Name: À long terme intravitale microscopie multiphotonique imagerie des cellules immunitaires dans sains et malades du foie en utilisant des souris CXCR6.Gfp Reporter (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-03-24T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 44 s
Description: Découvrez l'imagerie intravitale multiphotonique pour observer la migration des leucocytes dans le foie de souris CXCR6.Gfp. Cette méthode permet d'étudier les mécanismes de recrutement immunitaire lors des inflammations hépatiques.

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Les auteurs remercient l’animalerie centrale de l’hôpital universitaire d’Aix-la-Chapelle pour son soutien technique. Ces travaux ont été soutenus par la Fondation allemande pour la recherche (DFG Ta434/2-1, DFG SFB/TRR 57) et par le Centre interdisciplinaire de recherche clinique (IZKF) d’Aix-la-Chapelle. Ce travail a également été soutenu par la plate-forme « Imagerie à deux photons », une plate-forme du Centre interdisciplinaire de recherche clinique (IZKF) d’Aix-la-Chapelle au sein de la Faculté de médecine de l’Université RWTH d’Aix-la-Chapelle.

REMARQUE: Les expériences ont été effectuées en conformité avec la législation allemande régissant les études animales suivantes le «Guide pour le soin et l&#39;utilisation des animaux de laboratoire de (la publication NIH, 8e édition, 2011) et la directive 2010/63 / UE sur la protection des animaux utilisé à des fins scientifiques (Journal officiel de l&#39;Union européenne, 2010). Autorisation officielle a été accordée dans le soin des animaux et l&#39;utilisation bureau gouvernemental (LANUV Nordrhein-Westfalen, Recklinghausen, Allemagne). NOTE: Les mesures qui peuvent être omis pour l&#39;imagerie à court terme (par exemple, des piles Snap Shots 3-D ou aussi courte durée time-lapse microscopie) sont marquées d&#39;un astérisque (*) pour réduire le temps de préparation et de simplifier le protocole chirurgical. L&#39;imagerie peut également être réalisée sans un contrôle étendu de surveillance et de la circulation, si nécessaire, cependant, le temps de survie sera nettement réduite. 1. Configuration de Microscope et pré-chirurgie Préparation (5-10 kmn) <ol><li> système de commutateur (microscope, puissance Lab, laser, coussin chauffant, chambre climatique, web cam, dispositif de pompe de la seringue, un respirateur). </li><li> Connectez O 2 offre à l&#39;isoflurane vapeur et régler le niveau isoflurane à 1,5% en volume (v / v), se connecter à un petit appareil respiratoire des animaux. <ol><li> Pour court imagerie terme, maintenir l&#39;anesthésie à l&#39;isoflurane seulement après l&#39;induction initiale de l&#39;anesthésie ip (voir l&#39;étape 2.2). Ensuite, utilisez 2 Vol% (v / v) isoflurane, et de garder le temps d&#39;imagerie en dessous de 2 h pour garantir stable microcirculation du foie. </li></ol></li><li> Réglez la respiration à 120-140 cycles / min respiratoires avec un volume de 150 à 200 pi. </li><li> Mettre en place l&#39;étape d&#39;agarose de la souris. Préparer 100 ml de 3% (p / v) d&#39;agarose, le verser dans un plat (environ 10 cm x 15 cm base) dans un angle de 40 °. </li><li> Mettre en place la zone de travail chirurgical recueillir l&#39;instrumentation nécessaire. Pour prévenir l&#39;infection microbienne, la désinfection d&#39;instruments en utilisant une solution à 1% du Forte Sekusept S (9,9% p / v), Glutaral 9,8% p / v, de formaldéhyde pendant 5 min avant l&#39;expérience (figure 1A). </li><li> Obtenir des composants restants: désinfectant de la peau (par exemple, une solution de la povidone iodée 10%), l&#39;étape du foie (piles et pont), une solution d&#39;agarose (3% (p / v) dans du PBS), la pompe à seringue avec 5% (p / v) d&#39;une solution de glucose (G-5), la pompe à seringue avec une solution anesthésique I (Kétamine 0,1 mg / ml, xylazine 0,5 mg / ml, 5 pg de fentanyl / ml), des tampons de coton, le n-butyl-2-Cyanoacrylat et 1x PBS. Mettez plat stade agarose dans la chambre d&#39;incubation pour le préchauffage. </li></ol> 2. trachéotomie (10-15 min) <ol><li> Utilisez souris C57BL / 6 dans la maison de l&#39;élevage pesant 25-28 g. Maison des souris dans des conditions exempts d&#39;organismes pathogènes spécifiques en conformité avec les lignes directrices FELASA, dans un environnement à température et humidité contrôlées avec un / 12 h cycle d&#39;obscurité 12 heures de lumière. Permettre aux animaux un accès gratuit à un régime standard de souris (Sniff standard rongeurs Diète) et de l&#39;eau ad libitum. </li><li> Anesthésier la souris par initial intraperitoneale (ip) d&#39;injection de 250 ul d&#39;une solution anesthésique de kétamine II (0,1 mg / ml, xylazine 1 mg / ml, la buprénorphine 10 ug / ml). <ol><li> * Pour l&#39;entretien lors de l&#39;imagerie intravitale, administrer en continu la solution anesthésique I par injection ip continu (Kétamine 0,1 mg / ml, xylazine 0,5 mg / ml, le fentanyl 5 ug / ml) en utilisant un appareil de pompage à seringue à un débit de 0,2 ml / h dans par inhalation d&#39;isoflurane combinaison avec 0,5% en volume (v / v). </li><li> Vérifiez réflexes après 5 min (par exemple pincée de coussinet plantaire avec une pince), désinfecter la peau pour la trachéotomie, commencer la préparation si la souris est en état ​​d&#39;anesthésie chirurgicale tolérante. </li><li> Appliquer une crème de protection oculaire (par exemple, Dexpanthenol 50 mg / g) pour empêcher la cornée de sécher (figure 1B). </li></ol></li><li> Fixer la souris sur la table de préparation exposer face ventrale avec du ruban adhésif pour les extrémités; overstretch doucement le cou, fixer dans cette position, par exemple., en utilisant une bande de caoutchouc accroché to les incisives. <ol><li> Désinfectez la peau et de la fourrure en utilisant une solution d&#39;iode povidone, en appliquant un désinfectant avec un coton-tige. </li></ol></li><li> Effectuer la découpe de la peau initial (0,5 à 1 cm de longueur) directement sous le menton (figure 1C) <ol><li> Disséquer soigneusement le tissu conjonctif entre les glandes salivaires (figure 1D). </li><li> Détachez avec soin ouverte musculaire tube entourant la trachée (figure 1E, F). </li></ol></li><li> Placez fil chirurgical sous la trachée pour plus