À long terme intravitale microscopie multiphotonique imagerie des cellules immunitaires dans sains et malades du foie en utilisant des souris CXCR6.Gfp Reporter

L'objectif général de l'expérience suivante est de suivre la migration et les interactions des leucocytes au cours d'une maladie inflammatoire du foie en progression. Cela permet de mieux comprendre la séquence des événements sous-jacente au recrutement de ces cellules dans le tissu hépatique et à leur implication potentielle dans l'immunopathologie. Cette approche est réalisée en effectuant d'abord une trachéotomie afin de contrôler la respiration de la souris, une étape cruciale pour assurer la survie à long terme de l'animal.

En second lieu, une laparotomie est pratiquée sur la souris afin d'exposer chirurgicalement le foie, permettant ainsi d'accéder à l'organe avec le microscope multiphoton. Ensuite, le foie est fixé et positionné en l'incorporant dans de l'agarose afin de minimiser les artefacts de mouvement. L'imagerie peut être réalisée pendant plusieurs heures, produisant des séquences en laps de temps de haute résolution qui suivent les modifications du recrutement, du positionnement et des interactions des leucocytes individuels.

Dans le cadre du développement de l'inflammation hépatique, cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de l'inflammation hépatique aiguë et chronique, telles que le recrutement des leucocytes, les interactions entre cellules, ou les mécanismes de l'immunopathologie. Le principal avantage de cette technique par rapport à la microscopie classique est que la microscopie multifocale permet un imagerie prolongée avec pratiquement aucune perturbation de l'échantillon, une faible photodégradation ou phototoxicité, ainsi que des coupes optiques pouvant atteindre 100 micromètres de profondeur dans le tissu, ce qui est dû à la physique particulière du laser utilisant une lumière laser dans le rouge lointain. Cette méthode peut ainsi fournir des informations essentielles sur les maladies hépatiques.

Il peut facilement être adapté à d'autres systèmes. Étant donné que la méthode de stabilisation et de fixation des tissus peut être appliquée à pratiquement toutes les questions d'imagerie intravitale, elle permet d'observer aisément des organes tels que la rate, le rein ou même des tumeurs sous-cutanées à l'aide de cellules marquées fluides. Il est également possible de visualiser tous les sous-ensembles de leucocytes et d'étudier leurs interactions ainsi que l'inflammation hépatique.

En général, les personnes novices dans cette méthode éprouveront des difficultés en raison de la complexité extrême de la chirurgie sur petits animaux. Toutefois, selon notre propre expérience, ce facteur limitant ne dure que quelques semaines et nécessite simplement un peu d'habitude pratique. En raison de la fragilité du tissu hépatique, les étapes de préparation sont difficiles à maîtriser, et une démonstration visuelle de la méthode est essentielle. Après avoir préparé l'anesthésique, remplissez le plateau d'aros pour souris avec 3 % d'aros, en le versant selon un angle de 40 degrés.

Ensuite, s'assurer que la zone chirurgicale est entièrement désinfectée, de même que tous les instruments requis, etc. Puis anesthésier la souris par une injection intrapéritonéale d'un cocktail anesthésique. Cinq minutes plus tard, vérifier les réflexes de l'animal, désinfecter la peau et appliquer une pommade ophtalmique sur les yeux.

Maintenant, fixez la souris sur la table de préparation. À l'aide de ruban adhésif, positionnez-la de manière à exposer délicatement la face ventrale en étirant légèrement le cou. Un élastique accroché aux incisives peut permettre d'obtenir ce résultat.

Effectuez maintenant une incision initiale sous le menton d’environ 0,5 à un centimètre de longueur. Ensuite, disséquez soigneusement le tissu conjonctif situé entre les glandes salivaires et repérez le tube musculaire entourant la trachée. Déchirez délicatement le muscle afin d’exposer la trachée.

Tirer un fil sous la trachée, puis ouvrir la trachée avec des ciseaux microchirurgicaux en effectuant une incision en forme de T. Insérer le tube de ventilation d'environ un demi-centimètre. Avancer le tube à l'aide de petites pinces anatomiques.

Ensuite, fixez le tube à l'aide de fils de suture. Puis, pour une sécurité accrue, suturer le tube à la peau, refermer l'incision cutanée à l'aide de cyanoacrylate et fixer le tube sur la tête de l'animal. À l'aide d'un ruban adhésif, maintenir l'anesthésie en utilisant un débit continu de 2 % iso fluorine.

Après avoir préparé la souris pour la chirurgie, faites une petite incision cutanée sous le sternum et prolongez-la latéralement sous les côtes de chaque côté. Cautérisez tous les vaisseaux sanguins exposés au cours de cette procédure. Pour minimiser les saignements, effectuez une petite incision initiale au niveau de l'articulation du coude afin d'accéder à la cavité abdominale.

Étendez l'incision horizontalement, en fermant tous les vaisseaux sanguins et en permettant l'accès au foie. Transférez maintenant la souris sur la platine d'agrandissement et empilez des lamelles de part et d'autre de l'animal pour l'immobiliser. Ces piles doivent correspondre à la hauteur de la souris afin que la platine destinée au foie, qui sera placée ultérieurement, n'exerce pas une pression excessive sur l'abdomen.

À présent, à l’aide de fils de suture au niveau du sternum, écarter les côtes. Un fil 4-0 suffit. Après avoir écarté les côtes, sectionner les ligaments reliant le foie et le diaphragme en allant jusqu’à l’aorte, mais travailler avec une extrême prudence afin de ne pas rompre ou sectionner le vaisseau. Sectionner également le ligament qui relie le foie au tube digestif.

