Name: Évaluation fonctionnelle et morphologique de membrane innervation par phrénique motoneurones (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-05-25T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 43 s
Description: Découvrez l'évaluation fonctionnelle et morphologique de l'innervation diaphragmatique par les motoneurones phréniques chez les rongeurs. Cette méthode combine l'enregistrement du potentiel d'action musculaire et l'immunohistochimie pour étudier les lésions de la moelle épinière.

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Ce travail a été soutenu par le NINDS (subvention #1R01NS079702 à A.C.L.) et le programme SURP de l’Université Thomas Jefferson (M.M.).

Les procédures expérimentales ont été approuvés par le comité de l&#39;Université Thomas Jefferson de protection des animaux et de l&#39;utilisation et menées en conformité avec la directive Communautés européennes Conseil (2010/63 / UE, 86/609 / CEE et 87-848 / CEE), le NIH Guide pour la les soins et l&#39;utilisation des animaux de laboratoire, et la Société pour les politiques de Neuroscience sur l&#39;utilisation d&#39;animaux dans la recherche en neurosciences. 1. Les potentiels d&#39;action composé de Muscle (CMAP) <ol><li> Préparation de l&#39;animal: <ol><li> Anesthésier le rat en utilisant un inhalant (isoflurane) à 1-2% livrés à effet ou par injection (kétamine, xylazine, acépromazine). Dosage de l&#39;anesthésie injectable est la suivante: 95,0 mg / kg de kétamine, 10,0 mg / kg de xylazine, 0,075 mg / kg de l&#39;acépromazine. NOTE: Nous utilisons avec succès à la fois inhalées et anesthésique injectable approches lors de la conduite de ce protocole d&#39;enregistrement CMAP, sans préférence. </li><li> L&#39;animal doit être maintenue à l&#39;une appropriéenesthetic profondeur avant la chirurgie est commencé, grâce à la conclusion de la chirurgie, et jusqu&#39;à ce que la buprénorphine post-opératoire a pris effet. Confirmez anesthésie appropriée par un bref pincement de l&#39;orteil pour déterminer qu&#39;une réponse de retrait n&#39;a pas suscité. En outre, de tester le réflexe cornéen avec un coton-tige. Tout au long de la procédure chirurgicale, déterminer que la fréquence cardiaque et la fréquence respiratoire ont pas augmenté, ce qui suggère que profondeur de l&#39;anesthésie est devenue trop léger. </li><li> Appliquer une pommade vétérinaire sur les yeux de l&#39;animal pour prévenir la sécheresse tandis que sous anesthésie. </li><li> Le chirurgien doit la laver / ses mains avec un désinfectant (chlorhexidine gommage) avant de commencer la chirurgie. Le chirurgien doit porter des gants stériles, masque et blouse ou un sarrau propre. Tous les instruments doivent être lavés et stérilisés à l&#39;autoclave avant la chirurgie. Ajouter une bande d&#39;indicateur de stérilisation à l&#39;intérieur du kit de bord avant passage à l&#39;autoclave, au niveau des instruments pour vérifier que la stérilisation est terminée. Le chirurgien doitvérifiez que l&#39;ensemble de la ligne sur la bande est noir avant de commencer la chirurgie. Collez l&#39;extérieur de la boîte avec du ruban autoclave indiquant ainsi. Si la chirurgie doit être réalisée sur plusieurs animaux le jour même, le nettoyage des instruments entre les chirurgies et stériliser dans un stérilisateur à billes de verre. Si nécessaire, stériliser les deux extrémités de l&#39;instrument dans le stérilisateur à billes de verre en plaçant la poignée de l&#39;instrument dans le stérilisateur pendant le temps approprié, la suppression de l&#39;instrument avec une pince hémostatique stérile, en le refroidissant dans un champ stérile, puis en plaçant l&#39;extrémité fonctionnelle de l&#39;instrument dans le stérilisateur à billes de verre pour la période de temps appropriée. </li><li> Une fois que l&#39;animal est anesthésié, lieu à bord chirurgicale avec la surface dorsale vers le bas et vers le haut de l&#39;abdomen de sorte que la bande peut être utilisé pour sécuriser les pattes avant de l&#39;animal à bord chirurgicale. </li><li> Rasez ventrale caudale de la surface à partir de la base du crâne, et veiller à ce que la zone autour de l&#39;abdomen de chaque côté de la ligne médiane est shAved selon hémi-diaphragme qui est en cours d&#39;enregistrement. Appliquer la povidone-iode à la surface rasée de la peau. </li></ol></li><li> Préparation pour les enregistrements CMAP: <ol><li> Après la préparation des animaux, placer l&#39;électrode de terre sous-cutanée dans la queue (Figure 1). </li><li> Placez la voie sous-cutanée de l&#39;électrode de référence