Transplantation des cellules musculaires normales et malignes dans immunodéprimés adultes poisson zèbre

L'objectif général de cette procédure est de démontrer comment préparer et transplanter des muscles normaux et malignes, provenant de poissons-zèbres donneurs transgéniques, vers des poissons-zèbres receveurs déficients immunitaires rag deux. La transplantation musculaire consiste d'abord à isoler le muscle marqué par fluorescence par dissection de la musculature dorsale.

Après homogénéisation des cellules musculaires de poisson zèbre, celles-ci sont filtrées et mises en suspension monocellulaire. Les cellules sont ensuite transplantées par voie intramusculaire chez des poissons zèbres mutants rag deux, et une microscopie à fluorescence épifluorescence est utilisée pour suivre l'attecement tissulaire chez les animaux receveurs dès 10 jours après la transplantation. De manière similaire, un sarcome primaire de rhabdomyosarcome embryonnaire peut être prélevé, mis en suspension et transplanté par voie intrapéritonéale chez des poissons zèbres mutants rag deux.

Ensuite, la microscopie est utilisée pour suivre l'engraftement du tissu, et les cellules tumorales propagées peuvent être utilisées dans des applications ultérieures. Le principal avantage de l'utilisation de la transplantation de cellules chez des zebrafish adultes immunodéprimés réside dans le fait qu'elle fournit une plateforme universelle pour la transplantation allogénique de plusieurs types de tissus et de tumeurs. Des greffes de tissus peuvent être réalisées à partir de divers fonds génétiques de donneurs, sans nécessiter de suppression immunitaire chez les poissons receveurs.

Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés en biologie des cellules souches et en biologie régénérative, comme la capacité d'auto-renouvellement des progéniteurs. Nous pouvons également utiliser ces méthodes pour induire des tumeurs chez des poissons mutants rag deux, puis identifier de nouveaux composés chimiques qui, par exemple, freinent la croissance tumorale. La préparation et la transplantation de cellules musculaires normales et malignes seront présentées par Chin, Tang et Anes, deux étudiants diplômés talentueux du laboratoire LAL. Commencez par sacrifier des poissons zèbres donneurs portant des muscles marqués de façon fluorescente.

Les poissons donneurs adultes typiques exprimant l'actine alpha marquée RFP produisent entre 500 000 et 2 millions de cellules musculaires. Dans notre expérience exemple, nous utilisons 30 poissons donneurs pour transplanter dans 20 poissons receveurs, avec un million de cellules chacun. Après l'euthanasie des poissons donneurs, séchez l'animal en le plaçant sur une serviette en papier jetable.

Utilisez une lame de rasoir pour prélever la musculature dorsale. La coupe doit être effectuée à un angle de 45 degrés en arrière de la région anale, en incluant les os et les tissus cutanés. Transférez 10 sections musculaires dorsales prélevées dans une boîte de Pétri propre. Ajoutez ensuite 500 microlitres de tampon de suspension 0,9 XPBS 5 % FBS refroidi.

Ensuite, hacher le tissu jusqu'à l'obtention d'une suspension homogène en utilisant une pipette serologique de cinq millilitres, ajouter deux millilitres de tampon de suspension à l'homogénat, puis passer la suspension à travers la pipette 20 fois. Ensuite, filtrer la suspension à l'aide d'un tamis de 40 microns et recueillir les cellules dans un tube conique de 50 millilitres placé sur de la glace. Garder les cellules au froid pendant le reste de la procédure.

Lavez le tissu restant dans le tamis avec 2,5 millilitres de suspension, tamponnez et filtrez dans un tube conique de 50 millilitres. Dénombrer ensuite le nombre total de cellules viables à l'aide de bleu de trypan et concentrer les cellules par centrifugation à 1000 ×g pendant 10 minutes à 4 °C. Resuspendez ensuite les cellules dans du PBS 0,9 X contenant 5 % de FBS à une concentration de 333 000 cellules par microlitre.

Si le nombre de cellules donneuses est limité, aussi peu que 50 000 cellules injectées peuvent également conduire à un engraftement réussi. Commencez par anesthésier des poissons déficients en rag deux âgés de deux à quatre mois dans du trica. Lorsque les mouvements branchiaux sont lents et que le poisson est immobile, déplacez-le sur une serviette humide avec le côté gauche du poisson tourné vers le haut.

Utilisez maintenant une microsyringe de 10 microlitres, jauge 26 s, préalablement nettoyée, pour injecter trois microlitres de la suspension de cellules musculaires préparée. Les injections doivent être réalisées à un angle de 45 degrés et directement dans la musculature dorsolatérale des poissons receveurs. Il est important de noter que, lors d'une transplantation intramusculaire, un volume total inférieur à trois microlitres doit être injecté dans le poisson receveur. Ensuite, transférez soigneusement le poisson receveur dans un aquarium de récupération contenant de l'eau propre provenant du système d'élevage des poissons.