Tournez la souris de 45 degrés pour améliorer l'accès au lobe hépatique plus volumineux. Prenez un couvre-objet standard et collez-le sur ses bords afin qu'il ne soit pas tranchant. Placez-le au-dessus de la cavité abdominale.

Cela servira de plateau pour positionner le foie sur le support. Faites glisser délicatement une sonde à double embout sphérique ou une spatule rembourrée sous le foie et maintenez le sommet de l'organe. L'utilisation d'un tissu humide exerce une pression mécanique qui lésionne instantanément le tissu hépatique ; il est donc essentiel de manipuler l'organe avec précaution.

Ensuite, soulevez le lobe et placez-le sur la lame en le tirant doucement pour le positionner. Le lobe se retrouvera généralement incurvé ou plié ; essayez délicatement de déplier les bords en soulevant le tissu avec une spatule fine ou un morceau de papier humide. Ajoutez ensuite des supports latéraux sous forme de lamelles ou de lames.

Empilez les lamelles afin qu'elles aient la même hauteur que le lobe hépatique. La mise en place et la fixation du foie constituent l'étape la plus cruciale du protocole. Tout stress mécanique, torsion ou pression entraînera une lésion tissulaire immédiate ou, à tout le moins, une altération du flux sanguin dans les vaisseaux sinusoïdaux.

Maintenant, placez une grande lame couvre-objet aux bords recouverts de ruban adhésif au-dessus du lobe hépatique, soutenue par les supports latéraux. Positionnez cette lame couvre-objet aussi horizontalement que possible. Elle ne doit pas comprimer le foie.

Le tissu blanc indique une circulation sanguine altérée, sauf si l'imagerie est réalisée rapidement. Il est maintenant nécessaire d'insérer deux cathéters intrapéritonéaux indépendants afin d'assurer une anesthésie prolongée et d'appliquer le G cinq. Ces cathéters sont constitués d'aiguilles de calibre 27 et de tubulures en silicone souples.

Ensuite, démarrez leur écoulement à l'aide de pompes à seringue. Insérez les cathéters dans l'abdomen inférieur près des membres postérieurs. Après avoir fixé les moniteurs vitaux à la souris, préparez 100 millilitres de 3 % aros dans un XPBS.

Lorsque l'agarose a refroidi à 41 degrés Celsius, inclure le foie à l'aide d'une seringue de cinq millilitres munie d'une aiguille de calibre 18. Une fois que l'agarose a refroidi, utiliser une spatule de Heideman pour retirer l'excédent et exposer un champ de vision suffisamment grand pour balayer le foie. Ensuite, procéder au balayage.

Une fois le champ de vision préparé, déplacez la souris sous le microscope afin de sélectionner les zones de balayage appropriées pour l'acquisition d'images en laps de temps. Le tissu hépatique est balayé visuellement à l’aide d’une source de lumière blanche externe, en identifiant des champs représentatifs présentant un flux sanguin suffisant et une perturbation minimale de l’échantillon. Des souris CXCR six GFP hétérozygotes ont été soumises à une imagerie T-P-L-S-M intravitale dans le cadre d’une expérience. Certaines ont reçu une injection intrapéritonéale de tétrachlorure pour induire un dommage hépatique aigu.

Les cellules modales exprimant la GFP ont été suivies par vidéo et leurs trajectoires ont été superposées afin d'obtenir un aperçu de la mobilité cellulaire. Les trajectoires ont ensuite été normalisées. Les foies normaux présentaient des cellules aux schémas de migration aléatoires.

Les foies injectés avec du CCI quatre présentaient une altération de la migration cellulaire. En mesurant le déplacement total à partir de leur origine, il était clair qu'il y avait un piégeage cellulaire 36 heures après le traitement au CCI quatre au site du dommage hépatocytaire. L'altération de la migration due au dommage hépatique pouvait également être démontrée en traçant la vitesse de migration des cellules individuelles au fil du temps, montrant un arrêt partiel après 18 heures et un arrêt migratoire complet après 36 heures.

La réduction de la vitesse des cellules migratrices pouvait également être démontrée comme étant statistiquement significative lorsque les cellules étaient comparées en tant que populations. Ainsi, cette approche convient pour suivre les modifications de la migration et du positionnement cellulaires au cours du développement d'une maladie hépatique. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment préparer le foie d'une souris pour une microscopie multiphoton in vivo.

La méthode que nous fournissons ici nous permet de stabiliser l'animal pour une survie à long terme ainsi que de minimiser les artefacts de mouvement dus à la méthode de fixation douce que nous proposons. Une fois masqué, cette technique peut être réalisée en environ une heure si elle est effectuée correctement. Au cours de cette procédure, il est important de contrôler les paramètres vitaux des animaux, notamment la température, la fréquence cardiaque, les niveaux d'oxygène et de CO2. Cela peut être obtenu en adaptant la profondeur de la nécrose et de la respiration selon cette technique.

D'autres procédures telles que l'analyse par cytométrie en flux ou la microdissection par capture laser peuvent être réalisées afin de répondre à des questions supplémentaires, comme le phénotype des cellules immunitaires infiltrantes ou les médiateurs sécrétés par les cellules tissulaires ou infiltrantes après leur développement. Ces techniques ont permis aux chercheurs d'obtenir des informations sur la dynamique du trafic des leucocytes et des interactions cellulaires dans le foie, permettant ainsi d'élucider la séquence des événements menant aux maladies hépatiques inflammatoires. Veuillez suivre les consignes de sécurité relatives au laser lors de l'imagerie à l'aide d'un laser infrarouge à impulsions de haute énergie utilisé en microscopie multiphoton.

Veillez à ce qu'aucun reflet du rayonnement laser ne puisse présenter un danger pour vos yeux et votre peau pendant la réalisation de cette expérience.