dans la région inférieure de l&#39;abdomen controlatéral. </li><li> Placez gel conducteur sur la bande de surface auto-adhésive ou électrode d&#39;enregistrement de disque (dimensions de surface électrode en bande: 0,5 x 3 cm), puis placer l&#39;électrode de surface transversalement le long du rebord costal unilatérale. </li><li> Placez électrodes de stimulation transcutanée 0,5 cm en dehors de la trachée et latérales supérieures à la clavicule. Insérer les électrodes d&#39;environ 1,0 cm de profondeur à travers la peau. Fixez les électrodes à la main de sorte que leur emplacement ne se déplace pas avec stimulations ultérieures. NOTE: Angle électrodes 90 ° par rapport à la peau au niveau du site de stimulation insertion. </li></ol></li><li> Composé Muscle potentiel d&#39;action (CMAP) Enregistrements: <ol><li> Obtenir des enregistrements électrophysiologiques en utilisant un stimulateur / amplificateur suivi d&#39;analyse assistée par ordinateur des données. </li><li> Les paramètres de stimulation de stimulation de traction unique devraient être de 0,5 ms, 1,0 Hz impulsions supramaximales. L&#39;amplitude du stimulus doit être compris entre 6,0 et 8,0 V (figure 2A). REMARQUE: Dans une expérience, en utilisant une intensité de stimulation avec la même amplitude sur les animaux. L&#39;objectif est de maximiser l&#39;amplitude de la réponse à l&#39;aide de l&#39;amplitude minimale de stimulation. Il est important de noter que la réaction initiale qui se produit au moment de la stimulation est un artefact de stimulation. En outre, il faut prendre soin d&#39;obtenir une réponse CMAP qui est précédé par une ligne de base stable / plat après l&#39;artefact de stimulation, qui est ensuite suivie par la réponse rapide CMAP. Afin d&#39;obtenir une telle réponse, il peut être nécessaire de repositionner la stimulation et / oudes électrodes d&#39;enregistrement. </li><li> Attendre 30 secondes entre les stimulations, et répétez 10 stimulations dans une rangée pour obtenir la réponse moyenne (Figure 2B - C). Mesurer l&#39;amplitude du départ à la crête (figure 2A). Mener la stimulation du nerf phrénique pendant la phase de cycle respiratoire de l&#39;animal lorsque le nerf phrénique / diaphragme est pas activé. La procédure peut être répétée sur le même animal pour l&#39;hémi-diaphragme controlatéral. </li><li> Après la dernière session d&#39;enregistrement de CMAP, perfuser l&#39;animal si NMJ coloration sera réalisée. Effectuer enregistrements CMAP à plusieurs reprises sur le même animal environ une fois par semaine (ou à intervalle de choix). </li><li> Après survie enregistrements CMAP, permet animal à récupérer sur un coussin chauffant de l&#39;eau chaude circulant et surveillent continuellement lors de la récupération jusqu&#39;à couché éveillé et sternally. Ne retournez pas un animal qui a subi une intervention chirurgicale à la compagnie d&#39;autres animaux jusqu&#39;à guérison complète. &lt;/ Li&gt; <li> Une fois sternally couché, surveiller l&#39;animal toutes les 12 heures pendant les 48 premières heures (une fois par jour par la suite). Si l&#39;animal semble être déshydraté (peau flasque, apathie), administrer des fluides (solution de sonneurs lactate; sous-cutanée; 1-2 ml par injection, avec les sites rotation; 2 fois par jour) jusqu&#39;à poids post-chirurgicale et de la perte de liquide stabilise. Fournir des animaux avec de la nourriture ramollie dans de petits plats durant la période post-opératoire aiguë si nécessaire pour encourager manger si elles ne peuvent pas atteindre le chargeur fil barre de couvercle. </li><li> Administrer la buprénorphine à une dose de 0,05 mg / kg avant la fin de la chirurgie, puis à intervalles de 12 h pour les 24 premières heures (et dépend des signes de douleur / le stress par la suite) par injection sous-cutanée (site de rotation). Si des signes de douleur ou de détresse sont remarqués par la suite, traiter les animaux avec la buprénorphine. Signes distinctifs de la douleur / détresse comprennent le manque d&#39;activité, vocalisations, absence de manger ou de boire (déshydratation), perte de poids excessive, gardiennage, excessif rongeant ou en grattant site d&#39;incision. Des critères supplémentaires utilisées dans la détermination de la douleur et de la détresse comprennent l&#39;absence de réponse à des stimuli externes, la vocalisation transitoire ou non provoquée, respiration laborieuse ou anormale, décharge naso-oculaire brun rougeâtre persistante, horripilation marquée. Surveiller également des preuves d&#39;une mauvaise hygiène qui suggérerait animaux malades. Si