Continuer à injecter les poissons restants et les placer dans un même aquarium de récupération. Évaluer ultérieurement les taux d'engraftement à 10, 20 et 30 jours post-transplantation à l'aide de la microscopie en champ clair et de la microscopie à fluorescence épiscopique. Traiter chaque tumeur séparément.

Sacrifier un poisson atteint d'un rhabdomyosarcome embryonnaire. Placer le poisson dans une boîte de Pétri propre et disséquer la tumeur en la séparant des tissus non cancéreux à l’aide d’un scalpel et de pinces fines. Une dissection minutieuse autour de la tumeur permettra d’obtenir une suspension cellulaire de plus grande pureté, avec une contamination minimale par le tissu musculaire environnant. Transférer la tumeur disséquée dans une nouvelle boîte et ajouter 100 microlitres de tampon de suspension 0,9 XPBS 5 % FBS prérefroidi.

Ensuite, hacher le tissu avec une lame de rasoir jusqu'à l'obtention d'une suspension homogène. Puis ajouter 900 microlitres supplémentaires de tampon à l'aide d'une pipette de un millilitre, suivis de trier. Agiter la suspension à travers la pipette plusieurs fois pour dissocier les cellules.

Filtrez maintenant les cellules à l’aide d’un tamis cellulaire de 40 microns. Rincez la plaque en ajoutant deux à quatre millilitres supplémentaires de suspension tamponnée, puis filtrez à travers le même tamis cellulaire. Concentrez les cellules comme précédemment.

Conserver les cellules sur de la glace. Ensuite, resuspendre les cellules dans 100 microlitres de tampon et dénombrer les cellules viables à l'aide de bleu de trypan. Ajuster la concentration de la suspension cellulaire à 5 000 cellules par microlitre.

Ensuite, anesthésiez deux poissons-zèbres récipients immunodéprimés et placez-les sur une serviette en papier propre, le côté ventral vers le haut. À l’aide d’une aiguille de seringue stérilisée de calibre 26, injectez le volume souhaité dans la cavité péritonéale du poisson-zèbre récipient ici.

25 000 cellules sont injectées dans cinq microlitres. Toutefois, jusqu’à 10 microlitres peuvent être injectés avec succès. Laissez les poissons injectés se remettre dans un aquarium de récupération avant de les retourner au système principal.

Par la suite, suivre l'engraftement chez les poissons receveurs à l'aide d'une microscopie à fluorescence en épifluorescence et récolter les cellules pour des études ultérieures. À l'aide de la procédure décrite, des cellules musculaires squelettiques provenant de donneurs transgéniques exprimant l'alpha-actine RFP ont été transplantées dans des poissons-zèbres mutants rag2 homozygotes immunodéprimés. Le tissu musculaire squelettique a produit une suspension monocellulaire contenant 84,3 % de cellules viables, tel que déterminé par exclusion du DPI.

Après l'analyse par cytométrie en flux, les cellules positives pour le RFP représentaient 35,3 % de cette suspension de cellules donneuses. La transplantation de cellules dans le muscle squelettique dorsal de poissons receveurs mutants homozygotes pour RAG2 a conduit à une greffe constante et forte. Ceci a été confirmé par la formation de fibres musculaires fluorescentes multinucléées chez les poissons receveurs ; les poissons receveurs de type sauvage n'ont pas réussi à intégrer les fibres musculaires.

Cependant, à 10 jours post-transplantation, neuf des 14 poissons-zèbres mutants présentaient des fibres musculaires positives pour la RFP près du site d'injection. Importamment, les fibres musculaires greffées positives pour la RFP persistaient jusqu'à au moins 30 jours post-transplantation. De même, un engraftement robuste a été obtenu après transplantation de poissons-zèbres mutants RAG2 atteints de rhabdomyosarcome embryonnaire ou ERMS.

Les ERMS greffés partageaient des caractéristiques histologiques avec la tumeur ERMS primitive, et l'hétérogénéité des cellules tumorales était maintenue, comme évalué par analyse de fluorescence. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment réaliser des transplantations musculaires et des transplantations intrapéritonéales de tissus normaux et malignes en utilisant des poissons adultes récipients immunodéprimés. Après cela, d'autres méthodes telles que le tri cellulaire activé par fluorescence, l'analyse de transplantation par dilution limitante et la PCR en temps réel peuvent être effectuées afin d'évaluer les différences fonctionnelles et moléculaires entre différentes sous-populations tumorales.

Dans l'ensemble, notre approche permet un engraftement robuste et à long terme de tissus fluorescents musculaires et malignes chez des poissons mutants RAG deux immunodéprimés. L'avantage de cette méthode est que l'engraftement se produit en l'absence de suppression immunitaire préalable des poissons receveurs et ne nécessite pas d'appariement immunitaire entre les donneurs et les receveurs.