tard la fixation du tube de ventilation (figure 1G). <ol><li> Ouvrir la trachée par des micro-ciseaux entre les anneaux cartilagineux effectuant une incision en forme de T (figure 1H) </li></ol></li><li> Placez le tube de ventilation dans la trachée à travers l&#39;incision (~ 0,5 cm). Pour pousser le tube avant, saisir extrémité caudale avec de petites pinces anatomiques et avancer doucement le tube dans la trachée (Figure 1I) </li><li> Fixer tube avec fil chirurgical (par exemple, </em&gt;, 5-0) avec un fil placé à l&#39;étape 2.5 un nœud autour du tube intérieur de la trachée; effectuer seconde fixation crânienne du tube à la peau pour éviter réciproquement des accidentelle (figure 1J, K). </li><li> coupe du joint avec de la colle de tissu (par exemple, le n-butyl-2-Cyanoacrylat) (Figure 1L). </li><li> Fixer le tube à la tête avec du ruban adhésif. </li></ol> 3. laparotomie (15-20 min) <ol><li> Placez la souris sur coussin chauffant pour prévenir l&#39;hypothermie. Rasez abdomen, retirer délicatement les poils de la peau. Désinfectez la peau et de la fourrure rasée en utilisant une solution de povidone iode. </li><li> Effectuer une petite couper la peau en dessous du sternum avec des ciseaux chirurgicaux (figure 2A). Prolonger la coupe latéralement sous les côtes des deux côtés, cautériser tous les vaisseaux sanguins visibles pour prévenir les saignements. </li><li> Effectuer avec précaution une petite coupure à la ligne blanche en dessous du sternum, ouverture du péritoine (figure 2B). Prolonger la coupe des deux côtés utilisant cauterization pour prévenir les saignements (figure 2C, D). </li><li> Placez la souris dans un plat de scène agarose (figure 2E). Placez des piles de hauteur appropriée des deux côtés de la souris (en général de 12 à 14 des lamelles) (figure 2F). </li><li> Placez capteur de déclenchement respiratoire sous le haut du dos pour synchroniser le microscope avec la respiration. Activer unité de déclenchement (figure 2G). </li><li> Placez fil chirurgical (5-0) à travers le sternum se rétracter nervures (Figure 2I). </li><li> Découpez soigneusement ligament reliant le foie et le diaphragme (ligament falciforme) ainsi que le foie et tractus gastro-intestinal avec des ciseaux chirurgicaux courbes. Couper le ligament falciforme jusqu&#39;à l&#39;aorte (figure 2J). </li></ol> 4. Configuration de l&#39;échantillon (10-15 min) <ol><li> Placez la souris sur le côté droit avec un angle de 45 ° pour un accès facile à gros lobe du foie. </li><li> Ajouter pont en scène sous les côtes, couvrant la abdominalecavité. Fabrication d&#39;un pont en utilisant une lamelle standard avec revêtement adhésif de bande pour couvrir les arêtes vives (Figure 2K). </li><li> Placez gros lobe du foie sur scène. Glisser soigneusement double roulement sonde de stylet ou une spatule rembourrée dessous du foie et tenir le haut de l&#39;organe en utilisant un coton-tige humide ou tissu humide. Soulevez lobe sur la diapositive et appliquer glisser en douceur. Lobe peut être plié ou plié. Fournir des soins supplémentaire pour que la manipulation douce du foie (Figure 2L). </li><li> Placez piquets de soutien latéral, par exemple, des tas de petites lamelles (20 mm x 20 mm), d&#39;environ la même hauteur du lobe du foie à côté de lui pour soutenir lamelle. </li><li> Passer grande lamelle (24 mm x 50 mm) sur le lobe du foie. Veiller à ce que lamelle est orienté aussi horizontale que possible (Figure 2M). NOTE: La lamelle doit être en contact avec le tissu sans presser. Vérifiez les signes visibles de la circulation sanguine avec facultés affaiblies (tissu blanc). Si MICROCIRCulation est perturbé, ajouter soutenir davantage enjeux. </li><li> * Placez deux cathéters intra-péritonéales indépendants (Figure 2N) pour l&#39;anesthésie à long terme et l&#39;application G-5. Installez cathéters latéralement dans le bas-ventre à côté des membres postérieurs. REMARQUE: Les cathéters intra-péritonéales peuvent être self-made en connectant 27 G aiguilles avec un tube de silicone souple (Figure 3). </li><li> * Aiguille Fixate avec une boucle de fil chirurgical 5-0 sur la peau pour éviter tout déplacement accidentel. </li><li> * Joindre pompe seringue avec une solution d&#39;anesthésie I cathéter 1, réglage du débit à 0,2 ml / h; attacher pompe seringue avec le G-5 à cathéter 2, débit réglé à 0,1 ml / h. </li></ol> 5. Suivi de la souris <ol><li> * Lieu électrodes ECG dans les extrémités avant et arrière (figure 4A). </li><li> * Fixer le tube d&#39;expiration de CO 2 capteur de niveau. </li><li> Ajouter capteur de température externe connecté au pad thermique (figure 4C). </li></ol> 6. Embedding et fixation tissulaire (5-10 min) <ol><li> Préparer 100 ml de 3% (p / v) d&#39;agarose dans du PBS 1X. Incorporer foie lorsque la température est à 41 ° C en utilisant une seringue de 5 ml et une aiguille 18 G (figure 5A). </li><li> Verser le reste d&#39;agarose sur lamelle couvre-objet et autour de la souris (figure 5B, C). Attendez jusqu&#39;à ce que l&#39;agarose est complètement gélatinisé. </li><li> Enlever l&#39;excès d&#39;agarose en utilisant la spatule Heidemann, la préparation d&#39;un Viewfield suffisamment grande pour balayer le lobe hépatique préparé (figure 5D, E). </li></ol> 7. Imaging <ol><li> Transférer la souris dans la chambre climatique de microscope. </li><li> Ajouter 50 à 100 ml de 1 x PBS (préchauffé à 37 ° C). </li><li> Couvrir le plat de l&#39;échantillon pour éviter l&#39;évaporation (figure 5F). </li><li> * Diminution par inhalation d&#39;isoflurane à 0,5% en volume (v / v). </li><li> * Lancer un logiciel de surveillance, l&#39;enregistrement ECG, la fréquence cardiaque et de CO 2 expiratoire. </li><li> Lancer imagerie: ouvrir laser volets, identifier les champs de vue de l&#39;intérêt, définissent la limite supérieure et inférieure pour Z-piles, et commencer l&#39;enregistrement laps de temps. Réajuster Z-piles si nécessaire pour corriger Z-dérive (par ex. En raison de changements dans la pression sanguine ou les fluctuations de température, Figure (5G). REMARQUE: Après la fin de la période de formation d&#39;image ou si la circulation ou l&#39;anesthésie des animaux devient instable, sacrifier les souris par dislocation cervicale (sans réveil de l&#39;anesthésie). </li></ol>