l&#39;animal est toujours observée en détresse après 72 heures de traitement (selon les critères douleur / de stress décrire ci-dessus, et après avoir reçu le protocole analgésique décrit ci-dessus) euthanasier l&#39;animal. </li></ol></li></ol> 2. Diaphragme jonction neuromusculaire (JNM) Analyse <ol><li> Dissection des animaux: <ol><li> Administrer l&#39;animal une surdose de l&#39;anesthésie injectable (3 fois la dose utilisés ci-dessus: la kétamine à 285,0 mg / kg, xylazine à 30,0 mg / kg, l&#39;acépromazine à 0,225 mg / kg; administré par voie intrapéritonéale). Après un surdosage, tous les animaux devraient avoir une deuxième méthode d&#39;euthanasie (thoracotomie) to garantir la mort. Mort devrait être confirmée par l&#39;observation de l&#39;arrêt cardiaque et respiratoire et en notant les pupilles fixes et dilatées de l&#39;animal. </li><li> Mener une laparotomie avec scalpel ou des ciseaux de dissection étendant l&#39;excision du processus zyphoid caudale le long de la ligne médiane. Soigneusement séparer la peau et du tissu conjonctif du muscle sous-jacent en utilisant scalpel et pince. </li><li> En tirant sur le processus zyphoid, utiliser des ciseaux de dissection pour enlever toute la membrane, veiller à ce que la membrane reste attaché à l&#39;os environnant. Ceci est important car elle permet d&#39;éviter d&#39;endommager le muscle du diaphragme, permettra pour la dissection succès de l&#39;ensemble du diaphragme et aidera dans le muscle de nettoyage pour coloration subséquente. NOTE: A ce stade, l&#39;animal peut être perfusé si nécessaire. </li></ol></li><li> Nettoyage et coloration de la membrane: <ol><li> Cerner l&#39;ensemble disséqué diaphragme, la surface supérieure vers le haut, au caoutchouc de silicone dans un verre plat de 100 mm Petri dansParaformaldéhyde 4% (en fait 1% de phosphate saline tamponnée - PBS) pendant 20 min en utilisant un stéréomicroscope. Étirez le diaphragme pour le rendre tendu, et en utilisant des épingles insectes, épingler le tissu environnant pour éviter épinglant le diaphragme muscle lui-même (Figure 3). </li><li> Nettoyer délicatement le tissu conjonctif à partir de seulement la surface supérieure du muscle avec # 5 forceps et de petits ciseaux. REMARQUE: Effectuer toutes les étapes ultérieures de ce protocole de coloration bascule lentement à température ambiante couvert de la lumière, sauf indication contraire. Assurez-vous que le muscle du diaphragme est toujours complètement immergé dans un liquide pour éviter le dessèchement. </li><li> Avant la coloration, préparer tous les réactifs nécessaires: 1x PBS, 2% d&#39;albumine de sérum bovin (BSA) / PBS, 0,1 M de glycine réalisés dans 2% de BSA / PBS, 4% de paraformaldehyde (PFA) dans 1 x PBS et 0,2% de phosphate de tributyle (0,2 % de Triton X100 à 2% de BSA / PBS). Soyez sûr d&#39;effectuer une pré-cool méthanol à -20 ° C. </li><li> Laver 3x pendant 10 minutes dans du PBS 1x. </li><li> Incuber dans 0,1 M de glycine (fait en 2% De BSA / PBS) pendant 30 min. </li><li> Incuber dans RBTX (rhodamine conjugué α-bungarotoxine) solution pendant 15 min. Solution pour RBTX est le suivant: alpha-bungarotoxine Rhodamine conjugué 1: 400 dilution en PBS 1x. REMARQUE: Dans ce protocole, la rhodamine est utilisé, mais n&#39;importe quel fluorophore de choix peut être utilisée pour la coloration. </li><li> Laver 3x pendant 10 minutes dans du PBS 1x. </li><li> Dans congélateur à -20 ° C, incuber avec du MeOH pendant 5 min. NOTE: Ne pas ajouter MeOH avant de placer musculaire dans le congélateur, et retirer immédiatement solution suivante de la période d&#39;incubation. </li><li> Laver 3x pendant 10 minutes dans du PBS 1x. </li><li> Bloquer dans 0,2% TBP pendant 1 heure (0,2% de Triton faite dans 2% de BSA / PBS). </li><li> Incuber avec une solution d&#39;anticorps primaire (dans 0,2% de TBP) à 4 ° C pendant une nuit tout en balançant. Dilutions d&#39;anticorps comme suit: SV2 (1:10) et SMI-312 (1: 1000). </li><li> Laver 3x pendant 10 minutes avec 0,2% de TBP. </li><li> Incuber avec l&#39;anticorps secondaire à l&#39;aide dilution 1: 100 de FGM1 (chèvre conjugué à FITC anti-souris IgG1; faite dans 0,2% TBP) en basculant pendant 1 heure. REMARQUE: Protéger de la lumière pour le reste du protocole pour la coloration. </li><li> Laver 3x pendant 10 minutes avec PBS 1x. </li><li> Re-propre tissu conjonctif environnant sur le supérieur (voir ci-dessus) la surface du muscle avant le montage et lamelles. NOTE: Il est recommandé de nettoyer puis monter l&#39;échantillon immédiatement après la coloration. Cependant, si