Name: Utilisant murin inductible télomérase allèles dans les études de la dégénérescence des tissus / Régénération et cancer (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-04-13T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 34 s
Description: Découvrez la génération d'allèles de télomérase inductibles chez la souris pour étudier la dégénérescence tissulaire, la régénération et le cancer. Cette méthode utilise l'hydroxytamoxifène pour réactiver la télomérase in vivo et in vitro.

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NOTE: Toutes les étapes de ce protocole ont été approuvés par UT MD Anderson Cancer Center. 1. Génération de mTERT-ER allèle <ol><li> Introduire knock-in vecteur de ciblage contenant la ERT2-LBD (Ligand Binding Domain) en amont et en cadre avec la séquence génomique mTERT (de l&#39;exon 1 à l&#39;intron 2) et une Lox - PGK - Neo - fragment Lox (figure 1A) dans des cellules ES de souris avec électroporation. </li><li> Culture des cellules ES à la néomycine pour 6-10 jours. Choisissez clones résistantes à la néomycine et à élargir en plaques à 48 puits. Extraire l&#39;ADN génomique en utilisant un kit commercial et confirmer le knock-in allèle par buvardage de Southern. </li><li> Injecter deux ES lignes avec plus de 95% des caryotypes normales en C57BL / 6 blastocystes avec un kit de micromanipulation sous un microscope inversé. Implanter les blastocystes dans l&#39;utérus de mères porteuses 23. Accoupler les chimères mâles de haut grade (70-90%) à C57BL / 6 femâles. </li><li> Confirmez le génotypage des animaux hétérozygotes mTERT-ERNEO par buvardage de Southern. </li><li> Accoupler les animaux hétérozygotes mTERT-ERNEO et animaux EIIa-Cre de supprimer la cassette NéoR. Accoupler les animaux hétérozygotes pour C57BL / 6 animaux pendant au moins trois fois, et d&#39;autres inter-race hétérozygotes animaux mTERT-ER pour générer homozygotie. </li></ol> 2. Génération de LSL-mTERT allèle <ol><li> Introduire le knock-in vecteur de ciblage contenant une LoxP - triple Stopper - Neo - fragment LoxP et la séquence génomique mTERT (1 entre l&#39;exon et l&#39;intron 2, figure 1B) dans des cellules ES de souris avec 23 l&#39;électroporation. </li><li> Culture des cellules ES à la néomycine pour 6-10 jours. Choisissez clones résistantes à la néomycine et à élargir en plaques à 48 puits. Extraire l&#39;ADN génomique en utilisant un kit commercial et confirmer le knock-in allèle par buvardage de Southern 23. </li><li> Inject deux ES lignes avec plus de 95% des caryotypes normaux dans C57BL / 6 blastocystes avec un kit de micromanipulation sous un microscope inversé. Implanter les blastocystes dans l&#39;utérus de mères porteuses 23. Accoupler les chimères mâles de haut grade (70-90%) à C57BL / 6 femelles. </li><li> Confirmez le génotypage des animaux hétérozygotes LSL-mTERT par buvardage de Southern. </li><li> Les animaux hétérozygotes se accoupler à des souris C57BL / 6 animaux pendant au moins trois fois, et en outre entre les races d&#39;animaux hétérozygotes LSL-mTERT pour générer homozygotie. </li></ol> 3. La réactivation de la télomérase dans mTERT-ER et Souris LSL-mTERT In Vivo Pour mTERT-ER <ol><li> Stériliser tous les instruments chirurgicaux avant l&#39;injection. </li><li> Anesthésier les souris avec de l&#39;isoflurane chambre (4% pour l&#39;induction, 2% pour le maintien) à 50% (v / v) d&#39;oxygène / 50% (v / v) de mélange de gaz de monoxyde de diazote. Ou anesthésier la souris par un mélange de kétamine-xylazine (100 mg / kg de poids corporel + 10 mg / kg de poids corporel). </li><li> Après anesthésie profonde est atteint, retirez l&#39;animal anesthésié de la chambre de l&#39;induction, et garder la tête à l&#39;intérieur du tube relié à la chambre de l&#39;isoflurane (2%). </li><li> Pincez les coussinets plantaires des souris afin de se assurer que l&#39;animal est profondément anesthésié. Mettez la pommade sur les deux yeux afin d&#39;éviter les yeux de sécher. Essuyez le dos des souris avec une solution de povidone-iode. </li><li> Injecter la libération lente culot 4-OHT avec trocart de précision (10 G) sous la peau du dos et pousser le culot tout le chemin à la ligne médiane entre les deux épaules. </li><li> Sceller l&#39;incision avec clip de la plaie applicateur et surveiller la souris pour la récupération de l&#39;anesthésie. Retirez les clips 10 jours plus tard. Chaleur supplémentaire ne est pas nécessaire parce que la procédure est terminée sous peu. </li><li> Période de traitement avec du 4-OHT pastille doit être optimisée en fonction du but de l&#39;étude. </li></ol> Pour LSL-mTERT &lt;ol&gt; <li> Le tamoxifène (10 mg / ml, dissous dans l&#39;huile de maïs) est injectée par voie intrapéritonéale deux jours consécutifs (200 ul / 25 g / jour). </li></ol> 4. Isolement de