<ol><li>Dusseaux, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+MAIT+cells+are+xenobiotic-resistant%2C+tissue-targeted%2C+CD161hi+IL-17-secreting+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Human MAIT cells are xenobiotic-resistant, tissue-targeted, CD161hi IL-17-secreting T cells.</a> Blood. 117 (4), 1250-1259 (2011).</li>
<li>Reese, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+hypoxia+on+liver+secretion+studied+by+intravital+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Exp+Pathol%22%5BJournal%5D)">The effect of hypoxia on liver secretion studied by intravital fluorescence microscopy.</a> Br J Exp Pathol. 41, 527-535 (1960).</li>
<li>Bhathal, P. S., Christie, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+fluorescence+microscopy+study+of+bile+ductule+proliferation+in+guinea+pigs%5BTitle%5D)+AND+%22Gut%22%5BJournal%5D)">Intravital fluorescence microscopy study of bile ductule proliferation in guinea pigs.</a> Gut. 10 (11), 955(1969).</li>
<li>Stefenelli, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Terminal+vascular+system+and+microcirculation+of+the+rat+liver+in+intravital+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Wien+Klin+Wochenschr%22%5BJournal%5D)">Terminal vascular system and microcirculation of the rat liver in intravital microscopy.</a> Wien Klin Wochenschr. 82 (33), 575-578 (1970).</li>
<li>Hori, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple+and+sure+methodology+for+massive+hepatectomy+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Gastroenterol%22%5BJournal%5D)">Simple and sure methodology for massive hepatectomy in the mouse.</a> Ann Gastroenterol. 24 (4), 307-318 (2011).</li>
<li>Tanaka, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+dual-colored+visualization+of+colorectal+liver+metastasis+in+living+mice+using+two+photon+laser+scanning+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Microsc+Res+Tech%22%5BJournal%5D)">Intravital dual-colored visualization of colorectal liver metastasis in living mice using two photon laser scanning microscopy.</a> Microsc Res Tech. 75 (3), 307-315 (2011).</li>
<li>Schemmer, P., Bunzendahl, H., Klar, E., Thurman, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reperfusion+injury+is+dramatically+increased+by+gentle+liver+manipulation+during+harvest%5BTitle%5D)+AND+%22Transpl+Int%22%5BJournal%5D)">Reperfusion injury is dramatically increased by gentle liver manipulation during harvest.</a> Transpl Int. 13, Suppl 1. S525-S527 (2000).</li>
<li>Schemmer, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activated+Kupffer+cells+cause+a+hypermetabolic+state+after+gentle+in+situ+manipulation+of+liver+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Gastrointest+Liver+Physiol%22%5BJournal%5D)">Activated Kupffer cells cause a hypermetabolic state after gentle in situ manipulation of liver in rats.</a> Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 280 (6), G1076-G1082 (2001).</li>
<li>Toiyama, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+imaging+of+DSS-induced+cecal+mucosal+damage+in+GFP-transgenic+mice+using+two-photon+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gastroenterol%22%5BJournal%5D)">Intravital imaging of DSS-induced cecal mucosal damage in GFP-transgenic mice using two-photon microscopy.</a> J Gastroenterol. 45 (5), 544-553 (2010).</li>
<li>Zimmon, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+hepatic+vasculature+and+its+response+to+hepatic+injury%3A+a+working+hypothesis%5BTitle%5D)+AND+%22Yale+J+Biol+Med%22%5BJournal%5D)">The hepatic vasculature and its response to hepatic injury: a working hypothesis.</a> Yale J Biol Med. 50 (5), 497-506 (1977).</li>
<li>Wong, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+minimal+role+for+selectins+in+the+recruitment+of+leukocytes+into+the+inflamed+liver+microvasculature%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">A minimal role for selectins in the recruitment of leukocytes into the inflamed liver microvasculature.</a> J Clin Invest. 99 (11), 2782-2790 (1997).</li>
<li>Bonder, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Essential+role+for+neutrophil+recruitment+to+the+liver+in+concanavalin+A-induced+hepatitis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Essential role for neutrophil recruitment to the liver in concanavalin A-induced hepatitis.</a> J Immunol. 172 (1), 45-53 (2004).</li>
<li>Xu, C., Zipfel, W., Shear, J. B., Williams, R. M., Webb, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiphoton+fluorescence+excitation%3A+new+spectral+windows+for+biological+nonlinear+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Multiphoton fluorescence excitation: new spectral windows for biological nonlinear microscopy.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 93 (20), 10763-10768 (1996).</li>
<li>Centonze, V. E., White, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiphoton+excitation+provides+optical+sections+from+deeper+within+scattering+specimens+than+confocal+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Multiphoton excitation provides optical sections from deeper within scattering specimens than confocal imaging.</a> Biophys J. 75 (4), 2015-2024 (1998).</li>
<li>Amore, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+multiphoton+imaging+of+a+transgenic+mouse+model+of+Alzheimer+disease+reveals+marked+thioflavine-S-associated+alterations+in+neurite+trajectories%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neuropathol+Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">In vivo multiphoton imaging of a transgenic mouse model of Alzheimer disease reveals marked thioflavine-S-associated alterations in neurite trajectories.</a> J Neuropathol Exp Neurol. 62 (2), 137-145 (2003).</li>
<li>Hickey, M. J., Westhorpe, C. L. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+inflammatory+leukocyte+recruitment+in+kidney%2C+lung+and+liver--challenges+to+the+multi-step+paradigm%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Imaging inflammatory leukocyte recruitment in kidney, lung and liver--challenges to the multi-step paradigm.</a> Immunol Cell Biol. 91 (4), 281-289 (2013).</li>
<li>McLellan, M. E., Kajdasz, S. T., Hyman, B. T., Bacskai, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+of+reactive+oxygen+species+specifically+associated+with+thioflavine+S-positive+amyloid+plaques+by+multiphoton+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging of reactive oxygen species specifically associated with thioflavine S-positive amyloid plaques by multiphoton microscopy.</a> J Neurosci. 23 (6), 2212-2217 (2003).</li>
<li>Geissmann, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravascular+Immune+Surveillance+by+CXCR6%2B+NKT+Cells+Patrolling+Liver+Sinusoids%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biology%22%5BJournal%5D)">Intravascular Immune Surveillance by CXCR6+ NKT Cells Patrolling Liver Sinusoids.</a> PLoS Biology. 3 (4), (2005).</li>
<li>Velázquez, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cutting+edge%3A+activation+by+innate+cytokines+or+microbial+antigens+can+cause+arrest+of+natural+killer+T+cell+patrolling+of+liver+sinusoids%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Cutting edge: activation by innate cytokines or microbial antigens can cause arrest of natural killer T cell patrolling of liver sinusoids.</a> J Immunol. 180 (4), 2024-2028 (2008).</li>
<li>Wehr, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemokine+receptor+CXCR6-dependent+hepatic+NK+T+Cell+accumulation+promotes+inflammation+and+liver+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Chemokine receptor CXCR6-dependent hepatic NK T Cell accumulation promotes inflammation and liver fibrosis.</a> J Immunol. 190 (10), 5226-5236 (2013).</li>