nécessaire, l&#39;échantillon peut être couverte en PBS 1x, enveloppé dans du parafilm pour éviter l&#39;évaporation et stockée à 4 ° C pendant 1 semaine, avec changement de PBS par jour. </li><li> Lors du montage sur lame de verre, lamelle avec les non-hardset Vectashield. Sceller les bords de la lamelle avec du vernis à ongles transparent pour éviter le dessèchement. Stocker les lames couchées dans des dossiers de diapositives en carton à -20 ° C pour le long terme. </li></ol></li><li> Analyse et imagerie confocale: <ol><li> Analyser quantitativement la morphologie de la teinté et monté hémidiaphragme sous 20X et 40X en utilisant une épifluorescence deboutmicroscope. NOTE: Parce que la membrane est colorée et analysé en tout-monter un mode, le muscle est assez épais. Par conséquent, plus de la coloration de fluorescence est complètement hors de mise au point lorsqu&#39;une image statique est prise en utilisant la microscopie de fluorescence non-confocale. Pour cette raison, il est préférable de procéder à l&#39;analyse NMJ en temps réel sur le microscope, car cela permet de vous concentrer constamment «haut» et «bas» à travers le muscle de bien identifier la morphologie de chacun des NMJs individuels. En utilisant cette approche, on peut facilement suivre la trajectoire des axones moteurs individuels comme ils se déplacent à travers le tissu en relation spatiale avec les amas de récepteurs post-synaptiques. </li><li> En mesurant la longueur ventrale-à-dorsale du muscle, il faut diviser le muscle en 3 sections distinctes pour les analyses fondées sur des motifs d&#39;innervation topographiques de niveaux spécifiques de la moelle épinière (Figure 4H). </li><li> Commençant à la région ventrale du muscle et moving dorsale, analyser toutes en NMJs visage situés sur les fibres musculaires de surface. Ne pas analyser fibres musculaires plus profondes que les 3-4 premières fibres de la surface comme l&#39;interprétation peut être difficile en raison de moins bonne pénétration des anticorps (RBTX pénètre plus profondément dans le muscle en raison de la petite taille de la toxine par rapport aux grandes anticorps utilisés pour marquer les neurones). </li><li> Identifier chaque NMJ comme intacte si l&#39;axone pré-terminale du neurone est épaisse de diamètre et de toutes les régions de la terminaison nerveuse chevauchent complètement avec les récepteurs de l&#39;acétylcholine des muscles sous-jacents (CCRS). </li><li> Identifier chaque NMJ comme partiellement dénervé si aucune région des AChR musculaires sous-jacents est inoccupé avec terminaison nerveuse correspondant. </li><li> Identifier chaque NMJ aussi complètement dénervé si les AChR musculaires avoir aucune terminaison nerveuse correspondant (il est également important d&#39;avoir d&#39;autres NMJs avec neurones marqués dans le même domaine de concentration, de sorte que l&#39;on peut être sûr que le manque de terminaison nerveuse est pas simplement due à cacar de pénétration des anticorps dans cette région du muscle). </li><li> Identifier chaque NMJ que se multiplient innervé si il ya plus d&#39;un pré-terminale axone innervant un NMJ individu (ce qui indique qu&#39;il ya eu un certain niveau de dénervation et les tentatives probables de réinnervation à cette jonction). </li><li> Identifier chaque NMJ aussi finement innervés si le NMJ a chevauchement complet entre la borne de nerf et AChR sous-jacents, mais a un axone pré-terminale mince (ce qui est aussi révélatrice d&#39;un certain niveau de dénervation et tentatives de réinnervation). </li><li> Effectuer une analyse pour chacune des trois régions identifiées pour toutes les catégories NMJ ci-dessus pour chaque animal. La moyenne des données de chaque animal avec les résultats des autres animaux du même groupe expérimental. Environ 200-300 jonctions chez le rat hémi-muscle du diaphragme et 150-200 chez la souris hémidiaphragme devraient être quantifiés dans au moins 3 (de préférence 5-6 ou plus) animaux par groupe expérimental. </li><li> Obtenir des images haute résolution confocale, l&#39;utilisationd pour publication, avec un microscope confocal. </li><li> Obtenir Z piles à 0,3 um de taille de pas de 20 à 40 um profondeurs, et recueillir sections optiques supplémentaires au-dessus et en dessous de chaque jonction de sorte que l&#39;ensemble du profil synaptique est inclus. </li><li> Utilisez le logiciel d&#39;acquisition pour reconstruire des images de la série Z dans les projections d&#39;intensité maximale. </li></ol></li></ol>

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Nous avons rien à révéler.