cellules souches neurales et la réactivation de la télomérase in vitro <ol><li> Les souris sont euthanasiées avec du dioxyde de carbone et les cerveaux sont prélevés. Suivre le protocole du kit disponible dans le commerce de dissociation de tissu neural selon fabricant. </li><li> Remettre en suspension la poudre lyophilisée dans le flacon étiqueté avec une solution de 4 ml de milieu de culture cellulaire pour la solution 4. Ne vortex. Cette solution doit ensuite être réparti en portions aliquotes et stocké à -20 ° C pour une utilisation ultérieure. </li><li> Préchauffer le mélange à 37 ° C pendant 15 min avant utilisation. </li><li> Faire Enzyme Mix 1: Solution 1 (50 ul) et la solution 2 (1900 pi). Assurez-Enzyme Mix 2: Solution 3 (20 pi) et Solution 4 (10 pi). </li><li> Préparer 1950 ul mélange enzymatique 1 jusqu&#39;à 400 mg de tissu et le vortex. Pré-chauffer le mélange à 37 ° C pendant15 min avant utilisation. </li><li> Sortez les cerveaux de souris 1-jour, et de garder les cerveaux antérieurs en enlevant les bulbes olfactifs et le cervelet. Gardez les tissus du cerveau antérieur dans 1 ml de milieu de culture froide car l&#39;enlèvement et le ranger dans 4 ° C. Assurez-vous de traiter le tissu neural dans les 1 h. </li><li> Déterminer le poids de tissu pour se assurer que la limite de 400 mg par la digestion ne est pas dépassée. Placer le cerveau sur le couvercle d&#39;une boîte de 35 mm de diamètre Petri, et écraser le cerveau à l&#39;aide d&#39;un scalpel. </li><li> En utilisant une pointe de pipette de 1 ml, ajouter 1 ml de HBSS (w / o Ca / Mg) et des morceaux de pipettes arrière dans un tube de 15 ml. Rincer avec du HBSS (w / o Ca / Mg). Centrifuger à 300 g pendant 2 min à température ambiante et aspirer le surnageant attentivement. </li><li> Ajouter 1950 pi de mélange d&#39;enzymes préchauffé (1 Solutions 1 et 2) par jusqu&#39;à 400 mg de tissu. Incuber dans le tube de 15 ml pendant 15 min à 37 ° C, le mélange ou l&#39;agitation par retournement du tube toutes les 5 min. </li><li> Préparer 30 ul mélange enzymatique 2 par échantillon de tissu en ajoutant 20 &amp; #956; l de Solution 3-10 ul de Solution 4. Puis ajouter à l&#39;échantillon. Inversez doucement pour mélanger. Ne pas vortex. </li><li> Dissocier tissus mécaniquement à l&#39;aide d&#39;un large pointe, pipette Pasteur polie au feu par pipetage de haut en bas 10 fois lentement. Éviter la formation de bulles d&#39;air. </li><li> Incuber à 37 ° C pendant 10 min, en inversant le tube toutes les 3 min. </li><li> Répétez l&#39;étape 4.11 et 4.12 étape si les tissus sont plus grandes que 200 mg. </li><li> Appliquer la suspension de cellules à un tamis cellulaire de 70 pm, placé sur un tube de 50 ml. Appliquer 10 ml de PBS par tamis cellulaire. Jeter tamis cellulaire et centrifuger la suspension de cellules à 300 g pendant 20 min à température ambiante. Aspirer le surnageant complètement. </li><li> Remettre en suspension les cellules avec du milieu de cellules souches au volume requis pour d&#39;autres applications. </li><li> Pour activer télomérase dans LSL-mTERT CNS, traiter les cellules avec 100 uM 4-OHT pendant deux jours. Pour activer la télomérase dans les mTERT-ER CNS, maintenir les cellules dans un milieu de culture avec 100 uM 4-OHT. </li></ol> 5. télomères FISH <ol><li> Préparer les chromosomes métaphasiques de cellules cultivées. </li><li> Pour FFPE (fixés au formol et inclus dans la paraffine), des coupes de tissus dans du xylene Déparaffiner et réhydrater en série de l&#39;éthanol pendant 5 minutes à chaque fois (100%, 90%, 70%, 50% d&#39;éthanol) et du PBS pendant 5 min. </li><li> Post-fix dans le methanol: acide acétique (3: 1) pendant 1-2 heures. Déshydrater en série de l&#39;éthanol froid pendant 5 minutes chacune (70%, 90%, 100% d&#39;éthanol) et l&#39;air sec. Laver à 1x PBS à 37 ° C pendant 5 min. </li><li> Dénaturer chromosomes dans 4% de formaldéhyde à 37 ° C pendant 2 min. Déshydrater en série de l&#39;éthanol froid 5 min chacun (70%, 90%, 100% d&#39;éthanol) et l&#39;air sec. </li><li> Appliquer 12 à 25 pi du mélange d&#39;hybridation PNA à chaque diapositive. (Mélange d&#39;hybridation: 70% de formamide, 0.06x SSC, 0,2% de BSA, / ul d&#39;ARNt, 0,5 ng / ul télomères ou sondes centromériques 0,5 ng) </li><li> Sceller la lamelle avec du ciment de caoutchouc. Post-dénaturer préparations chromosomiques et des coupes de tissus à 80 ° C pendant 4 mdans. Hybrider à la température ambiante ou à 37 ° C pendant 2-4 heures dans la chambre humide. </li><li> Laver à température ambiante avec un tampon de lavage 2 x 15 min. (Tampon de lavage: 70% de formamide, SSC 0.06x, pH 7,2). Laver à la température ambiante 3 x 5 min avec du PBST. Diapositives contre-coloration avec DAPI ou de la fluorescence rouge lointain pour l&#39;examen microscopique. </li></ol>

