhans et CD207 + Dermal DC de CD207- Dermal PED. </li><li> Identifier Macrophages que / 80 + cellules CD64 + F4. </li><li> Identifier les cellules B que les cellules CD19 + CMHII +. </li><li> Identifier les cellules T CD8 + ou les cellules CD4 +. </li></ol></li></ol></li></ol>

<ol><li>Streilein, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circuits+and+signals+of+the+skin-associated+lymphoid+tissues+%28SALT%29%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Investigative+Dermatology%22%5BJournal%5D)">Circuits and signals of the skin-associated lymphoid tissues (SALT).</a> Journal of Investigative Dermatology. 85 (1 Suppl), 10s-13s (1985).</li>
<li>Tay, S. S., Roediger, B., Tong, P. L., Tikoo, S., Weninger, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Skin-Resident+Immune+Network%5BTitle%5D)+AND+%22Current+dermatology+reports%22%5BJournal%5D)">The Skin-Resident Immune Network.</a> Current dermatology reports. 3, 13-22 (2014).</li>
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<li>Rosenblum, M. D., Truong, H. A., Abbas, A. K., Gratz, I. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((177%3A+Maintenance+of+memory+regulatory+T+cells+in+peripheral+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Cytokine%22%5BJournal%5D)">177: Maintenance of memory regulatory T cells in peripheral tissues.</a> Cytokine. 63 (3), 284-285 (2013).</li>
<li>Kim, B. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TSLP+elicits+IL-33-independent+innate+lymphoid+cell+responses+to+promote+skin+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Science+translational+medicine%22%5BJournal%5D)">TSLP elicits IL-33-independent innate lymphoid cell responses to promote skin inflammation.</a> Science translational medicine. 5 (170), (2013).</li>
<li>Gopinathan, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+insights+into+skin+structure%3A+scratching+the+surface%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+drug+delivery+reviews%22%5BJournal%5D)">New insights into skin structure: scratching the surface.</a> Advanced drug delivery reviews. 54 (Suppl 1), S3-S17 (2002).</li>
<li>Sandrine, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD207%2B+CD103%2B+dermal+dendritic+cells+cross-present+keratinocyte-derived+antigens+irrespective+of+the+presence+of+Langerhans+cells%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">CD207+ CD103+ dermal dendritic cells cross-present keratinocyte-derived antigens irrespective of the presence of Langerhans cells.</a> The Journal of Experimental Medicine. 207 (1), 189-206 (2010).</li>
<li>Bernard, M., Samira, T., Sandrine, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+origins+and+functions+of+dendritic+cells+and+macrophages+in+the+skin%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Immunology%22%5BJournal%5D)">The origins and functions of dendritic cells and macrophages in the skin.</a> Nature Reviews Immunology. 14 (6), 417-428 (2014).</li>
</ol>

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas d’intérêts financiers concurrents.

Nous avons décrit un procédé pour la préparation de suspensions monocellulaires à partir de différentes régions de la peau de la souris. La méthode de la digestion, nous avons adopté, donne non seulement des rendements élevés mais préserve aussi l&#39;expression de marqueurs de surface, ce qui est fondamental pour l&#39;analyse FACS ultérieure. L&#39;utilisation d&#39;un cocktail de collagénase I et II et de la thermolysine, garantit lot minimum des différences de traitement par lots dans un...