Comme la fonction respiratoire est compromise à la fois SCI traumatique et la SLA, le développement de thérapies qui ciblent spécifiquement la respiration et l&#39;innervation diaphragme sont cliniquement significatives 5,6. Afin d&#39;étudier globalement la fonction respiratoire, une méthode d&#39;approche combinée devrait être utilisé. CMAP mesurent le degré d&#39;innervation fonctionnelle de la membrane par le biais de la stimulation du nerf phrénique externe, mais la commande respiratoire bulbospinal pas ...

La sclérose latérale amyotrophique (ALS) est une maladie débilitante des neurones moteurs associés à la perte des deux neurones moteurs supérieurs et inférieurs et en conséquence une paralysie musculaire. Lors du diagnostic, la survie des patients est en moyenne de seulement 2-5 ans 1. Phrénique motoneurone (PhMN) la perte est une composante essentielle de la pathogenèse de la SLA. Les patients finissent par mourir à cause de la perte de PhMN innervation du diaphragme, le muscle principal de l&#39;inspiration 2,3. Traumatisme de la moelle épinière (SCI) est également un sérieux problème avec des difficultés respiratoires associés. Environ 12 000 nouveaux cas de SCI se produisent chaque année 4 en raison de dommages traumatiques de la moelle épinière. Malgré l&#39;hétérogénéité de la maladie par rapport à l&#39;emplacement, le type et la gravité, la majorité des cas SCI implique un traumatisme à la moelle épinière cervicale, ce qui se traduit souvent par une insuffisance respiratoire invalidante et persistante. En plus de la SLA et SCI, autre système nerveux central (SNC) peut être associée wdysfonctionnement respiratoire diaphragmatique vec 5,6. Le nerf phrénique est un nerf moteur efférent qui innerve l&#39;hémi-diaphragme ipsilatéral et qui provient de corps cellulaires PhMN situés dans les niveaux C3-C5 de la moelle épinière cervicale homolatérale. PhMN sortie est contrôlé par décroissant entrée bulbospinal du tronc cérébral dans une zone connue sous le nom du groupe rostrale ventrale respiratoire (rVRG) 7. Le circuit rVRG-PhMN diaphragme est au cœur du contrôle de la respiration inspiratoire, ainsi que d&#39;autres comportements à membrane non-ventilatoires. Diverses blessures traumatiques et des troubles neurodégénératifs qui affectent ces circuits peuvent conduire à une baisse profonde de la fonction respiratoire et la qualité de vie des patients. Décroissant entrée PhMNs de la survie rVRG, PhMN, l&#39;intégrité du nerf phrénique et l&#39;innervation correcte à la jonction neuromusculaire diaphragme (NMJ) sont tous nécessaires pour le fonctionnement de la membrane normale. Il est donc important d&#39;utiliser des techniques quipeut évaluer quantitativement ce circuit in vivo dans des modèles de rongeurs de la SLA, SCI et d&#39;autres maladies du SNC. Avec ce protocole, l&#39;objectif est de décrire les outils expérimentaux pour évaluer PhMN innervation du diaphragme à la fois au niveau électrophysiologiques et morphologiques. Composé potentiels d&#39;action musculaire (CMAP) sont enregistrées en stimulant tous les axones moteur efférent de neurones d&#39;un nerf moteur donnée, puis analyser la réponse de dépolarisation élicite des myofibres cibles. Cette technique peut être utilisée in vivo chez des rats et des souris anesthésiées à quantifier innervation fonctionnelle de l&#39;hémi-diaphragme par PhMNs 8. En raison du fait que CMAP représentent enregistrement simultané de tous (ou au moins beaucoup de / la plupart) myofibres de l&#39;ensemble de l&#39;hémi-diaphragme, il est utile d&#39;examiner également les phénotypes des axones et myofibres automobiles individuels au NMJ de diaphragme afin de suivre la maladie - et des changements morphologiques thérapie pertinentes telles que partielle et complete dénervation, germination régénérative et réinnervation. Ceci peut être accompli via l&#39;ensemble du support immunohistochimie (IHC) de la membrane, suivie d&#39;une évaluation morphologique de NMJs individuels à travers le muscle 9. Combinant CMAP et l&#39;analyse NMJ offre une approche puissante pour étudier quantitativement innervation diaphragmatique dans des modèles rongeurs de la maladie SNC et du SNP.