<ol><li>Bass, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+sequencing+of+colorectal+adenocarcinomas+identifies+a+recurrent+VTI1A-TCF7L2+fusion%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Genomic sequencing of colorectal adenocarcinomas identifies a recurrent VTI1A-TCF7L2 fusion.</a> Nat Genet. 43, 964-968 (2011).</li>
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</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Ici, nous rapportons la génération de deux allèles de la télomérase murin inductibles et comment réactiver la télomérase in vivo et in vitro. L&#39;étape critique pour réactiver l&#39;activité mTERT-ER est de garder une concentration continue du tamoxifène, donc nous avons choisi d&#39;utiliser 4-OHT granulés à libération fabriqués par Innovative Research of America. Les pastilles garder libérant 4OHT à un niveau sanguin de l&#39;état d&#39;équilibre de 1 ng / ml jusqu&#39;à 60 jours. Dans une étude précédente, nous avons montré que la réactivation de l&#39;activité de la télomérase avec cette stratégie a réussi à améliorer les phénotypes dégénératives telles que l&#39;épuisement des cellules souches, la dépréciation des réponses de lésions tissulaires et la défaillance d&#39;organes dans de multiples organes qui ont été induite par un dysfonctionnement des télomères dans G4 mTERT ER / ER 20 souris. Autre que l&#39;étude de la fonction de la télomérase dans le vieillissement, ces deux allèles de la télomérase inductibles peuvent également être utilisés pour étudier le cancer. Des études antérieures ontavantage de ces allèles d&#39;explorer le rôle des télomères et de la télomérase attrition réactivation dans l&#39;élaboration des génomes et impact de la biologie de lymphome thymique des lymphocytes T 21 et 22 cancer de la prostate. Ces deux études ont montré que le dysfonctionnement des télomères à la fin de la génération G4 Atm - / - mTERT ER / ER et G4 PB-Cre4 Pten L / L p53 L / L LSL-mTERT L / L souris fournit un mécanisme alimentant l&#39;acquisition d&#39;événements mutagènes début pour l&#39;initiation de la tumeur, mais prévenir la progression de tumeurs malignes pleinement. Lorsque la télomérase a été réactivée dans le contexte de l&#39;instabilité génomique télomères dysfonction induite, dommages à l&#39;ADN des points de contrôle et rampante instabilité chromosomique ont été supprimées, ce qui a permis la pleine progression des tumeurs malignes avec de nouvelles propriétés biologiques telles que les métastases osseuses du cancer de la prostate 21 et le cerveau infiltration de thymic lymphome 21. Des phénomènes similaires ont également été observés dans d&#39;autres types de cancer, dont le cancer du côlon et le cancer du pancréas (communications personnelles avec les Drs. Haoqiang Ying, Adam Boutin et Ronald DePinho). Parce que la protéine TERT-ER peut être facilement basculé entre on et off états selon que les animaux sont traités avec le tamoxifène ou le véhicule, les modèles de tumeurs générées par mTERT-ER allèle peuvent être utilisés pour tester la thérapie anti-télomérase. Dans l&#39;étude précédente, les tumeurs générées dans G4 Atm - / - mTERT ER animaux / ER ont été libérés de 4-OHT; sur la télomérase épuisement, les tumeurs ont diminué par la suite en raison de la réintégration des points de contrôle induite dysfonction-télomères 21. Cependant, certaines des tumeurs résistance acquise en réponse à la télomérase l&#39;extinction par l&#39;activation d&#39;un allongement des télomères alternative (ALT) mécanisme. Une caractérisation plus poussée de ces tumeurs ALT + résistants montré que they avoir la transcription aberrante des gènes impliqués dans la biologie mitochondriale et la défense oxydatif comprenant un régulateur maître de la synthèse et à l&#39;oxydation mitochondriale défense PGC-1β. Knockdown de PGC-1β ou SOD2 (un autre régulateur de la défense oxydatif) élimine considérablement cellules ALT + tumorales tout garder les cellules tumorales de la télomérase + restent relativement intacte 21. Une limitation de ces deux allèles knock-in, ce est qu&#39;ils ne peuvent se permettre la réactivation de la télomérase au niveau endogène parce qu&#39;ils sont dans le locus natif du gène de la télomérase. Dans la plupart des cancers humains, la télomérase est surexprimée effectivement à un niveau beaucoup plus élevé. Afin d&#39;améliorer le niveau de la télomérase, une modification nous pouvons considérer est d&#39;insérer la construction mTERT-ER avec un promoteur plus fort tel que PGK (phosphoglycérate kinase), le promoteur en locus Rosa26. En conclusion, ces deux nouveaux allèles inductibles de la télomérase murines fournissent genette sans précédentic outils pour étudier les fonctions de la télomérase dans le vieillissement et l&#39;homéostasie tissulaire ainsi que la progression de la tumeur, en particulier dans le contexte de l&#39;instabilité génomique induite télomères de la dysfonction-pré-acquise. L&#39;allèle mTERT-ER peut également être utilisé pour étudier la thérapie anti-télomérase par passage dans d&#39;autres modèles tumoraux de souris sujettes.