La peau est l’un des plus grands organes du corps et sa grande surface est continuellement exposée à l’environnement extérieur. Par conséquent, la peau doit protéger l’organisme des menaces potentielles afin de maintenir l’homéostasie, à la fois par des moyens physiques et en fournissant une protection active contre l’entrée potentielle d’agents pathogènes. De la même manière que la muqueuse intestinale et pulmonaire, la peau abrite une variété de cellules immunitaires qui interagissent continuellement avec l’épithélium afin de maintenir la surveillance immunitaire. Ce système complexe qui implique à la fois des cellules immunitaires et non immunitaires de la peau est reconnu depuis les premiers jours de l’immunologie, lorsqu’en 1978, le terme « tissu lymphoïde associé à la peau » (SALT) 1 a été inventé pour décrire une telle complexité. 
Le grand nombre de cellules immunitaires résidant dans la peau aide l’organisme non seulement à combattre les invasions potentielles, mais aussi à orchestrer la cicatrisation des plaies et à maintenir la tolérance envers les auto-antigènes et le microbiote cutané 2,3. 
Parmi les cellules immunitaires résidentes de la peau, les cellules dendritiques (DC) jouent un rôle crucial dans la formation des réponses immunitaires et le maintien de l’homéostasie 4. Les cellules DC dermiques et les cellules de Langerhans réagissent facilement aux invasions d’agents pathogènes et, lors de la migration vers les ganglions lymphatiques, activent les cellules T et induisent l’expression des récepteurs récepteurs de guidage de la peau sur les cellules T effectrices nouvellement générées 5. Les DC ont également un rôle fondamental dans la régulation de l’homéostasie cutanée. Les DC migrant du derme vers les ganglions lymphatiques dans des conditions homéostatiques transportent les antigènes cutanés séquestrés dans le but d’induire la tolérance des lymphocytes T, principalement par la différenciation des lymphocytes T régulateurs (Tregs) spécifiques des antigènes cutanés 6-8. 
T les cellules représentent la population la plus abondante de cellules immunitaires dans la peau. Non seulement ils s’infiltrent dans la peau lors d’une infection, mais ils représentent également une population stable parmi les lymphocytes résidents de la peau 9,10. Les lymphocytes T CD8+ et CD4+ à mémoire résidente (rm) résident dans la peau et, à la suite d’une infection, peuvent réagir bien avant que les lymphocytes T effecteurs ne soient recrutés dans le sang. Dans la peau, réside également une population de Tregs résidents dans les tissus capables de maintenir une tolérance envers les antigènes cutanés et l’homéostasie tissulaire. Ces cellules sont rapidement et puissamment activées après une exposition à leur antigène apparenté et ont donc été définies comme des Tregs mémoires 11,12. 
Outre les DC et les lymphocytes T, de nombreuses cellules immunitaires innées, telles que les cellules NK, les lymphocytes T gamma delta, les ILC 13 du groupe 2, les mastocytes et les macrophages, peuplent la peau et contribuent à la protection de l’hôte. Pour analyser un environnement aussi complexe, il est obligatoire d’obtenir des suspensions unicellulaires à partir d’échantillons de peau avec une grande efficacité tout en préservant l’expression de marqueurs de surface pour l’analyse ou le tri cytofluorimétrique en flux. 
<classe p='jove_content'>La peau murine présente une couche épidermique externe, constituée principalement de kératinocytes, de cellules de Langerhans et de lymphocytes T épidermiques dendritiques, et la couche dermique située en dessous. Le derme abrite la plupart des cellules immunitaires et est constitué d’une matrice extracellulaire dans laquelle les fibres de collagène sont les plus abondantes, en particulier le collagène-I et le collagène-IV. Contrairement à la peau humaine, la peau de souris est recouverte de fourrure et donc plus peuplée de follicules pileux. Il est également beaucoup plus mince que la peau humaine et contient une couche musculaire, le pannicule carnosus, qui aide à la cicatrisation des plaies 14. Ces caractéristiques rendent plus difficile de perturber efficacement le réseau de collagène du derme afin d’évacuer les cellules immunitaires.
Dans cet article, nous proposons une méthode appropriée pour digérer la matrice extracellulaire qui repose sur un cocktail de collagénases 1 et 2 de haute pureté et de thermolysine. De plus, étant donné que l’analyse de la peau de différentes régions nécessite différentes procédures expérimentales, nous montrerons différentes méthodes pour obtenir efficacement des échantillons de peau du coussinet plantaire, de la queue, de l’oreille et du tronc. Nous étiqueterons ensuite les échantillons afin d’évaluer la présence de cellules T DC (MHCII+CD11c+CD45+), de macrophages (CD11b+/F4/80+CD45+), de cellules T CD8+ et CD4+.

