Préparation de Suspensions de cellules uniques pour l'analyse cytofluorimétrie de différentes régions de la peau de souris

L’objectif global de cette procédure est de préparer une suspension cellulaire unique à partir de la peau de souris afin d’identifier les différentes populations de cellules immunitaires résidentes par analyse cytofluorimétrique. Pour identifier et isoler les différentes populations de cellules immunitaires résidentes de la peau. En utilisant cette technique, les chercheurs peuvent facilement digérer les échantillons de différentes régions de la peau de la souris sans endommager les cellules immunitaires, les fabricants de surface d’intérêt.

Pour obtenir des échantillons de peau de l’oreille de la souris, coupez les parties glabres des oreilles et utilisez des pinces pour séparer les côtés dorsal et ventral des organes. Ensuite, grattez doucement l’oreille interne pour enlever tout cartilage restant. Pour obtenir des échantillons de peau en morceaux, rasez tous les poils de l’animal à l’aide d’une tondeuse, puis appliquez une lotion dépilatoire.

Après quelques minutes, nettoyez la lotion et faites une coupe verticale au milieu du dos de la souris, en continuant l’incision le long des bords des zones rasées autour du corps de la souris. À l’aide d’une pince pour maintenir la peau en place tout en séparant l’échantillon avec les pointes fermées et arrondies d’une paire de ciseaux chirurgicaux ou d’un scalpel, séparez doucement la peau du péritoine et des muscles du dos. Ensuite, immergez la peau dans une plaque de culture cellulaire de 100 mm contenant 10 ml de PBS glacé et utilisez une pince pour gratter la graisse sous-cutanée.

Pour obtenir un échantillon de peau de queue, coupez la queue et utilisez des ciseaux chirurgicaux pour faire une coupe verticale en commençant de la base de la queue jusqu’à la pointe. À l’aide d’une pince, saisissez le bord de l’incision à la base de la queue, puis en saisissant le corps de la queue avec une autre paire de pinces, tirez doucement la peau vers la pointe. Retirez tout excès de graisse en grattant doucement l’échantillon de peau.

Le pied de la souris est coupé, puis pour obtenir un échantillon de peau du coussinet plantaire, utilisez des ciseaux chirurgicaux pour couper la peau du pied longitudinalement de la cheville au début des doigts, en prenant soin d’éviter de couper les cheveux. Saisissez ensuite les os de la cheville avec une pince tout en saisissant la peau avec l’autre et tirez la peau vers les doigts comme lorsque vous retirez un gant. Pour marquer les cellules de la peau, pour chaque échantillon, transférez à son tour le tissu dans une boîte de Pétri de 35 millimètres contenant 2 millilitres de cocktail de digestion fraîchement préparé.

À l’aide de ciseaux, coupez l’échantillon en petits morceaux et incubez les fragments de tissu à 37 degrés Celsius pendant 90 minutes avec une à deux secousses douces pendant la période d’incubation. Ensuite, versez le tissu cutané digéré sur une passoire cellulaire de 70 microns dans une boîte de Pétri de 66 millimètres contenant 1 millilitre de RPMI 1640 complété par FBS par boîte. Lavez la passoire avec cinq millilitres de milieu frais, puis utilisez un piston de seringue pour presser les échantillons à travers les mailles de la passoire.

Rincez le piston, le plat et la passoire avec 20 millilitres de milieu frais et transférez la boue de tissu dans un tube conique de 50 millilitres. Une fois que tous les échantillons ont été traités, centrifugez les cellules et mettez à nouveau les pastilles en suspension dans 100 microlitres par échantillon de deux microgrammes par millilitre d’anticorps bloquant CD16 CD32 dans PBS plus 1 % FBS. Après 15 minutes à quatre degrés Celsius, ajoutez 100 microlitres d’anticorps comme indiqué dans le tableau aux échantillons appropriés pendant 30 minutes à quatre degrés Celsius à l’abri de la lumière.

À la fin de l’incubation, lavez les cellules dans un millilitre de PBS plus FBS et remettez les granulés en suspension dans 300 microlitres de PBS FBS. Étiquetez ensuite les cellules avec 2 microgrammes par millilitre de DAPI pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius à l’abri de la lumière. Pour isoler les leucocytes, il faut d’abord bloquer la population DAPI positive afin d’éliminer les cellules mortes.

Sélectionnez ensuite les singlets dans une zone de diffusion vers l’avant par tracé de largeur de diffusion vers l’avant et contrôlez les cellules en fonction de la taille et de la granularité des leucocytes d’intérêt. Ensuite, sélectionnez les cellules CD45 positives, puis pour chaque échantillon, identifiez les populations de cellules dendritiques cutanées par leur expression de classe CD11C et CMH deux. Identifiez les macrophages par leur expression CD64 et F480, les lymphocytes B par leur expression de classe CD19 et CMH 2 et les lymphocytes T par l’expression CD4 ou CD8.

L’isolement des cellules immunitaires de la peau, comme nous venons de le démontrer, donne une population de plus de 50 % de cellules viables de toutes les régions de la peau, entre 5 000 et 15 000 par centimètre carré dont les CD45 sont positifs. Un nombre suffisant de cellules dendritiques, de macrophages, de cellules B et de cellules T peut également être obtenu pour l’analyse en aval à partir d’un centimètre carré de peau de souris, comme indiqué. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de digérer un tissu cutané non enflammé et d’isoler les leucocytes pour l’analyse par fax.