La télomérase est une enzyme responsable du maintien de télomères. Il se agit de séquences répétées à l&#39;extrémité des chromosomes qui protègent leur intégrité. Les composants de base de la télomérase holoenzyme sont une sous-unité catalytique de la transcriptase inverse (TERT) et une sous-unité de l&#39;ARN (TERC) qui sert de matrice pour additionner le télomérique répète 1,2. Bien que généralement supprimée dans les cellules somatiques différenciées, présente une activité télomérase robuste et joue un rôle important dans les cellules germinales, les cellules cancéreuses et les cellules souches. souris knock-out mTERC mTERT et offrent une grande dans les systèmes de modèle in vivo pour étudier les fonctions de la télomérase dans les cellules souches et le cancer. Le mTERC et mTERT souris knockout (G1) ne ont montré aucun phénotypes évident en raison de la longue réserve des télomères chez la souris 3. Cependant, intercroisement série souris knock-out mTERC et mTERT à la fin génération (G5-G6) a entraînél&#39;érosion progressive des télomères et finalement provoqué la dégénérescence sévère des tissus hautement prolifératives 4. Late génération (G5-G6) mTERC - / - souris sont infertiles en raison des taux élevés de l&#39;apoptose dans les cellules germinales des testicules et de l&#39;épuisement. G5-G6 mTERC - / - souris présentent également phénotypes dégénératives dans les tissus hautement prolifératives, y compris la moelle osseuse, l&#39;intestin et de la peau en raison de taux élevés de l&#39;apoptose et la capacité d&#39;auto-renouvellement défectueuse dans la tige de tissu / compartiments de cellules progénitrices 4. Les cellules souches hématopoïétiques de la moelle osseuse de la fin génération mTERC - / - souris de perte d&#39;exposition du potentiel de prolifération, capacité d&#39;auto-renouvellement compromis, apoptose accrue et, éventuellement épuisement fonctionnelle 5,6. De même, progressivement augmenté corps apoptotiques dans cryptes intestinales ont été observées dans chaque génération successive de G1-G6 mTERC souris - / - 7,8. Til effet délétère des télomères dysfonctionnels ne semble pas être limitée aux tissus de roulement élevé depuis la fois la prolifération des cellules souches neurales adultes in vitro et la neurogenèse in vivo ont été gravement affaiblies à la fin de la génération (G4-G5) mTERC - / - souris 9 . Le rôle de la télomérase dans les cellules souches est en outre corroborée par les conclusions d&#39;une rare maladie génétique humaine dyskératose congénitale (DKC), qui ressemble à certains égards, le vieillissement prématuré de 10,11. DKC est causée par des mutations dans TERC, TERT, et les gènes qui codent pour dyskérine, une télomérase sous-unité de base, et d&#39;autres protéines associées à des dyskérine 12. En moyenne, les télomères chez les patients DKC sont plus courtes que 99% des témoins appariés selon l&#39;âge. La majeure de morbidité de la maladie est due à l&#39;anémie aplastique, qui est causée par l&#39;entretien défectueux de cellules souches hématopoïétiques. Autres aspects de la maladie tels que la leucoplasie orale, une dystrophie des ongles, retardati mentalesur, les testicules et l&#39;atrophie des complications pulmonaires suggèrent toutes les fonctions des cellules souches de tissus et de cellules progénitrices 10, conclusions en étroite accord avec ceux facultés affaiblies dans la production tardive de la télomérase souris knock-out. DKC patients sont sujettes au syndrome myélodysplasique et ont une prévalence accrue de tumeurs malignes de la muqueuse. Ainsi, la carence de la télomérase chez des patients humains récapitule les défauts de fonctionnement des cellules souches et prédisposition tumorale qui sont observés chez les souris knock-out télomérase fin de production. Courts télomères et une forte activité de la télomérase sont caractéristiques du cancer. Comme les cellules normales ou précancéreuses divisent, les résultats faibles ou absentes activité de la télomérase dans l&#39;érosion éventuelle des télomères et l&#39;activation des points de contrôle cellulaires similaires à ceux provoqués par des doubles-sauts échoués ADN (CDB) 13. Comme CDB classiques dysfonctionnement des télomères a été démontré, pour induire et p53 associé réponses cellulaires telles que la sénescence et / ou apoptosis 14,15. Après inactivation mutationnelle de p53, le cycle cellulaire et la survie cellulaire sont améliorées dans les cellules présentant un dysfonctionnement des télomères, qui prévoit un mécanisme de mutation pro-cancérigènes caractérisé par translocations et amplifications régionaux et suppressions 16,17. Dans le même temps, suite un dysfonctionnement des télomères et l&#39;instabilité chromosomique associée rampante (même dans les cellules nulles p53) semblent limiter la progression maligne complet de ces cancers. Par exemple, la fin de la génération G4-G5 mTERC - / - Ink4a / Arf - / - souris ont montré l&#39;incidence du lymphome considérablement réduite par rapport à Ink4a / Arf souris nulle en raison de l&#39;attrition des télomères. Dans une autre étude, les lésions adénomateux plus avancés dans G4 mTERT - / - souris min APC ont été fortement réprimées en comparaison avec des souris min APC due à un arrêt de croissance significatif et l&#39;apoptose 18,19. Leobservation que télomère dysfonctionnement induit par une instabilité génomique inhibe la progression tumorale invite la spéculation que l&#39;activation de la télomérase peut permettre la progression maligne en partie par la répression de l&#39;instabilité génomique à un niveau compatible avec la viabilité de cellules cancéreuses et / ou une neutralisation p53-dépendante ou mécanismes de point de contrôle -indépendante. Afin d&#39;étudier si la réactivation de la télomérase peut arrêter ou même inverser le vieillissement des cellules souches, et si la réactivation de la télomérase peut favoriser la tumorigenèse dans le contexte de l&#39;instabilité génomique, nous avons généré des deux allèles de la télomérase murins inductibles. Le premier est le 4-hydroxytamoxifène (4-OHT) inductible par TERT-Estrogen Receptor (mTERT-ER) fusion knock-in allèle. En l&#39;absence de 4-OHT, les souris homozygotes pour mTERT-ER (ER mTERT / ER désigné) sont l&#39;activité télomérase déficiente et soutenir mêmes phénotypes cytogénétiques et cellulaires que mTERT ou m conventionnelleModèle KO TERC. Sur 4-OHT traitement, activité de la protéine TERT-ER peut être restauré à des niveaux comparables à la protéine TERT natif 20, 21. La deuxième allèle est un roman TERT inductible knock-in allèle contenant une cassette LoxP-Bouchon-LoxP intronique (LSL- mTERT); lors de l&#39;excision médiée par Cre-LSL, mTERT est ré-exprimé sous des mécanismes de contrôle de l&#39;expression endogène 22.