<table><tbody><tr><td colspan="4"><fort>réactifs</fort></td></tr><tr><td>Milieu RPMI 1640 supplémenté&nbsp ;</td><td></td><td></td><td>RPMI1640 supplémenté en L-glu, pen-streptocoque sans bêta-mercapto éthanol</td></tr><tr><td>PBS</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Liberase TM (Enzyme Mix)</td><td>Roche</td><td>5401119001</td><td>remettre en suspension [2,5&nbsp ; mg/ml] en dH2O ; stocker les aliquotes à -20&nbsp ; &deg ; C</td></tr><tr><td>Dnase I</td><td>Sigma&nbsp ;</td><td>D4263-1VL</td><td>remise en suspension dans RPMI 1640 sans sérum [1 000&nbsp ; U/ml]</td></tr><tr><td colspan="4">Materials</td></tr><tr><td>Ciseaux</td><td></td><td></td><td></td>chirurgicaux</tr><tr><td>Pinces</td><td></td><td></td><td></td>chirurgicales</tr><tr><td>Scalpel</td><td></td><td></td><td></td>chirurgical</tr><tr><td>35 mm Boîtes</td><td></td><td></td><td></td>de Pétri</tr><tr><td>66 mm Boîtes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr>de Pétri 100 mm<td>70 et micro ; m Filtres cellulaires</td><td>BD</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td><fort>Digestion cocktail</fort></td><td></td><td></td><td>Dilué dans RPMI 5 % FBS</td></tr><tr><td>LIberase TM</td><td></td><td></td><td>300 &micro ; g/ml</td></tr><tr><td>DNAse1</td><td></td><td></td><td>50 U/ml</td></tr><tr><td colspan="4">Antibodies</strong</td></tr><tr><td>>Name</td><td>Company</td><td>Clone</td><td>Label</td></tr><tr><td>aCD45.2</td><td></td><td>104</td><td>PE-Cy5.5</td></tr><tr><td>aCD11c</td><td></td><td>N418</td><td>PE-Cy7</td></tr><tr><td>CD11b</td><td></td><td>M1/70</td><td>FITC</td></tr><tr><td>F4/80</td><td></td><td>A 3-1</td><td>APC-Cy7</td></tr><tr><td>aCD4</td><td></td><td>Gk1.5</td><td>APC-Cy7</td></tr><tr><td>aCD8</td><td></td><td>53-6.7</td><td>PE</td></tr><tr><td>aCD64</td><td></td><td>X54-5/7.1</td><td>PE-Cy7</td></tr><tr><td>aCD207</td><td></td><td>4C7</td><td>APC</td></tr></tbody></table>

préparation de suspensions de cellules uniques pour l&#39;analyse cytofluorimétrie de différentes régions de la peau de souris

Preparation of Single-cell Suspensions for Cytofluorimetric Analysis from Different Mouse Skin Regions

La peau est un organe barrière qui interagit avec l’environnement extérieur. Exposés en permanence à une invasion microbienne potentielle, le derme et l’épiderme abritent une variété de cellules immunitaires dans des conditions homéostatiques et inflammatoires. Les outils permettant d’obtenir la libération de cellules cutanées pour les analyses cytofluorimétriques sont donc très utiles afin d’étudier le réseau complexe de cellules immunitaires résidant dans la peau et leur réponse aux stimuli microbiens. Ici, nous décrivons une méthodologie efficace pour la digestion de la peau de souris afin d’obtenir rapidement et efficacement des suspensions unicellulaires. Ce protocole permet de maintenir une viabilité cellulaire maximale sans compromettre l’expression de l’antigène de surface. Nous décrivons également comment prélever et digérer des échantillons de peau à différents endroits anatomiques, tels que l’oreille, le tronc, la queue et le coussinet. Les suspensions obtenues sont ensuite colorées et analysées par cytométrie en flux afin de discriminer les différentes populations de leucocytes.