<li>Khandoga, A., Hanschen, M., Kessler, J. S., Krombach, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD4%2B+T+cells+contribute+to+postischemic+liver+injury+in+mice+by+interacting+with+sinusoidal+endothelium+and+platelets%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">CD4+ T cells contribute to postischemic liver injury in mice by interacting with sinusoidal endothelium and platelets.</a> Hepatology. 43 (2), 306-315 (2006).</li>
<li>Egen, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage+and+T+cell+dynamics+during+the+development+and+disintegration+of+mycobacterial+granulomas%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Macrophage and T cell dynamics during the development and disintegration of mycobacterial granulomas.</a> Immunity. 28 (2), 271-284 (2008).</li>
<li>Beattie, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leishmania+donovani-induced+expression+of+signal+regulatory+protein+alpha+on+Kupffer+cells+enhances+hepatic+invariant+NKT-cell+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Leishmania donovani-induced expression of signal regulatory protein alpha on Kupffer cells enhances hepatic invariant NKT-cell activation.</a> Eur J Immunol. 40 (1), 117-123 (2010).</li>
<li>Beattie, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+imaging+of+experimental+Leishmania+donovani-induced+hepatic+granulomas+detects+Kupffer+cell-restricted+antigen+presentation+to+antigen-specific+CD8+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Dynamic imaging of experimental Leishmania donovani-induced hepatic granulomas detects Kupffer cell-restricted antigen presentation to antigen-specific CD8 T cells.</a> PLoS Pathog. 6 (3), e1000805(2010).</li>
<li>McDonald, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravascular+danger+signals+guide+neutrophils+to+sites+of+sterile+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Intravascular danger signals guide neutrophils to sites of sterile inflammation.</a> Science. 330 (6002), 362-366 (2010).</li>
<li>Vanheule, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+intravital+microscopic+study+of+the+hepatic+microcirculation+in+cirrhotic+mice+models%3A+relationship+between+fibrosis+and+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Exp+Pathol%22%5BJournal%5D)">An intravital microscopic study of the hepatic microcirculation in cirrhotic mice models: relationship between fibrosis and angiogenesis.</a> Int J Exp Pathol. 89 (6), 419-432 (2008).</li>
<li>Jenne, C. N., Kubes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune+surveillance+by+the+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">Immune surveillance by the liver.</a> Nat Immunol. 14 (10), 996-1006 (2013).</li>
<li>Zimmermann, H. W., Tacke, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modification+of+chemokine+pathways+and+immune+cell+infiltration+as+a+novel+therapeutic+approach+in+liver+inflammation+and+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Inflamm+Allergy+Drug+Targets%22%5BJournal%5D)">Modification of chemokine pathways and immune cell infiltration as a novel therapeutic approach in liver inflammation and fibrosis.</a> Inflamm Allergy Drug Targets. 10 (6), 509-536 (2011).</li>
<li>Kim, J. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+laser+scanning+microscopy+imaging+of+intact+spinal+cord+and+cerebral+cortex+reveals+requirement+for+CXCR6+and+neuroinflammation+in+immune+cell+infiltration+of+cortical+injury+sites%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Two-photon laser scanning microscopy imaging of intact spinal cord and cerebral cortex reveals requirement for CXCR6 and neuroinflammation in immune cell infiltration of cortical injury sites.</a> J Immunol Methods. 352 (1-2), 89-100 (2010).</li>
<li>Karlmark, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepatic+recruitment+of+the+inflammatory+Gr1%2B+monocyte+subset+upon+liver+injury+promotes+hepatic+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Hepatic recruitment of the inflammatory Gr1+ monocyte subset upon liver injury promotes hepatic fibrosis.</a> Hepatology. 50 (1), 261-274 (2009).</li>
<li>Heymann, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepatic+macrophage+migration+and+differentiation+critical+for+liver+fibrosis+is+mediated+by+the+chemokine+receptor+C-C+motif+chemokine+receptor+8+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Hepatic macrophage migration and differentiation critical for liver fibrosis is mediated by the chemokine receptor C-C motif chemokine receptor 8 in mice.</a> Hepatology. 55 (3), 898-909 (2012).</li>
<li>Ramachandran, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+Ly-6C+expression+identifies+the+recruited+macrophage+phenotype%2C+which+orchestrates+the+regression+of+murine+liver+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Differential Ly-6C expression identifies the recruited macrophage phenotype, which orchestrates the regression of murine liver fibrosis.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (46), E3186-E3195 (2012).</li>
<li>Moles, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+TLR2%2FS100A9%2FCXCL-2+signaling+network+is+necessary+for+neutrophil+recruitment+in+acute+and+chronic+liver+injury+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22J+Hepatol%22%5BJournal%5D)">A TLR2/S100A9/CXCL-2 signaling network is necessary for neutrophil recruitment in acute and chronic liver injury in the mouse.</a> J Hepatol. 60 (4), 782-791 (2014).</li>
<li>Hammerich, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemokine+receptor+CCR6-dependent+accumulation+of+%CE%B3%CE%B4+T+cells+in+injured+liver+restricts+hepatic+inflammation+and+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Chemokine receptor CCR6-dependent accumulation of γδ T cells in injured liver restricts hepatic inflammation and fibrosis.</a> Hepatology. 59 (2), 630-642 (2014).</li>
<li>Syn, W. -K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NKT-associated+hedgehog+and+osteopontin+drive+fibrogenesis+in+non-alcoholic+fatty+liver+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Gut%22%5BJournal%5D)">NKT-associated hedgehog and osteopontin drive fibrogenesis in non-alcoholic fatty liver disease.</a> Gut. 61 (9), 1323-1329 (2012).</li>
<li>McDonald, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interaction+of+CD44+and+hyaluronan+is+the+dominant+mechanism+for+neutrophil+sequestration+in+inflamed+liver+sinusoids%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Interaction of CD44 and hyaluronan is the dominant mechanism for neutrophil sequestration in inflamed liver sinusoids.</a> J Exp Med. 205 (4), 915-927 (2008).</li>
<li>Egen, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+imaging+reveals+limited+antigen+presentation+and+T+cell+effector+function+in+mycobacterial+granulomas%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Intravital imaging reveals limited antigen presentation and T cell effector function in mycobacterial granulomas.</a> Immunity. 34 (5), 807-819 (2011).</li>
<li>Singer, G., Stokes, K. Y., Granger, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepatic+microcirculation+in+murine+sepsis%3A+role+of+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatr+Surg+Int%22%5BJournal%5D)">Hepatic microcirculation in murine sepsis: role of lymphocytes.</a> Pediatr Surg Int. 24 (1), 13-20 (2008).</li>
<li>Phillipson, M., Kubes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+neutrophil+in+vascular+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">The neutrophil in vascular inflammation.</a> Nat Med. 17 (11), 1381-1390 (2011).</li>
<li>Khandoga, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+and+quantitative+analysis+of+leukocyte+directional+migration+and+polarization+in+inflamed+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging and quantitative analysis of leukocyte directional migration and polarization in inflamed tissue.</a> PLoS One. 4 (3), e4693(2009).</li>
</ol>

