Évaluation fonctionnelle et morphologique de membrane innervation par phrénique motoneurones

L’objectif global de cette procédure est d’évaluer quantitativement l’innervation fonctionnelle et morphologique du diaphragme par les motoneurones phréniques de la moelle épinière cervicale. Ceci est accompli en effectuant un enregistrement du potentiel d’action musculaire composé à partir du diaphragme hémisphérique chez des animaux anesthésiés après une stimulation supra-maximale du nerf phrénique ipsilatéral. La prochaine étape consiste à effectuer une immunohistochimie du diaphragme entier pour évaluer morphologiquement l’innervation des jonctions neuromusculaires individuelles.

En fin de compte, la combinaison du potentiel d’action musculaire composé et des analyses des jonctions neuromusculaires fournit une approche puissante pour l’étude quantitative de l’innervation diaphragmatique dans des modèles de rongeurs du SNC et du SNP. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine des lésions de la moelle épinière, telles que les interventions thérapeutiques peuvent-elles être utilisées pour restaurer avec succès la fonction diaphragmatique ? Les implications de cette technique s’étendent à la thérapie de maladies telles que les lésions traumatiques de la moelle épinière et l’ILS, car la fonction respiratoire diaphragmatique joue un rôle clé dans l’évolution des patients dans ces deux affections débilitantes. et Tamara Holla, technicienne de recherche dans mon laboratoire.

Après avoir anesthésié l’animal, placez-le sur la planche chirurgicale, côté dorsal vers le bas et fixez les membres antérieurs à la planche. Rasez ensuite la surface ventrale de la base du crâne vers l’abdomen des deux côtés de la ligne médiane. Une fois la peau nettoyée, positionnez les électrodes et fixez le sol à la queue et placez l’électrode de référence dans le bas-ventre controlatéral par voie sous-cutanée.

L’électrode d’enregistrement doit être préparée avec un gel conducteur sur la partie autocollante, puis fixée le long de la marge costale unilatérale. Placez maintenant les électrodes de stimulation, transcutanées à un demi-centimètre de distance, latérales à la trachée et supérieures à la clavicule. Ils doivent entrer perpendiculairement à la peau et aller à environ un centimètre de profondeur.

Ces électrodes doivent être bien fixées, de préférence faites à la main. Fixez toutes les électrodes à leurs stimulateurs et amplificateurs appropriés. Les données collectées doivent être enregistrées sur un ordinateur.

Pour l’analyse, réglez les paramètres de stimulus de la stimulation unipolaire sur 0,5 milliseconde, une impulsion super maximale d’un hertz. L’amplitude peut varier de six à huit volts. Réglez le temps de stimulation de l’intérêt à 30 secondes et faites la moyenne de la réponse à partir de 10 stimulations consécutives en utilisant l’enregistrement de l’amplitude de base à l’amplitude maximale de chaque animal environ une fois par semaine si vous le souhaitez.

La manipulation des animaux est détaillée dans le protocole texte. Après avoir euthanasié un animal à l’aide d’une surdose d’anesthésie injectable, effectuez une laparotomie à l’aide d’un scalpel ou de ciseaux. Faites une incision du processus xiphoïde de manière cochonnelle le long de la ligne médiane.

Ensuite, à l’aide d’un scalpel et d’une pince, séparez soigneusement la peau et le tissu conjonctif de la musculature. Retirez le diaphragme en tirant vers le haut le processus xiphoïde et en découpant le diaphragme de l’os environnant. Veillez à ne pas endommager le muscle du diaphragme.

Transférez le diaphragme du côté supérieur vers le haut dans une boîte en silicone remplie de 4 % d’aldéhyde paraforme dans du PBS sous un stéréoscope. Épinglez le tissu entourant le diaphragme, en étirant le diaphragme tendu. Retirez ensuite le tissu conjonctif de la surface supérieure à l’aide de pinces et de ciseaux.

Laissez le fixateur agir pendant 20 minutes, puis retirez-le à l’aide de trois lavages de 10 minutes dans du PBS. Ensuite, appliquez 0,1 molaire de glycine avec 2 % BSA dans du PBS pendant 30 minutes. Ensuite, incubez le diaphragme dans la solution conjuguée alpha bungalow toin Domine pendant 15 minutes.