Peau de l&#39;autre région du corps a été digéré selon le protocole décrit et colorées avec les anticorps indiqués. La stratégie de déclenchement est représenté sur la figure 1. Tout d&#39; abord sélectionner les cellules vivantes (cellules DAPI-), puis porte sur singulets (FSC-A vs. FSC-W) et sur ​​des cellules ayant une morphologie des lymphocytes (FSC-A vs SSC-A). Lorsque cela est indiqué, les cellules CD45 + d&#39;origine hématopoïétique sont sélectionnés....

La peau abrite un réseau complexe de cellules immunitaires. Nous décrivons une méthodologie efficace pour la digestion de la peau de souris, à partir de différentes parties du corps de l’animal, afin d’obtenir une suspension unicellulaire et d’analyser les différentes populations de leucocytes résidant dans la peau par cytométrie en flux.

Préparation de Suspensions de cellules uniques pour l&#39;analyse cytofluorimétrie de différentes régions de la peau de souris

The skin is a barrier organ that interacts with the external environment. Being continuously exposed to potential microbial invasion, the dermis and ...

L'objectif général de cette procédure est de préparer une suspension monocellulaire à partir de la peau de souris afin d'identifier les différentes populations de cellules immunitaires résidentes par analyse cytofluorimétrique, pour identifier et isoler les diverses populations de cellules immunitaires résidentes dans la peau. Grâce à cette technique, les chercheurs peuvent facilement digérer les échantillons provenant de différentes régions de la peau de souris sans endommager les marqueurs de surface des cellules immunitaires d'intérêt.Pour obtenir des échantillons de peau à partir de l'oreille de la souris, couper les parties sans poils des oreilles et utiliser une pince pour séparer les faces dorsale et ventrale des organes. Ensuite, racler doucement l'intérieur de l'oreille afin d'éliminer tout cartilage résiduel. Pour obtenir des échantillons de peau en morceaux, raser entièrement le poil de l'animal à l'aide d'une tondeuse, puis appliquer une lotion dépilatoire.Après quelques minutes, essuyez soigneusement l'onguent et pratiquez une incision verticale au milieu du dos de la souris, en prolongeant la coupure le long des limites des zones rasées autour du corps de l'animal. À l’aide de pinces, maintenez la peau en place tout en séparant l’échantillon à l’aide des extrémités fermées et arrondies de ciseaux chirurgicaux ou d’un scalpel, puis détachez délicatement la peau du péritoine et des muscles du dos. Plongez ensuite la peau dans une plaque de culture cellulaire de 100 mm contenant 10 ml de PBS glacé, et utilisez les pinces pour gratter la graisse sous-cutanée.Pour obtenir un échantillon de peau de queue, coupez la queue et utilisez des ciseaux chirurgicaux pour effectuer une incision verticale à partir de la base de la queue jusqu'au bout. À l'aide d'une pince, saisissez le bord de l'incision à la base de la queue, puis, en maintenant le corps de la queue avec une autre pince, tirez doucement la peau vers l'extrémité. Enlevez tout excès de graisse en grattant délicatement l'échantillon de peau.Le pied de la souris est coupé, puis pour obtenir un échantillon de peau à partir de la plante du pied, utilisez des ciseaux chirurgicaux pour inciser longitudinalement la peau du pied depuis la cheville jusqu'au début des orteils, en prenant soin d'éviter de couper les poils. Ensuite, saisissez les os de la cheville avec une pince tout en attrapant la peau avec l'autre main, puis tirez la peau vers les orteils, comme lorsqu'on retire un gant. Pour marquer les cellules cutanées, transférez à tour de rôle chaque échantillon dans une boîte de Pétri de 35 millimètres contenant 2 millilitres de cocktail de digestion fraîchement préparé.À l’aide de ciseaux, hacher l’échantillon en petits morceaux et incuber les fragments de tissu à 37 degrés Celsius pendant 90 minutes, en effectuant un à deux secouages doux durant la période d’incubation. Ensuite, verser le tissu cutané digéré sur un tamis cellulaire de 70 microns dans une boîte de Pétri de 66 millimètres contenant 1 millilitre de RPMI 1640 enrichi avec du FBS par boîte. Laver le tamis avec cinq millilitres de milieu frais, puis utiliser le piston d’une seringue pour faire passer les échantillons à travers le maillage du tamis.Rincez le piston, le récipient et le tamis avec 20 millilitres de milieu frais et transférez la suspension tissulaire dans un tube conique de 50 millilitres. Une fois tous les échantillons traités, centrifugez les cellules et remettez en suspension les culots dans 100 microlitres par échantillon d'anticorps bloquant anti-CD16/CD32 à deux microgrammes par millilitre dans du PBS contenant 1 % de FBS. Après 15 minutes à quatre degrés Celsius, ajoutez 100 microlitres d'anticorps selon le tableau aux échantillons appropriés pendant 30 minutes à quatre degrés Celsius, à l'abri de la lumière.À la fin de l'incubation, laver les cellules dans un millilitre de PBS contenant du FBS et re-suspendre les culots dans 300 microlitres de PBS avec FBS. Ensuite, marquer les cellules avec 2 microgrammes par millilitre de DAPI pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius, à l'abri de la lumière. Pour isoler les leucocytes, commencer par sélectionner la population positive au DAPI afin d'éliminer les cellules mortes.Ensuite, sélectionnez les événements simples (singlets) dans un graphique de surface de dispersion directe par largeur de dispersion directe, puis délimitez les cellules selon leur taille et leur granularité, correspondant aux leucocytes d'intérêt. Ensuite, sélectionnez les cellules positives pour CD45, puis identifiez, pour chaque échantillon, les populations de cellules dendritiques cutanées selon leur expression de CD11C et de la molécule de classe II du CMH. Identifiez les macrophages par leur expression de CD64 et de F480, les cellules B par leur expression de CD19 et de la molécule de classe II du CMH, et les cellules T par leur expression de CD4 ou de CD8.L'isolement des cellules immunitaires cutanées, tel que vient d'être démontré, permet d'obtenir une population composée de plus de 50 % de cellules viables provenant de toutes les régions de la peau, entre 5 000 et 15 000 par centimètre carré, dont les cellules positives pour CD45. Un nombre suffisant de cellules dendritiques, de macrophages, de cellules B et de cellules T peut également être obtenu pour une analyse en aval à partir d'un centimètre carré de peau de souris, comme indiqué. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment digérer un tissu cutané non inflammé et isoler les leucocytes pour une analyse par cytométrie en flux.