<table><tbody><tr><td>Leica AM6000 Kit de micromanipulation</td><td>Leica</td><td>Per quote</td><td></td></tr><tr><td>Microscope inversé Leica DMI6000 B</td><td>Leica</td><td>Per quote</td><td></td></tr><tr><td>Neomycin</td><td>Life technologies</td><td>21810031</td><td></td></tr><tr><td>vaporisateur d’isoflurane</td><td>Veterinary Anesthesia Systems</td><td>911103</td><td></td></tr><tr><td>isoflurane</td><td>Henry Schein</td><td>1005796</td><td></td></tr><tr><td>mélange de kétamine-xylazine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>K113-10ML</td><td></td></tr><tr><td>4-OHT poudre</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H7904-5MG</td><td></td></tr><tr><td>Tamoxfien</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T5648-1G</td><td></td></tr><tr><td>4-OHT granule</td><td>Innovative Research of America</td><td>Trochar de</td><td></td></tr><tr><td>précision personnalisé (calibre 10)</td><td>Innovative Research of America</td><td>MP-182</td><td></td></tr> clip de <tr><td>plaie applicateur</td><td>Fischer Scientific</td><td>01-804</td><td></td></tr><tr><td>clip</td><td>Fischer Scientific</td><td>01-804-5</td><td></td></tr><tr><td>Kit de dissociation des tissus neuraux</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-092-628</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Life technologies</td><td>14025092</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Life technologies</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>xylène</td><td>Fischer Scientific</td><td>X3P-1GAL</td><td></td></tr><tr><td>méthanol</td><td>Fischer Scientific</td><td>A-433S4</td><td></td></tr><tr><td>acide acétique</td><td>Fischer Scientific</td><td>A38-500</td><td></td></tr><tr><td>éthanol</td><td>Fischer Scientific</td><td>22-032-104</td><td></td></tr><tr><td>formamide</td><td>Fischer Scientific</td><td>F84-1</td><td></td></tr><tr><td>Sonde télomère PNA</td><td>Panagene</td><td>F1001-5</td><td></td></tr><tr><td>Sonde centromère PNA</td><td>Panagene</td><td>F3003-5</td><td></td></tr><tr><td>20X SSC</td><td>Fischer Scientific</td><td>BP1325-4</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2153-10G</td><td></td></tr><tr><td>ARNt</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R5636-1ML</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Fischer Scientific</td><td>BP337-100</td><td></td></tr><tr><td>Ciment caoutchouc</td><td>Walmart</td><td>Elmer’s</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9542</td><td></td></tr></tbody></table>

utilisant murin inductible télomérase allèles dans les études de la dégénérescence des tissus / régénération et cancer

Utilizing Murine Inducible Telomerase Alleles in the Studies of Tissue Degeneration/Regeneration and Cancer

Pilotes bien établis qui provoquent la dégénérescence des tissus au cours du vieillissement télomères perte de l&#39;intégrité du génome et sa signalisation de dommages à l&#39;ADN et les réponses associées aux points de contrôle sont dysfonction induite. Cancer, les taux d&#39;incidence augmente considérablement avec l&#39;âge, se caractérise par des longueurs de télomères courts et une forte activité de la télomérase. Pour étudier les rôles de dysfonctionnement des télomères et de la télomérase réactivation dans le vieillissement et le cancer, le protocole montre comment générer deux télomérase inductible murin knock-in allèles 4-hydroxytamoxifène (4-OHT) inductible par TERT-Estrogen Receptor (mTERT-ER) et Lox -Stopper-Lox TERT (LSL-mTERT). Le protocole décrit les procédures à induire un dysfonctionnement des télomères et de réactiver l&#39;activité de la télomérase dans les souris mTERT-ER et LSL-mTERT in vivo. Les données représentatives montrent que la réactivation de l&#39;activité télomérase peut améliorer les phénotypes dégénératives des tissus induites par un dysfonctionnement des télomères. Dans order de déterminer l&#39;impact de la télomérase réactivation sur la tumorigenèse, nous avons généré la prostate modèle de tumeur G4 PB-Cre4 Pten L / L p53 L / L LSL-mTERT L / L et thymique modèle de lymphome T G4 Atm - / - mTERT ER / ER . Les données représentatives montrent que la télomérase réactivation dans le contexte d&#39;instabilité génomique induite par un dysfonctionnement des télomères peut grandement améliorer la tumorigenèse. Le protocole décrit également les procédures utilisées pour isoler des cellules souches neurales (NSC) de souris mTERT-ER et LSL-mTERT et réactiver l&#39;activité de la télomérase dans les CNS in vitro. Les données représentatives montrent que la réactivation de la télomérase peut améliorer la capacité d&#39;auto-renouvellement et la neurogénèse in vitro. Enfin, le protocole décrit les procédures pour effectuer des télomères FISH (Fluorescence In Situ Hybridation) sur les deux FFPE de la souris (fixés au formol et ParafEmbarqués) tissus cérébraux communs et chromosomes métaphasiques de cellules cultivées.