<table><tbody><tr><td>Paraformaldéhyde</td><td>Fisher</td><td>T353-500</td><td>Préparer d’abord une solution à 10 % dans de l’eau distillée désionisée ; faire 4 % avec 1x PBS, ajuster le pH à 7,4</td></tr><tr><td>1x solution saline tamponnée au phosphate, pH 7,4</td><td>Invitrogen</td><td>10010049</td><td></td></tr><tr><td>2 % d’albumine sérique bovine (2 % BSA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3059-100g</td><td>Dissoudre 2 g de BSA dans 100 ml de 1x PBS</td></tr><tr><td>0,2 % Triton X100 dans 2 % BSA/PBS (tampon bloquant)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9284-100mL</td><td>Dissoudre 0,2 ml/100 ml 2 % BSA/PBS</td></tr><tr><td>0,1 M Glycine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G-7126</td><td>Ajouter 0,185 g à 25 ml de 2 % BSA/PBS</td></tr><tr><td>&alpha ;-bungarotoxine</td><td>Invitrogen</td><td>T1175</td><td>Concentration 1:400</td></tr><tr><td>SMI-312</td><td>Sternberger Monoclonals</td><td>SMI312</td><td>Concentration 1:1 000</td></tr><tr><td>SV2</td><td>Etudes développementales Hybridoma Bank</td><td>SV2-Supernatant</td><td>Concentration 1:10</td></tr><tr><td>FITC chèvre anti-souris IgG1</td><td>Roche</td><td>3117731001</td><td>Concentration 1:100</td></tr><tr><td>Caoutchouc de silicone</td><td>Sylgard, Dow Corning</td><td>Part # 184</td><td>Suivez les instructions fournies avec le kit : peut utiliser plusieurs tailles de boîte de culture (30 mm, 60 mm, 100 mm) selon les besoins</td></tr><tr><td>Milieu de montage fluorescent Vectashield</td><td>Vector laboratories</td><td>H-1000</td><td>Il ne s’agit pas d’un support dur. Vous devrez fixer le couvercle avec du vernis à ongles transparent.</td></tr><tr><td>Petits ciseaux à ressort</td><td>Outils de science fine</td><td>15002-08</td><td></td></tr><tr><td>Pince de dissection</td><td>Outils de science fine</td><td>11295-51</td><td></td></tr><tr><td>Logiciel pour les enregistrements CMAP</td><td>Domaine d’application 3.5.6 ; ADI</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Électrodes de surface de disque</td><td>Natus neurologie</td><td>019-409000</td><td></td></tr><tr><td>Électrodes sous-cutanées à aiguille</td><td>Natus neurologie</td><td>019-453100</td><td></td></tr><tr><td>Gel conducteur</td><td>Aquasonic</td><td>122-73720</td><td></td></tr><tr><td>Stimulateur/système d’enregistrement pour enregistrements CMAP Stimulateur</td><td></td><td></td><td></td>ADI Powerlab 8SP</tr><tr><td>Amplificateur pour enregistrements</td> <td>CMAPBioAMP</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

Évaluation fonctionnelle et morphologique de membrane innervation par phrénique motoneurones

Functional and Morphological Assessment of Diaphragm Innervation by Phrenic Motor Neurons

Ce protocole se concentre spécifiquement sur les outils d’évaluation de l’innervation du diaphragme par le motoneurone phrénique (PhMN) aux niveaux électrophysiologique et morphologique. L’enregistrement du potentiel d’action musculaire composé (CMAP) après stimulation du nerf phrénique peut être utilisé pour évaluer quantitativement l’innervation fonctionnelle du diaphragme par les PhMN de la moelle épinière cervicale in vivo chez des rats et des souris anesthésiés. Étant donné que les CMAP représentent l’enregistrement simultané de toutes les myofibres de l’ensemble de l’hémi-diaphragme, il est utile d’examiner également les phénotypes des axones moteurs individuels et des myofibres au niveau de la NMJ du diaphragme afin de suivre les changements morphologiques pertinents pour la maladie et le traitement, tels que la dénervation partielle et complète, la germination régénérative et la réinnervation. Cela peut être accompli via l’immunohistochimie (IHC) de l’ensemble du diaphragme, suivie d’une évaluation morphologique détaillée des NMJ individuels dans tout le muscle. La combinaison des CMAP et de l’analyse NMJ fournit une approche puissante pour l’étude quantitative de l’innervation diaphragmatique dans des modèles de rongeurs du SNC et de la SNP.

Adulte rats Sprague-Dawley ont reçu soit une laminectomie seulement (contrôle indemne) ou unilatérale hémi-SCI contusion au niveau de la moelle épinière C4 10-12. A 5 semaines après la chirurgie, le pic CMAP amplitude enregistrée à partir de l&#39;hémi-diaphragme ipsilatérale au site laminectomie / blessures a été significativement réduite chez les rats SCI (figure 2C) par rapport à laminectomie seule commande (figure 2B). Tous NMJs dans l&#39;hémi-diaphragme étaient complète...