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JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie et infection

Cancer fibroblastes associés (CAF) de faciliter l'initiation des tumeurs, la croissance et la progression à travers signalisation qui favorise la prolifération, l'angiogenèse et l'inflammation. Nous décrivons ici une méthode pour isoler des populations pures de fibroblastes normaux et de souris CAF frais et tissus humains par tri cellulaire, en utilisant PDGFRα comme un marqueur de surface.

Isolation des fibroblastes normales et cancéreuses associées à partir de tissus frais par tri cellulaire activé par fluorescence (FACS)

Cette vidéo décrit la méthode rapide pour isoler et cultiver simultanément les mélanocytes et le fibroblaste à partir de la peau du bébé souris postnatal. Ces cellules peuvent être maintenues et manipulées in vitro pour étudier la biologie des cellules de la peau, la cicatrisation des plaies et le mélanome.

Culture rapide de mélanocytes et de fibroblastes murins primaires : isolement des mélanocytes et des fibroblastes à partir d’un échantillon de peau murine entière

La vidéo montre la préparation d’une suspension unicellulaire de cellules immunitaires à partir d’un tissu cérébral murin. Il implique une digestion enzymatique pour libérer les cellules du tissu cérébral, suivie d’une centrifugation à gradient de densité pour isoler les cellules immunitaires en fonction de leur densité afin d’obtenir la suspension unicellulaire.