Les stratégies pour générer murin mTERT-ER et LSL-mTERT knock-in allèles ont été décrits dans la figure 1A et 1B. Plus précisément, un LoxP - triple Stopper - Neo - fragment LoxP a été inséré entre l&#39;exon 1 et l&#39;exon 2 du locus mTERT pour générer LSL-mTERT allèle. Pour générer mTERT-ER allèle, domaine ERT2-LBD dans le cadre avec le gène mTERT a été inséré dans l&#39;extrémité N-terminale de l&#39;exon 1. Nous avons montré que, lorsque la télomérase a été transitoirement réactivé chez les souris de dysfonctionnement des télomères en les traitant avec des pastilles 4-OHT pour 4 semaine, le phénotype dégénérative pourraient être améliorés dans plusieurs organes tels que le cerveau (figure 2A) et les testicules (figure 2B). Afin de déterminer l&#39;impact de la télomérase réactivation sur des cellules cultivées in vitro, nous avons isolé des cellules souches neurales (NSC) de fin de génération G4 LSL-mTERT et G4 mTERT-er Souris. Nous avons montré que lorsque la télomérase a été réactivé en télomères NSCs dysfonctionnelles, la capacité d&#39;auto-renouvellement du CNS a été considérablement augmenté (figure 3A), et dans la neurogenèse vitro a également été considérablement amélioré (figure 3B). Afin de déterminer l&#39;impact de la télomérase réactivation sur la tumorigenèse dans le contexte de dysfonctionnement des télomères, nous avons généré PB-Cre4 Pten L mTERT LSL-/ L (modèle de tumeur de la prostate) / L p53 L / L L et Atm - / - mTERT ER / ER (cellules T modèle de lymphome thymique) des cohortes de la dernière génération. Lorsque la télomérase a été réactivé par un traitement au tamoxifène chez ces souris avec une injection (figure 4A) ou pastilles 4-OHT pendant 8 semaines (figure 4B), la tumorigénèse a été grandement améliorée à la fois dans le modèle de tumeur de la prostate (figure 4A) et du thymus modèle de lymphome des cellules T ( <strong&gt; Figure 4B). Enfin, nous avons présenté les protocoles de l&#39;exécution des télomères FISH sur FFPE tissus cérébraux de souris (figure 5) et les chromosomes en métaphase (figure 5, médaillon). <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/52599/52599fig1.jpg" /> Figure 1: (A) mTERT-ER knock-in stratégie. TV, vecteur de ciblage; WT, allèle sauvage; KI, knock-in allèle; LA, le bras gauche; RA, bras droit; E1, exon 1; E2, l&#39;exon 2; néo, pgk promoteur-gène de résistance à la néomycine entraînée; ER, récepteur des oestrogènes modifié (ERT2) ligand domaine de liaison; DT, dyphteria gène de la toxine. (B) LSL-mTERT stratégie knock-in. TV, vecteur de ciblage; WT, allèle sauvage; KI, knock-in allèle; LA, le bras gauche; RA, bras droit; E1, exon 1; E2, l&#39;exon 2; néo, pgk promoteur-gène de résistance à la néomycine entraînée; STOPPER, trois séquences d&#39;arrêt de la transcription répétitives; DT, dyphteria gène de la toxine. <pclass = &quot;jove_content&quot; fo: keep-together.within-page = &quot;always&quot;&gt; <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/52599/52599fig2.jpg" /> Figure 2: Les données représentatives pour afficher télomérase réactivation améliore phénotypes dégénératives des organes représentatifs des images de cerveaux (à gauche). et les testicules (à droite) de souris G0 et G4 mTERT-ER traités avec un placebo ou 4-OHT pendant 4 semaines. Barres d&#39;échelle indiquent 50 um. Re-print avec la permission de 20. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52599/52599fig2large.jpg" target="_blank">Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <img alt="Figure 3" src="/files/ftp_upload/52599/52599fig3.jpg" /> Figure 3:. Les données représentatives de montrer une réactivation de la télomérase améliore l&#39;auto-renouvellement et la neurogenèse de cellules souches neurales in vitro (A) images représentatifs de cellules souches neuraless isolé du G4 LSL-mTERT (panneau supérieur) et G4 mTERT-ER (panneau inférieur) de plus en plus dans le milieu de cellules souches traités avec le véhicule ou 4-OHT. (B) des images représentatives de la neurogénèse in vitro (Tuj1 +) des cellules souches neurales isolées à partir G4 mTERT-ER cultivées dans un milieu de différenciation (avec 1% de FBS) traités avec le véhicule ou 4-OHT. Barres d&#39;échelle indiquent 100 um. <img alt="Figure 4" src="/files/ftp_upload/52599/52599fig4.jpg" /> Figure 4:. Les données représentatives pour montrer une réactivation de la télomérase améliore la tumorigenèse dans le contexte de l&#39;instabilité génomique (A) des images représentatives de tumeurs de la prostate disséqués à partir G0 PB-Cre4 Pten L / L p53 L / L LSL-mTERT +/-, G4 PB Cre4 Pten L / L p53 L / L LSL-mTERT- / -, Et G4 PB-Cre4 Pten L / L p53 L / L LSL-mTERT L / L traitées par le tamoxifène. Re-imprimer avec la permission de 22. (B) des images représentatives de lymphomes à cellules T thymiques disséqués à partir G0 Atm - / - mTERT + / ER, G4 Atm - / - mTERT ER / ER traités avec le véhicule, et G4 Atm - / - mTERT ER / ER traité avec 4- OHT pendant 8 semaines. Barres d&#39;échelle indiquent une cm. <img alt="Figure 5" src="/files/ftp_upload/52599/52599fig5.jpg" /> Figure 5: images représentatifs de télomérique et FISH centromérique sur les tissus du cerveau de la souris et FFPE métaphase (en médaillon). Le rouge indique l&#39;ADN, le vert indique télomères coloration, et cyan indique CEntromere coloration. Barres d&#39;échelle indiquent une mm.