Les auteurs ne divulguent aucun conflit d’intérêts.

Le but de notre étude était de développer une méthode très standardisé, stable et reproductible pour l&#39;imagerie intravitale TPLSM du foie. Imagerie intravitale en général a donné de précieuses indications sur le comportement cellulaire dans des conditions réelles suivantes homing et l&#39;interaction des différentes populations de leucocytes dans le développement, l&#39;homéostasie et la maladie. Cependant, la position anatomique peu difficile du foie, en raison de laquelle respiratoire et le mouvement péristaltique...

La visualisation des cellules et des fonctions cellulaires dans des organes entiers, voire des organismes entiers a été d&#39;un grand intérêt pour les plus de 50 ans, y compris presque toutes les parties du corps 2. Par conséquent, certaines études antérieures déjà employés imagerie intravitale du foie 3,4. Cependant, plusieurs limitations existent à jour concernant stable à long terme imagerie à haute résolution des tissus du foie. En raison de la position anatomique du foie en contact étroit avec la membrane et le tractus gastro-intestinal 5, le problème le plus commun pour l&#39;imagerie microscopique intravitale mouvement est due à la respiration et, dans une moindre mesure, péristaltique de l&#39;intestin 6. En comparaison à d&#39;autres organes solides, la chirurgie du foie est particulièrement difficile. En raison de la structure microvasculaire dense, manipulation chirurgicale peut entraîner des lésions hémorragiques massifs, troubles de la microcirculation 7 et également l&#39;activation de résident immune cellules telles que des cellules de Kupffer 8. Par conséquent, la fixation mécanique du tissu telle que publiée ailleurs 6,9 est susceptible d&#39;interférer avec l&#39;imagerie par microscopie intravitale. Dans un foie en bonne santé, de 10 à 15% du volume total de sang réside dans le système vasculaire du foie, et l&#39;organe reçoit l&#39;ordre de 25% de la production globale cardiaque 10, rendant l&#39;organe très sensible aux variations de la circulation (par exemple, les fluctuations de la pression artérielle ). Par conséquent, les perturbations dans le flux sanguin hépatique due à par exemple, contrainte de cisaillement, de déplacement, de blessure par une manipulation excessive des tissus ou la circulation centralisée seront conduire à des altérations artificielles dans leucocytes comportement migratoire, troubles de l&#39;oxygénation du foie et donc également des dommages au foie, affecter les réponses immunitaires du foie ainsi comme conservation d&#39;organes et de la durée de vie globale de l&#39;animal. Études microscopiques étaient fondés sur km à épifluorescence intravitalecroscopy, mais plusieurs contraintes techniques telles que le blanchiment photo et une faible profondeur de pénétration limiter l&#39;utilisation de cette technique pour le long terme imagerie du foie 4,11,12. Avec le développement de la microscopie multiphotonique dans les années 1990, les limites de la photo blanchiment ou la profondeur de pénétration ont principalement été résolus, que cette nouvelle méthode était techniquement capable d&#39;effectuer des études d&#39;imagerie dans pratiquement tous les organes dans des situations de la vie réelle de 13 à 15. Toutefois, les principaux défis à relever en ce qui concerne l&#39;imagerie du foie étaient: mouvements de respiration, autofluorescence des tissus du foie, de fixation flux sanguin inchangée dans les sinusoïdes hépatiques, et l&#39;imagerie particulièrement stable pour des périodes de plusieurs heures 16 plus longues. Bien que plusieurs études ont abordé la fonction et la migration des différents leucocytes dans le foie, par exemple, 17 cellules NKT 18-20, les cellules T 21,22, les macrophages du foie 23,24 ou 25 neutrophiles, long terme multiphotonique mimagerie icroscopy ne avait pas encore été établie avec succès, une tâche encore plus difficile chez les animaux atteints de maladie hépatique aiguë ou chronique en raison des dommages existants et la susceptibilité donc supérieur à 26 autres dommages. Toutefois, le suivi du comportement migratoire et la fonction cellulaire de leucocytes dans le foie en temps réel permet de nouvelles perspectives dans leur rôle particulier dans l&#39;homéostasie du foie et la maladie 27. Le CXCR6 des récepteurs de chimiokines est exprimé sur plusieurs sous-ensembles de lymphocytes, y compris les cellules tueuses naturelles (NK), les cellules NKT et certaines populations de cellules T 18,28. Des études antérieures sur des souris ont indiqué que CXCR6 et son CXCL16 de ligand apparenté peuvent contrôler les patrouilles des cellules NKT sur sinusoïdes du foie lors de l&#39;homéostasie. Par conséquent, l&#39;utilisation de souris CXCR6.gfp (portant un knock-in de la protéine verte fluorescente [GFP] dans le locus CXCR6) a été décrite pour étudier la migration des lymphocytes dans divers organes tels que le cerveau 29et aussi le foie 18,20, montrant l&#39;infiltration de cellules CXCR6.gfp augmenté sur l&#39;inflammation. Avec la méthode prévue dans cette étude, il était possible de suivre ces processus sur une longue période de temps dans des conditions stables. La procédure basée multiphotonique intravitale permis imagerie qui était très reproductible avec une perturbation minimale de l&#39;animal et l&#39;organe; optimisé pour la survie des animaux à long terme par une surveillance importante suivie d&#39;un contrôle étroit de la respiration et de la circulation; et très flexible et facile à adopter aussi à d&#39;autres organes parenchymateux tels que le rein ou de la rate.