Préparation d’une suspension unicellulaire de cellules immunitaires à partir de tissu cérébral murin

Nous décrivons un protocole permettant d’isoler efficacement les lymphocytes T résidents de la peau à partir de biopsies de peau humaine. Ce protocole produit un nombre suffisant de lymphocytes résidents de la peau humaine viables pour l’analyse cytométrique en flux et la culture ex vivo.

Lymphocytes Isolation de la peau humaine pour Analyse phénotypique et<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Culture cellulaire

Le comportement des fibroblastes sous-tend un spectre d’entités cliniques, mais ils restent mal caractérisés, en grande partie en raison de leur hétérogénéité inhérente. La recherche traditionnelle sur les fibroblastes repose sur la manipulation in vitro, masquant le comportement des fibroblastes in vivo. Nous décrivons un protocole basé sur FACS pour l’isolement des fibroblastes de peau de souris qui ne nécessite pas de culture cellulaire.

Murin fibroblastes dermiques Isolation par FACS

Le follicule pileux de souris est un modèle idéal pour étudier la biologie des cellules souches adultes. Nous présentons ici un protocole permettant d’isoler différentes populations de follicules pileux, de cellules souches et de kératinocytes épidermiques, en utilisant la digestion enzymatique de la peau dorsale de souris suivie d’une analyse FACS.

Isoler follicule pileux cellules souches et kératinocytes épidermiques de la peau Dorsale Souris

Ce rapport décrit un protocole CUBIC pour clarifier plein des biopsies de peau d'épaisseur de la souris, et de visualiser les profils d'expression de la protéine, les cellules proliférantes, et sébocytes à la résolution d'une seule cellule en 3D. Cette méthode permet une évaluation précise de l'anatomie de la peau et de la pathologie et de phénotypes épidermiques anormales dans des lignées de souris génétiquement modifiées.

Protocole CUBIC Visualise Protein Expression à cellule unique Résolution dans les préparations entières de la peau de montage

Ce protocole décrit comment isoler les kératinocytes cutanés des modèles de souris, les tacles avec des anticorps marqués en métal, et analyser les cellules tachées par cytométrie de masse afin de profiler le modèle d'expression des protéines d'intérêt dans les différentes phases du cycle cellulaire.

Isolement et coloration des kératinocytes de peau de souris pour l'analyse spécifique de cycle cellulaire de l'expression cellulaire de protéine par cytométrie de masse

Un protocole efficace pour le tri cellulaire activé par fluorescence (FACS) est présenté ici des cellules satellites musculaires des membres de souris, adapté à l’étude de la régulation de la transcription dans les fibres musculaires par clivage sous cibles et libération par nucléase (CUT&amp;RUN).

Un protocole efficace pour l’analyse CUT&amp;RUN de cellules satellites de souris isolées par FACS

Nous décrivons des protocoles pour la préparation de la suspension unicellulaire de cellules épithéliales thymiques de souris et la coloration de molécules intracellulaires pour l’analyse cytométrique en flux.

Préparation de suspension unicellulaire de cellules épithéliales thymiques de souris et coloration de molécules intracellulaires pour l’analyse cytométrique en flux

Ce protocole présente une méthode détaillée pour isoler des suspensions unicellulaires de haute qualité à partir de tissu pulmonaire murin sain et porteur de tumeurs. Ce protocole peut être appliqué au scRNA-seq, à l’analyse de cytométrie en flux et à l’isolation des cellules primaires.

Préparation optimisée du tissu pulmonaire entier contenant une tumeur murinée pour la cytométrie en flux et le séquençage de l’ARN unicellulaire

Apprenez à préparer des suspensions de cellules uniques à partir de la peau de souris pour l'analyse cytofluorimétrique des populations de cellules immunitaires résidentes. Cette méthode préserve les marqueurs de surface pour une identification précise.

Préparation de Suspensions de cellules uniques pour l'analyse cytofluorimétrie de différentes régions de la peau de souris

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