<classe p='jove_content'>télomère et la télomérase jouent un rôle essentiel dans le vieillissement et la tumorigenèse. L’objectif de ce protocole est de montrer comment générer deux allèles knock-in de télomérase inductibles chez la souris et comment les utiliser dans les études de dégénérescence/régénération tissulaire et de cancer.

Utilisant murin inductible télomérase allèles dans les études de la dégénérescence des tissus / Régénération et cancer

Telomere dysfunction-induced loss of genome integrity and its associated DNA damage signaling and checkpoint responses are well-established drivers that ...

L’objectif global de l’expérience suivante est de manipuler deux allèles de frappe de mase inductibles murins in vivo et in vitro pour des études de dégénérescence et de régénération tissulaires et des études de cancer. Ceci est réalisé en implantant des comprimés d’hydroxy tamoxifène dans des animaux pour réactiver le mase in vivo. Dans un deuxième temps, des cellules souches neurales sont isolées d’animaux qui sont ensuite traités avec de l’hydroxy tamoxifène pour réactiver la mase in vitro.Ensuite, la fluorescence des télomères dans l’hybridation C deux ou le poisson est effectuée à la fois sur des cellules cultivées et des tissus cérébraux formels et fixés inclus dans la paraffine afin de vérifier l’activité de la mase. Les résultats ont montré que les traitements à l’hydroxy-tamoxifène peuvent réactiver de manière robuste l’activité du mase, ce qui peut à la fois atténuer les phénotypes de vieillissement et favoriser la formation de tumeurs sur la base d’un examen histopathologique. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans les domaines du vieillissement et du cancer, telles que la question de savoir si nous pouvons ralentir le processus de vieillissement en modulant l’activité des traumatismes TH, ou comment cibler spécifiquement Thomas pour traiter le cancer.La démonstration de cette procédure sera faite par l’instructeur Dr. Takashi Shingu et un technicien April Un de mon laboratoire. Commencez cette procédure par la génération de la tourte ER et verrouillez les verrous verrous des allèles de tourte comme décrit dans le protocole de texte, stérilisez tous les outils chirurgicaux avant l’injection procédez à l’anesthésie des souris comme décrit dans le protocole de texte. Une fois l’anesthésie profonde atteinte, retirez l’animal anesthésié de la chambre d’induction et gardez sa tête à l’intérieur du tube relié à la chambre iso-fluoré.Pincez les coussinets des pieds des souris pour vous assurer que l’animal est profondément anesthésié. Mettez également de la pommade sur les deux yeux Afin d’éviter que les yeux ne s’étirent, essuyez le dos des souris avec une solution de povidone iodée. Ensuite, injectez une pastille d’hydroxy tamoxifène à libération lente avec un trocart de précision sous la peau du dos.Et poussez le plomb jusqu’à la ligne médiane entre deux épaules. Scellez l’incision à l’aide d’un applicateur de pince à plaie et surveillez les souris pour qu’elles se rétablissent. Pour l’anesthésie.Retirez les cerveaux de souris d’un jour et conservez les quatre cerveaux en retirant les bulbes olfactifs et le cervelet. Conservez les quatre tissus cérébraux dans un millilitre de milieu de culture froid et conservez-les à quatre degrés Celsius. Assurez-vous de traiter le tissu neural dans l’heure.Déterminez le poids du tissu pour vous assurer que la limite de 400 milligrammes par digestion n’est pas dépassée. Placez le cerveau sur le couvercle d’une boîte de Pétri de 35 millimètres de diamètre et écrasez le cerveau à l’aide d’un scalpel. À l’aide d’une pointe de pipette d’un millilitre, ajoutez un millilitre de solution saline équilibrée de Hank ou HBSS.Ensuite, pipetez les morceaux dans un tube de 15 millilitres après avoir rincé avec une centrifugeuse HBSS à 300 fois G pendant deux minutes à température ambiante. Après avoir soigneusement retiré le surnageant, ajoutez 1 950 microlitres d’enzyme préchauffée. Mélangez-en un pour jusqu’à 400 milligrammes de tissu.Incuber l’échantillon dans le tube de 15 millilitres pendant 15 minutes à 37 degrés Celsius. Mélangez l’échantillon en inversant ou en secouant le tube toutes les cinq minutes. Préparez ensuite 30 microlitres d’enzyme Mélangez deux par échantillon de tissu en ajoutant 20 microlitres de solution, trois à 10 microlitres de solution quatre.Ajoutez-le ensuite à l’échantillon, en inversant doucement pour mélanger, dissociez mécaniquement le tissu à l’aide d’une pipette à pâte polie au feu à pointe large en pipetant de haut en bas 10 fois, en évitant lentement la formation de bulles d’air. Incuber à 37 degrés Celsius pendant 10 minutes, en inversant le tube toutes les trois minutes. Ensuite, appliquez la suspension cellulaire dans une crépine de 70 microns placée sur un tube de 50 millilitres.Appliquez 10 millilitres de solution saline tamponnée au phosphate ou PBS à travers la passoire cellulaire. Ensuite, jetez la crépine cellulaire et centrifugez la suspension cellulaire à 300 fois G pendant 20 minutes. Réglez la température ambiante après la centrifugation et aspirez complètement le surnageant.Remettre les cellules en suspension avec un milieu de cellules souches au volume requis pour d’autres applications afin d’activer le téléréseau dans les serrures, d’arrêter les serrures. Cellules souches neurales de Tourt. Traitez les cellules avec 100 micromolaires d’hydroxy tamoxifène pendant deux jours pour activer les cellules souches neurales de l’émase et de la turtique.Conservez les cellules dans un milieu de culture avec 100 micromolaires d’hydroxy tamoxifène pour effectuer des télomères de poisson. Tout d’abord, préparez les chromosomes de métaphase à partir de cellules cultivées pour des coupes de tissus fixés au formol et inclus en paraffine ou FFPE. Dépariser l’échantillon dans du xylène et le réhydrater dans une série d’éthanol pendant cinq minutes chacune et dans du PBS pendant cinq minutes.Ensuite, postfixez les sections dans un rapport de trois pour un de méthanol à acide acétique pendant une à deux heures. Déshydratez les sections dans une série d’éthanol froid pendant cinq minutes chacune et lavez-les à l’air libre dans un XPBS à 37 degrés Celsius pendant cinq minutes. Ensuite, dans la nature, les chromosomes sont à 4 % de formaldéhyde à 37 degrés Celsius pendant deux minutes.Déshydratez les sections d’une série d’éthanol froid comme précédemment et séchez-les à l’air libre une fois secs, appliquez 12 à 25 microlitres du mélange d’hybridation d’acides nucléiques peptidiques sur chaque lame. Scellez la lamelle avec de la colle de caoutchouc, en plaçant les préparations chromosomiques naturelles et les coupes de tissus à 80 degrés Celsius pendant quatre minutes. Ensuite, hybridez à température ambiante ou à 37 degrés Celsius pendant deux à quatre heures dans une chambre humide.Ensuite, lavez deux fois les échantillons à température ambiante avec un tampon de lavage pendant 15 minutes. Ensuite, lavez-les à température ambiante pendant cinq minutes avec du PBS et tween 23 fois. Enfin, contre-colorez les lames avec DPI ou fluorescence rouge lointain pour un examen microscopique.Lorsque les télomères ont été réactivés transitoirement chez des souris dysfonctionnelles de télomères, les phénotypes dégénératifs ont pu être améliorés dans plusieurs organes tels que le cerveau et les testicules pour déterminer l’impact de la réactivation des télomères sur les cellules. Des cellules souches neurales neurales cultivées in vitro ont été isolées à partir de souris de dernière génération G à quatre verrous, TURT et G à quatre tourtes ER. Lorsque les télomères ont été réactivés dans les cellules souches neurales dysfonctionnelles des télomères, la capacité d’auto-renouvellement a été considérablement augmentée.La neurogenèse in vitro a également été significativement améliorée pour déterminer l’impact de la réactivation de mase sur la tumorgenèse dans le contexte du dysfonctionnement des télomères, la réactivation de mase par traitement au tamoxifène a été réalisée dans un modèle de tumeur de la prostate. Modèle de lymphome T endotthique. Le traitement a permis d’améliorer considérablement la tumorgenèse dans les deux modèles.Enfin, l’étude des télomères a été réalisée sur des tissus FFPE, des tissus cérébraux de souris et des chromosomes en métaphase. Sur ces images, le rouge indique la coloration de l’ADN, le vert indique la coloration des télomères et le cyan indique la coloration des centromères. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’activer l’activité traumatique dans les serrures mTOR ER et les serrures d’arrêt, les animaux et les lignées cellulaires mTOR, et comment les utiliser pour étudier vos questions sur le cancer et l’agent.