<table><tbody><tr><td>Anesthésiques</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Buprénorphine</td><td>Essex Pharma</td><td>997.00.00</td><td>Analgéticum, 0,1 mg/kg</td></tr><tr><td>Fentanyl</td><td>Rotex Medica</td><td>charge : 30819</td><td></td></tr><tr><td>Système d’anesthésie Fluovac</td><td>Harvard Apparatus</td><td>34-1030</td><td></td></tr><tr><td>Glucose 5 %</td><td>Vaporisateur</td> Braun <td></td><td></td></tr><tr><td>ISOFLO (Isoflurane Vapor)</td><td>Eickemeyer</td><td>4802885</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Forene Abbott</td><td>B 506</td><td></td></tr><tr><td>Isotonique (0,9 %) NaCl solution</td><td>DeltaSelect GmbH</td><td>PZN 00765145</td><td></td></tr><tr><td>Ketamin 10 %</td><td>ceva</td><td>Charge : 36217/09</td><td></td></tr><tr><td>Xylazin 2 %</td><td>medistar</td><td>Charge : 04-03-9338/23</td><td></td></tr><tr><td>Consommables</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>20 ml Seringue</td><td>BD Plastipak</td><td></td><td></td></tr><tr><td>250 ml Erlenmeyer</td><td>flacon Schott Duran</td><td>21 226 36</td><td></td></tr><tr><td>25 ml Bécher 2x</td><td>Schott Duran</td><td>50-1150</td><td></td></tr><tr><td>Seringue 2 ml</td><td>BD Plastipak</td><td></td><td></td></tr><tr><td>4-0 Vicryl suture</td><td>Ethicon</td><td>V7980</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>disponible dans</td><td></td><td></td>le commerce</tr><tr><td>Bepanthen Eye et Pommade pour le nez</td><td>Bayer Vital GmbH</td><td>6029009.00.00</td><td></td></tr><tr><td>Change-A-Tip Deluxe Kit de cautérage à haute température</td><td>Fine Science Tools Inc.</td><td>18010-00</td><td></td></tr><tr><td>Coton-gaze éponges</td><td>Fuhrmann GmbH</td><td>32014</td><td></td></tr><tr><td>Cover Slip 24x50 mm</td><td>ROTH</td><td>1871</td><td></td></tr><tr><td>Ruban de soie Durapore</td><td>3M</td><td>1538-1</td><td></td></tr><tr><td>Scalpel jetable en plumes</td><td>Feather</td><td>02.001.30.011</td><td></td></tr><tr><td>Tube en polyéthylène à alésage fin 0,58 mm ID</td><td>Smiths medical</td><td>800/100/200</td><td></td></tr><tr><td>Histoacryl</td><td>Braun</td><td>1050052</td><td>5x 0,5 ml</td></tr><tr><td>Leukoplast</td><td>BSN Medical Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lames de microscope</td><td>ROTH</td><td>1879</td><td></td></tr><tr><td>Poly-alcool Haut&hellip ; farblos Antisepticum</td><td>Antiseptica GmbH</td><td>72PAH200</td><td></td></tr><tr><td>Aiguille stericane 18 G x 1</td><td>B. Braun</td><td>304622</td><td></td></tr><tr><td>Aiguille stericane 27 3/4 G x 1</td><td>B. Braun</td><td>4657705</td><td></td></tr><tr><td>Papier de soie</td><td>disponible dans</td><td></td><td></td>le commerce</tr><tr><td>Instruments</td><td></td><td></td><td></td>chirurgicaux</tr><tr><td>Burnisher à amalgame 3PL</td><td>Gatz</td><td>0110 ?</td><td></td></tr><tr><td>Écarteurs Blair (4 broches (émoussées)) x2</td><td>Storz& Klein</td><td>S-01134</td><td></td></tr><tr><td>Pince Dumont No.7</td><td>Fine Science Tools Inc.</td><td>91197-00</td><td></td></tr><tr><td>Pince Graefe courbée x1</td><td>Fine Science Tools Inc.</td><td>11151-10</td><td></td></tr><tr><td>Pince Graefe droite x2</td><td>Fine Science Tools Inc.</td><td>11050-10</td><td></td></tr><tr><td>Spatule Heidemann HD2</td><td>Stoma</td><td>2030.00</td><td></td></tr><tr><td>Porte-aiguille Mathieu</td><td>Fine Science Tools Inc.</td><td>12010-14</td><td></td></tr><tr><td>Scissor</td><td>Fine Science Tools Inc.</td><td>14074-11</td><td></td></tr><tr><td>Pince Semken</td><td>Fine Science Tools Inc.</td><td>11008-13</td><td></td></tr><tr><td>Petits ciseaux chirurgicaux courbés</td><td>Fine Science Tools Inc.</td><td>14029-10</td><td></td></tr><tr><td>Petits ciseaux chirurgicaux droits</td><td>Fine Science Tools Inc.</td><td>14028-10</td><td></td></tr><tr><td>Pince à motif standard</td><td>Fine Science Tools Inc.</td><td>11000-12</td><td></td></tr><tr><td>Ciseaux à ressort Vannas</td><td>Fine Science Tools Inc.</td><td>15000-08</td><td></td></tr><tr><td>Équipement</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Unité de déclenchement ECG</td><td>Rapid Biomedical</td><td>3000003686</td><td></td></tr><tr><td>MICROCAPSTAR Analyseur de dioxyde de carbone en fin d’expiration</td><td>Instruments AD Minivent</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Typ 845</td><td>Appareil Harvard</td><td>73-0043</td><td></td></tr><tr><td>Microscope multiphotonique Trimscope I</td><td>LaVision</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Perfusor Compact</td><td>B. Braun</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PowerLab 8/30 Enregistreur 8 canaux</td><td>AD Instruments</td><td>PL3508</td><td></td></tr><tr><td>Coussin chauffant à température contrôlée</td><td>Sygonix</td><td>26857617</td><td></td></tr><tr><td>Capteur</td><td>de température disponible</td><td></td><td></td>dans le commerce</tr><tr><td>Système à température contrôlée pour microscopes -Cube& Services</td><td></td><td></td> <td>d’imagerie Box Life</td></tr></tbody></table>

À long terme intravitale microscopie multiphotonique imagerie des cellules immunitaires dans sains et malades du foie en utilisant des souris cxcr6.gfp reporter

Long Term Intravital Multiphoton Microscopy Imaging of Immune Cells in Healthy and Diseased Liver Using CXCR6.Gfp Reporter Mice

<html> inflammation du foie en tant que réponse à une blessure est un processus hautement dynamique impliquant l&#39;infiltration des sous-types distincts de leucocytes, y compris les monocytes, les neutrophiles, les sous-ensembles de cellules T, les cellules B, les cellules tueuses naturelles (NK) et des cellules NKT. Microscopie intravitale du foie pour le suivi de la migration des cellules immunitaires est particulièrement difficile en raison des exigences élevées en ce qui concerne la préparation des échantillons et la fixation, la résolution optique et la survie des animaux à long terme. Pourtant, la dynamique des processus inflammatoires ainsi que des études d&#39;interaction cellulaires pourraient fournir des informations cruciales pour mieux comprendre l&#39;initiation, la progression et la régression de la maladie inflammatoire du foie. Par conséquent, une méthode très sensible et fiable a été créé pour étudier la migration et cellule-cellule-interactions de cellules immunitaires différentes dans le foie de souris sur de longues périodes (environ 6 h) par intravitale deux photons microscopie à balayage laser (TPLSM) en combinaison avec des soins intensifs surveillance. ent &quot;&gt; Le procédé proposé comprend une préparation douce et la fixation stable du foie avec une perturbation minimale de l&#39;organe; imagerie intravitale à long terme en utilisant multicolore multiphotonique microscopie avec pratiquement pas de photoblanchiment ou des effets phototoxiques sur une période de temps allant jusqu&#39;à 6 heures, ce qui permet un suivi de sous-ensembles de leucocytes spécifiques et des conditions de formation d&#39;image stable en raison de la surveillance des paramètres vitaux extensif de souris et de stabilisation de la circulation, la température et l&#39;échange de gaz. Pour étudier la migration des lymphocytes à une inflammation du foie CXCR6.gfp souris knock-in ont été soumis à l&#39;imagerie du foie intravitale dans des conditions de base et après des lésions du foie aiguë et chronique induite par injection intraperitoneale (s) de tétrachlorure de carbone (CCl 4). CXCR6 est un récepteur de chimiokine exprimée sur les lymphocytes, principalement sur tueuses naturelles T (NKT) -, Natural Killer (NK) - et des sous-ensembles de lymphocytes T telles que les cellules T CD4 mais aussi asso muqueusesATED invariant des cellules (MAIT) T 1. Suivant le modèle migratoire et le positionnement de CXCR6.gfp + cellules immunitaires permis un aperçu détaillé dans leur changement de comportement lors d&#39;une lésion du foie et donc leur implication potentielle dans la progression de la maladie.