L’enregistrement du potentiel d’action musculaire composé évalue quantitativement l’innervation fonctionnelle du diaphragme par les motoneurones phréniques. L’immunohistochimie du diaphragme entier évalue l’innervation morphologique aux jonctions neuromusculaires individuelles. L’objectif de ce protocole est de démontrer comment ces deux méthodologies puissantes peuvent être utilisées dans divers modèles de maladies de la moelle épinière chez les rongeurs.

This protocol specifically focuses on tools for assessing phrenic motor neuron (PhMN) innervation of the diaphragm at both the electrophysiological and ...

L'objectif général de cette procédure est d'évaluer de façon quantitative l'innervation fonctionnelle et morphologique du diaphragme par les motoneurones phréniques de la moelle épinière cervicale. Cet objectif est atteint en réalisant un enregistrement du potentiel d'action musculaire composé provenant du hémidiaphragme chez des animaux anesthésiés, après une stimulation supramaximale du nerf phrénique homolatéral. L'étape suivante consiste à effectuer une immunohistochimie du diaphragme en préparation entière afin d'évaluer morphologiquement l'innervation des jonctions neuromusculaires individuelles.En définitive, la combinaison de l'analyse du potentiel d'action musculaire composé et de celle de la jonction neuromusculaire constitue une approche puissante pour étudier quantitativement l'innervation du diaphragme dans des modèles rongeurs de maladies du SNC et du SNP. Cette méthode peut aider à répondre à des questions essentielles dans le domaine des lésions médullaires, telles que : peut-on utiliser des interventions thérapeutiques pour restaurer avec succès la fonction diaphragmatique ? Les implications de cette technique s'étendent à des traitements pour des maladies comme les lésions médullaires traumatiques et le syndrome d'apnée du sommeil, car la fonction respiratoire diaphragmatique joue un rôle clé dans l'évolution clinique des patients souffrant de ces affections débilitantes. La démonstration de cette procédure sera assurée par le Dr Kali, chercheuse postdoctorale dans mon laboratoire, Melanie Martin, étudiante de premier cycle dans le laboratoire du Dr Wright, et Tamara Holla, technicienne de recherche dans mon laboratoire.Après avoir anesthésié l'animal, placez-le sur la planche chirurgicale, le dos vers le bas, et fixez les membres antérieurs à la planche. Ensuite, rasez la surface ventrale depuis la base du crâne jusqu'à l'abdomen, de chaque côté de la ligne médiane. Une fois la peau nettoyée, positionnez les électrodes : fixez la masse à la queue et insérez l'électrode de référence dans l'abdomen inférieur controlatéral par voie sous-cutanée.L'électrode d'enregistrement doit être préparée avec du gel conducteur sur la partie auto-adhésive, puis fixée le long de la marge costale unilatérale. Placez maintenant les électrodes de stimulation transcutanées à une distance d'un demi-centimètre l'une de l'autre, latéralement à la trachée et au-dessus de la clavicule. Elles doivent pénétrer perpendiculairement à la peau sur une profondeur d'environ un centimètre.Ces électrodes doivent être bien fixées, idéalement à la main. Reliez toutes les électrodes à leurs stimulateurs et amplificateurs appropriés. Les données recueillies doivent être enregistrées sur un ordinateur.Pour l'analyse, régler les paramètres de stimulation du stimulateur monopolaire sur des impulsions supramaximales d'une durée de 0,5 milliseconde et de fréquence de un hertz. L'amplitude peut varier entre six et huit volts. Régler la durée de stimulation d'intérêt sur 30 secondes et moyennez la réponse obtenue à partir de 10 stimulations consécutives en utilisant l'enregistrement de l'amplitude entre la ligne de base et le pic pour chaque animal, environ une fois par semaine si désiré.La manipulation des animaux est décrite en détail dans le protocole écrit. Après avoir euthanasié un animal à l'aide d'une surdose d'anesthésique injectable, réalisez une laparotomie à l'aide d'un scalpel ou de ciseaux. Effectuez une incision depuis le processus xiphoïde le long de la ligne médiane.Ensuite, à l’aide d’un scalpel et de pinces, séparer soigneusement la peau et les tissus conjonctifs de la musculature. Retirer le diaphragme en tirant vers le haut le processus xiphoïde et en découpant le diaphragme à partir des os environnants. Faire attention à ne pas endommager le muscle diaphragmatique.Transférez le diaphragme, côté supérieur vers le haut, dans une boîte en silicone remplie de paraformaldéhyde à 4 % dans du PBS sous un stéréomicroscope. Épinglez les tissus environnants le diaphragme en tendant bien le diaphragme. Ensuite, retirez le tissu conjonctif de la surface supérieure à l’aide de pinces et de ciseaux.Laisser agir le fixateur pendant 20 minutes, puis l'éliminer à l'aide de trois lavages de 10 minutes dans du PBS. Ensuite, appliquer une solution de glycine 0,1 molaire avec 2 % de BSA dans du PBS pendant 30 minutes. Puis incuber le diaphragme dans une solution de conjugué rod Domine alpha bungalow toin pendant 15 minutes.