Lavez la toxine du bungalow avec du PBS comme pour le fixateur. Ensuite, changez le bain en méthanol froid et refroidissez le mouchoir pendant cinq minutes à moins 20 degrés Celsius. Après cinq minutes rapidement, retirez le méthanol et lavez le mouchoir avec du PBS comme auparavant.

Maintenant, appliquez un bloc en utilisant une solution à 0,2 % TBP pendant une heure. Changez la solution pour l’anticorps primaire dans 0,2 % de TBP et laissez le tissu incuber pendant la nuit à quatre degrés Celsius avec une légère agitation. Le lendemain, utilisez trois lavages de 10 minutes dans du TBP à 0,2 % pour éliminer l’anticorps primaire, puis incubez le tissu dans la solution d’anticorps secondaires pendant une heure à bascule et dans l’obscurité plus tard, utilisez trois lavages dans du PBS pour éliminer l’anticorps secondaire et gardez le tissu dans l’obscurité.

Ensuite, sous un stéréoscope, retirez plus de tissu conjonctif sur la surface supérieure du muscle. Une fois nettoyé de la monture et imagez le tissu sous un microscope à épifluorescence vertical, analysez quantitativement la morphologie du diaphragme hémisphérique coloré. Utilisez un grossissement de 20 et 40 x car le diaphragme est analysé comme une monture entière.

La plupart des colorations fluorescentes sont floues. À l’aide d’un microscope standard, il est préférable d’effectuer l’analyse en temps réel. Afin d’évaluer correctement la morphologie de l’individu NM js, divisez le muscle en trois sections pour une analyse basée sur les modèles d’innervation topographiques de la moelle épinière.

En commençant par la région de la plupart des ventres, analysez tous les njs visibles le long des fibres musculaires n’analysez pas plus profondément que les trois à quatre premières fibres de la surface car la pénétration des anticorps n’est jamais complète. Un NMJ intact a un axone préterminal qui est épais et toutes les régions de la terminaison nerveuse chevauchent complètement les récepteurs musculaires sous-jacents de l’acétylcholine. Une JNM partiellement dénervée aura certaines régions des récepteurs sous-jacents de l’acétylcholine inoccupées.

Une JNM complètement dénervée ne montrera aucune correspondance avec les récepteurs de l’acétylcholine à la terminaison nerveuse. D’autres njs de la région devraient présenter une autre morphologie ou le succès des anticorps La pénétration serait remise en question si plus d’un axone préterminal innerve un NMJ. Le NMJ se multiplie.

Une dénervation innervée peut s’être produite dans ce cas, suivie d’une réinnervation. S’il y a chevauchement à la terminaison nerveuse avec les récepteurs sous-jacents de l’acétylcholine et que l’axone préterminal est très mince, alors le NMJ est finement innervé. C’est aussi une indication de réation.

Dans une expérience impliquant une entorse adulte, des rats témoins Dolly ont reçu une laminectomie tandis que d’autres ont reçu une lésion médullaire unilatérale par contusion hémitive. À C quatre. Cinq semaines plus tard, l’amplitude maximale de cmap a été enregistrée à partir du diaphragme hémisphérique ipsilatéral jusqu’au site de laminectomie ou de blessure.

Il a été significativement réduit chez les rats LME par rapport aux rats témoins de laminectomie uniquement dans une expérience différente impliquant des rats exprimant une protéine humaine mutée, donc D une protéine pour servir de modèle d’un LS. La morphologie NMJ dans le diaphragme hémisphérique était complètement intacte chez les animaux témoins de type sauvage. Cependant, chez les rats transgéniques, le NJS a montré une pathologie significative. Certains présentaient une dénervation complète marquée par la pointe de la flèche.

D’autres njs étaient partiellement dénervés comme marqué par la pointe de flèche, et comme on le voit dans le NMJ à droite, d’autres njs étaient innervés à plusieurs reprises, et d’autres avaient de minces axones pré-terminaux ici marqués d’une pointe de flèche. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’évaluer quantitativement l’innervation fonctionnelle et morphologique du diaphragme par les motoneurones phréniques. Merci d’avoir regardé et bonne chance dans toutes vos expériences.