Pour valider notre approche de TPLSM intravitale, nous avons soumis GFP / + souris CXCR6 à l&#39;imagerie intravitale TPLSM. Les souris ont été soit laissées non traitées comme témoins ou de référence soumis à une injection intraperitoneale unique de tétrachlorure de carbone (CCl 4) pour induire des dommages au foie aiguë 20. Les séquences vidéo ont été prises sur une période de temps de 2 à 5 h, et les cellules ont été retracés au fil du temps en raison de l...

L’imagerie intravitale stable à haute résolution des cellules immunitaires du foie est un défi. Nous proposons ici une méthode très sensible et fiable pour étudier la migration et les interactions cellule-cellule des cellules immunitaires dans le foie de souris sur de longues périodes (environ 6 heures) par microscopie à balayage laser multiphotonique intravital en combinaison avec un suivi en soins intensifs.

À long terme intravitale microscopie multiphotonique imagerie des cellules immunitaires dans sains et malades du foie en utilisant des souris CXCR6.Gfp Reporter

Liver inflammation as a response to injury is a highly dynamic process involving the infiltration of distinct subtypes of leukocytes including monocytes, ...

L'objectif général de l'expérience suivante est de suivre la migration et les interactions des leucocytes au cours d'une maladie inflammatoire du foie en progression. Cela permet de mieux comprendre la séquence des événements sous-jacente au recrutement de ces cellules dans le tissu hépatique et à leur implication potentielle dans l'immunopathologie. Cette approche est réalisée en effectuant d'abord une trachéotomie afin de contrôler la respiration de la souris, une étape cruciale pour assurer la survie à long terme de l'animal.En second lieu, une laparotomie est pratiquée sur la souris afin d'exposer chirurgicalement le foie, permettant ainsi d'accéder à l'organe avec le microscope multiphoton. Ensuite, le foie est fixé et positionné en l'incorporant dans de l'agarose afin de minimiser les artefacts de mouvement. L'imagerie peut être réalisée pendant plusieurs heures, produisant des séquences en laps de temps de haute résolution qui suivent les modifications du recrutement, du positionnement et des interactions des leucocytes individuels.Dans le cadre du développement de l'inflammation hépatique, cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de l'inflammation hépatique aiguë et chronique, telles que le recrutement des leucocytes, les interactions entre cellules, ou les mécanismes de l'immunopathologie. Le principal avantage de cette technique par rapport à la microscopie classique est que la microscopie multifocale permet un imagerie prolongée avec pratiquement aucune perturbation de l'échantillon, une faible photodégradation ou phototoxicité, ainsi que des coupes optiques pouvant atteindre 100 micromètres de profondeur dans le tissu, ce qui est dû à la physique particulière du laser utilisant une lumière laser dans le rouge lointain. Cette méthode peut ainsi fournir des informations essentielles sur les maladies hépatiques.Il peut facilement être adapté à d'autres systèmes. Étant donné que la méthode de stabilisation et de fixation des tissus peut être appliquée à pratiquement toutes les questions d'imagerie intravitale, elle permet d'observer aisément des organes tels que la rate, le rein ou même des tumeurs sous-cutanées à l'aide de cellules marquées fluides. Il est également possible de visualiser tous les sous-ensembles de leucocytes et d'étudier leurs interactions ainsi que l'inflammation hépatique.En général, les personnes novices dans cette méthode éprouveront des difficultés en raison de la complexité extrême de la chirurgie sur petits animaux. Toutefois, selon notre propre expérience, ce facteur limitant ne dure que quelques semaines et nécessite simplement un peu d'habitude pratique. En raison de la fragilité du tissu hépatique, les étapes de préparation sont difficiles à maîtriser, et une démonstration visuelle de la méthode est essentielle. Après avoir préparé l'anesthésique, remplissez le plateau d'aros pour souris avec 3 % d'aros, en le versant selon un angle de 40 degrés.Ensuite, s'assurer que la zone chirurgicale est entièrement désinfectée, de même que tous les instruments requis, etc. Puis anesthésier la souris par une injection intrapéritonéale d'un cocktail anesthésique. Cinq minutes plus tard, vérifier les réflexes de l'animal, désinfecter la peau et appliquer une pommade ophtalmique sur les yeux.Maintenant, fixez la souris sur la table de préparation. À l'aide de ruban adhésif, positionnez-la de manière à exposer délicatement la face ventrale en étirant légèrement le cou. Un élastique accroché aux incisives peut permettre d'obtenir ce résultat.Effectuez maintenant une incision initiale sous le menton d’environ 0,5 à un centimètre de longueur. Ensuite, disséquez soigneusement le tissu conjonctif situé entre les glandes salivaires et repérez le tube musculaire entourant la trachée. Déchirez délicatement le muscle afin d’exposer la trachée.Tirer un fil sous la trachée, puis ouvrir la trachée avec des ciseaux microchirurgicaux en effectuant une incision en forme de T. Insérer le tube de ventilation d'environ un demi-centimètre. Avancer le tube à l'aide de petites pinces anatomiques.Ensuite, fixez le tube à l'aide de fils de suture. Puis, pour une sécurité accrue, suturer le tube à la peau, refermer l'incision cutanée à l'aide de cyanoacrylate et fixer le tube sur la tête de l'animal. À l'aide d'un ruban adhésif, maintenir l'anesthésie en utilisant un débit continu de 2 % iso fluorine.Après avoir préparé la souris pour la chirurgie, faites une petite incision cutanée sous le sternum et prolongez-la latéralement sous les côtes de chaque côté. Cautérisez tous les vaisseaux sanguins exposés au cours de cette procédure. Pour minimiser les saignements, effectuez une petite incision initiale au niveau de l'articulation du coude afin d'accéder à la cavité abdominale.Étendez l'incision horizontalement, en fermant tous les vaisseaux sanguins et en permettant l'accès au foie. Transférez maintenant la souris sur la platine d'agrandissement et empilez des lamelles de part et d'autre de l'animal pour l'immobiliser. Ces piles doivent correspondre à la hauteur de la souris afin que la platine destinée au foie, qui sera placée ultérieurement, n'exerce pas une pression excessive sur l'abdomen.