Éliminer la toxine bungalooide avec du PBS, comme effectué pour le fixateur. Ensuite, remplacer le bain par du méthanol froid et placer le tissu à l'abri du froid pendant cinq minutes à moins 20 degrés Celsius. Au bout de cinq minutes exactement, retirer le méthanol et rincer le tissu avec du PBS comme précédemment.Appliquez maintenant un blocage à l’aide d’une solution de TBP à 0,2 % pendant une heure. Remplacez la solution par l’anticorps primaire dans du TBP à 0,2 % et laissez le tissu incuber toute la nuit à quatre degrés Celsius avec une agitation douce. Le lendemain, effectuez trois lavages de dix minutes dans du TBP à 0,2 % pour éliminer l’anticorps primaire, puis incubez le tissu dans la solution d’anticorps secondaire pendant une heure avec agitation rotative et à l’abri de la lumière. Ensuite, effectuez trois lavages dans du PBS pour éliminer l’anticorps secondaire et conservez le tissu à l’abri de la lumière.Ensuite, sous un stéréoscope, retirez davantage de tissu conjonctif sur la surface supérieure du muscle. Une fois nettoyé, montez l'échantillon et observez-le au microscope à fluorescence épiscopique droit pour analyser quantitativement la morphologie du demi-diaphragme marqué. Utilisez des objectifs de 20 et 40 x d'agrandissement, car le diaphragme est analysé en préparation en coupe entière.La majeure partie de la coloration fluorescente est floue. À l'aide d'un microscope standard, il est préférable de réaliser l'analyse en temps réel. Afin d'évaluer correctement la morphologie des NMj individuels, diviser le muscle en trois sections pour l'analyse, selon les schémas topographiques d'innervation de la moelle épinière.En partant de la région la plus ventrale, analyser tous les NJM visibles le long des fibres musculaires, sans examiner de fibres situées plus profondément que les trois à quatre premières fibres sous la surface, car la pénétration des anticorps n'est jamais complète. Un NJM intact présente un axone préterminal épais, et toutes les régions du terminal nerveux se superposent entièrement aux récepteurs de l'acétylcholine musculaire sous-jacents. Un NJM partiellement dénervé présentera certaines régions des récepteurs de l'acétylcholine sous-jacents non occupées.Une JNM complètement dénervée ne présentera aucune correspondance avec les récepteurs à acétylcholine au niveau du terminal nerveux. D'autres JNM dans la région devraient présenter une morphologie différente ou le succès de la pénétration des anticorps serait douteux si plus d'un axone préterminal innerve une JNM. La JNM est multiple.Une dénervation innervée a pu survenir dans ce cas, suivie d'une réinnervation. S'il existe un chevauchement au niveau de l'extrémité nerveuse avec les récepteurs d'acétylcholine sous-jacents et que l'axone préterminal est très mince, alors la jonction neuromusculaire est faiblement innervée. C'est également un signe de réaction.Dans une expérience impliquant des rats adultes SPRAGUE-DAWLEY, les témoins ont subi une laminectomie tandis que d'autres ont reçu une lésion médullaire contusive hémilatérale. Cinq semaines plus tard, l'amplitude maximale du potentiel moteur composé a été enregistrée au niveau du diaphragme hémilatéral controlatéral au site de laminectomie ou de lésion.Il était significativement réduit chez les rats ayant subi une lésion médullaire par rapport aux rats témoins ayant seulement subi une laminectomie, dans une expérience différente impliquant des rats exprimant une protéine humaine mutée, donc D une protéine, servant de modèle de SLA. La morphologie des jonctions neuromusculaires dans l'hémidiaphragme était parfaitement intacte chez les animaux témoins de type sauvage. Toutefois, chez les rats transgéniques, les JNM présentaient une pathologie importante. Certaines présentaient une dénervation complète, marquée par la flèche.D'autres JNM étaient partiellement dénervées, comme indiqué par la flèche, et, comme on le voit sur la JNM située à droite, d'autres JNM étaient multi-innervées, tandis que d'autres présentaient des axones préterminaux minces ici marqués par une tête de flèche. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière d'évaluer quantitativement l'innervation fonctionnelle et morphologique du diaphragme par les motoneurones phréniques. Merci d'avoir regardé et bonne chance dans toutes vos expériences.

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