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La capacité de marquer de façon permanente les cellules souches et leur descendance avec un fluorophore à l’aide d’une lignée transgénique inductible traçant la lignée de souris permet une analyse spatiale et temporelle de l’activation, de la prolifération, de la migration et / ou de la différenciation in vivo. Le traçage de la lignée peut révéler de nouvelles informations sur l’engagement de la lignée, la réponse aux interventions et la multipotence.

Traçage de la lignée des cellules souches inductibles marquées par fluorescence dans le cerveau de souris adulte

Cet article décrit un protocole détaillé pour produire un endomètre mince fiable et reproductible avec un taux de mortalité très faible et des adhérences intra-utérines minimales en injectant de l’éthanol à 95 % dans l’utérus de la souris en 1 à 3 minutes.

Etablissement d’un modèle murin d’endomètre mince

Ce protocole décrit les méthodes de culture, de manipulation et d’analyse des CAF murins, y compris les essais fonctionnels in vitro/in vivo , la transcriptomique et l’analyse informatique. De plus, il décrit une plate-forme Web développée pour analyser les transcriptomes accessibles au public de composants stromaux et épithéliales micro-disséqués par capture laser à partir d’une collection de tumeurs cancéreuses du sein humain.

Fibroblastes associés au cancer provenant de tumeurs mammaires de souris comme outils pour les études moléculaires et computationnelles

Découvrez la génération d'allèles de télomérase inductibles chez la souris pour étudier la dégénérescence tissulaire, la régénération et le cancer. Cette méthode utilise l'hydroxytamoxifène pour réactiver la télomérase in vivo et in vitro.

Utilisant murin inductible télomérase allèles dans les études de la dégénérescence des tissus / Régénération et cancer

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