À présent, à l’aide de fils de suture au niveau du sternum, écarter les côtes. Un fil 4-0 suffit. Après avoir écarté les côtes, sectionner les ligaments reliant le foie et le diaphragme en allant jusqu’à l’aorte, mais travailler avec une extrême prudence afin de ne pas rompre ou sectionner le vaisseau. Sectionner également le ligament qui relie le foie au tube digestif.Tournez la souris de 45 degrés pour améliorer l'accès au lobe hépatique plus volumineux. Prenez un couvre-objet standard et collez-le sur ses bords afin qu'il ne soit pas tranchant. Placez-le au-dessus de la cavité abdominale.Cela servira de plateau pour positionner le foie sur le support. Faites glisser délicatement une sonde à double embout sphérique ou une spatule rembourrée sous le foie et maintenez le sommet de l'organe. L'utilisation d'un tissu humide exerce une pression mécanique qui lésionne instantanément le tissu hépatique ; il est donc essentiel de manipuler l'organe avec précaution.Ensuite, soulevez le lobe et placez-le sur la lame en le tirant doucement pour le positionner. Le lobe se retrouvera généralement incurvé ou plié ; essayez délicatement de déplier les bords en soulevant le tissu avec une spatule fine ou un morceau de papier humide. Ajoutez ensuite des supports latéraux sous forme de lamelles ou de lames.Empilez les lamelles afin qu'elles aient la même hauteur que le lobe hépatique. La mise en place et la fixation du foie constituent l'étape la plus cruciale du protocole. Tout stress mécanique, torsion ou pression entraînera une lésion tissulaire immédiate ou, à tout le moins, une altération du flux sanguin dans les vaisseaux sinusoïdaux.Maintenant, placez une grande lame couvre-objet aux bords recouverts de ruban adhésif au-dessus du lobe hépatique, soutenue par les supports latéraux. Positionnez cette lame couvre-objet aussi horizontalement que possible. Elle ne doit pas comprimer le foie.Le tissu blanc indique une circulation sanguine altérée, sauf si l'imagerie est réalisée rapidement. Il est maintenant nécessaire d'insérer deux cathéters intrapéritonéaux indépendants afin d'assurer une anesthésie prolongée et d'appliquer le G cinq. Ces cathéters sont constitués d'aiguilles de calibre 27 et de tubulures en silicone souples.Ensuite, démarrez leur écoulement à l'aide de pompes à seringue. Insérez les cathéters dans l'abdomen inférieur près des membres postérieurs. Après avoir fixé les moniteurs vitaux à la souris, préparez 100 millilitres de 3 % aros dans un XPBS.Lorsque l'agarose a refroidi à 41 degrés Celsius, inclure le foie à l'aide d'une seringue de cinq millilitres munie d'une aiguille de calibre 18. Une fois que l'agarose a refroidi, utiliser une spatule de Heideman pour retirer l'excédent et exposer un champ de vision suffisamment grand pour balayer le foie. Ensuite, procéder au balayage.Une fois le champ de vision préparé, déplacez la souris sous le microscope afin de sélectionner les zones de balayage appropriées pour l'acquisition d'images en laps de temps. Le tissu hépatique est balayé visuellement à l’aide d’une source de lumière blanche externe, en identifiant des champs représentatifs présentant un flux sanguin suffisant et une perturbation minimale de l’échantillon. Des souris CXCR six GFP hétérozygotes ont été soumises à une imagerie T-P-L-S-M intravitale dans le cadre d’une expérience. Certaines ont reçu une injection intrapéritonéale de tétrachlorure pour induire un dommage hépatique aigu.Les cellules modales exprimant la GFP ont été suivies par vidéo et leurs trajectoires ont été superposées afin d'obtenir un aperçu de la mobilité cellulaire. Les trajectoires ont ensuite été normalisées. Les foies normaux présentaient des cellules aux schémas de migration aléatoires.Les foies injectés avec du CCI quatre présentaient une altération de la migration cellulaire. En mesurant le déplacement total à partir de leur origine, il était clair qu'il y avait un piégeage cellulaire 36 heures après le traitement au CCI quatre au site du dommage hépatocytaire. L'altération de la migration due au dommage hépatique pouvait également être démontrée en traçant la vitesse de migration des cellules individuelles au fil du temps, montrant un arrêt partiel après 18 heures et un arrêt migratoire complet après 36 heures.La réduction de la vitesse des cellules migratrices pouvait également être démontrée comme étant statistiquement significative lorsque les cellules étaient comparées en tant que populations. Ainsi, cette approche convient pour suivre les modifications de la migration et du positionnement cellulaires au cours du développement d'une maladie hépatique. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment préparer le foie d'une souris pour une microscopie multiphoton in vivo.La méthode que nous fournissons ici nous permet de stabiliser l'animal pour une survie à long terme ainsi que de minimiser les artefacts de mouvement dus à la méthode de fixation douce que nous proposons. Une fois masqué, cette technique peut être réalisée en environ une heure si elle est effectuée correctement. Au cours de cette procédure, il est important de contrôler les paramètres vitaux des animaux, notamment la température, la fréquence cardiaque, les niveaux d'oxygène et de CO2. Cela peut être obtenu en adaptant la profondeur de la nécrose et de la respiration selon cette technique.D'autres procédures telles que l'analyse par cytométrie en flux ou la microdissection par capture laser peuvent être réalisées afin de répondre à des questions supplémentaires, comme le phénotype des cellules immunitaires infiltrantes ou les médiateurs sécrétés par les cellules tissulaires ou infiltrantes après leur développement. Ces techniques ont permis aux chercheurs d'obtenir des informations sur la dynamique du trafic des leucocytes et des interactions cellulaires dans le foie, permettant ainsi d'élucider la séquence des événements menant aux maladies hépatiques inflammatoires. Veuillez suivre les consignes de sécurité relatives au laser lors de l'imagerie à l'aide d'un laser infrarouge à impulsions de haute énergie utilisé en microscopie multiphoton.Veillez à ce qu'aucun reflet du rayonnement laser ne puisse présenter un danger pour vos yeux et votre peau pendant la réalisation de cette expérience.

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Immunologie et infection

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À long terme intravitale microscopie multiphotonique imagerie des cellules immunitaires dans sains et malades du foie en utilisant des souris CXCR6.Gfp Reporter (Vidéo) | JoVE Journal

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