À long terme intravitale microscopie multiphotonique imagerie des cellules immunitaires dans sains et malades du foie en utilisant des souris CXCR6.Gfp Reporter

L’objectif général de l’expérience suivante est de suivre la migration et l’interaction des leucocytes dans la progression de la maladie inflammatoire du foie. Mieux comprendre la séquence des événements sous-jacents à la façon dont ces cellules sont recrutées dans le tissu hépatique et leur implication potentielle dans l’immunopathologie. Ceci est réalisé en effectuant d’abord une trachéotomie pour prendre le contrôle de la respiration de la souris, une étape cruciale pour assurer la survie à long terme de l’animal.

Dans un deuxième temps, la souris est laparotomie pour exposer chirurgicalement le foie, donnant accès à l’organe avec le microscope multiphotonique. Ensuite, le foie est fixé et positionné en l’intégrant dans la rose pour minimiser les artefacts de mouvement. L’imagerie peut être réalisée sur plusieurs heures, ce qui permet d’obtenir des séquences en accéléré à haute résolution qui suivent les changements de recrutement, de positionnement et d’interaction des leucocytes individuels.

Dans le processus de développement de l’inflammation hépatique, cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de l’inflammation hépatique aiguë et chronique, telles que le recrutement des leucocytes, les interactions cellulaires ou les mécanismes d’immunopathologie. Le principal avantage de cette technique par rapport à la microscopie conventionnelle est que la microscopie multifocale permet une imagerie à long terme avec pratiquement aucune perturbation de l’échantillon avec un faible blanchiment du poulain ou une phototoxicité, ainsi que des coupes optiques jusqu’à 100 micromètres de profondeur dans le tissu, et cela est dû à la physique unique du laser de la lumière laser rouge lointain. Eh bien, cette méthode peut donner un aperçu des maladies du foie.

Il peut facilement être adopté par d’autres systèmes. Depuis la méthode de stabilisation et de fixation, le tissu peut être appliqué à pratiquement toutes les questions de microscopie intravitale, de sorte qu’il peut facilement imager des organes tels que la rate, les reins ou même les tumeurs sous-cutanées en utilisant des cellules apparentées fluentes. Il est également possible de visualiser tous les sous-ensembles leucocytaires et d’y envoyer leurs interactions et l’inflammation du foie.

En général, les personnes qui ne connaissent pas cette méthode auront du mal à cause de l’extrême complexité de la chirurgie des petits animaux. Cependant, en raison de notre propre expérience, ce n’est qu’un facteur limitant pendant quelques semaines et ne nécessite qu’une certaine routine pratique. En raison de la fragilité du tissu hépatique, les étapes de préparation sont difficiles à apprendre et une démonstration visuelle de la méthode est essentielle. Après avoir mis en place les anesthésiques, remplissez l’étage aro de la souris avec 3 % d’aros, en le versant à un angle de 40 degrés.

Assurez-vous ensuite que la zone de travail chirurgicale est entièrement désinfectée, ainsi que tous les instruments nécessaires, etc. Ensuite, anesthésie la souris avec une injection intrapéritonéale d’un cocktail anesthésique. Cinq minutes plus tard, vérifiez les réflexes de l’animal, puis désinfectez la peau et appliquez une pommade ophtalmique sur les yeux.

Maintenant, fixez la souris à la table de préparation. À l’aide de ruban adhésif, positionnez-le de manière à exposer la face ventrale en étirant doucement le cou. Un élastique accroché aux incisives peut accomplir cela.

Maintenant, effectuez l’incision initiale sous le menton d’environ 0,5 à un centimètre de long. Ensuite, disséquez soigneusement le tissu conjonctif entre les glandes salivaires et trouvez le tube musculaire entourant la trachée. Déchirez doucement le muscle pour exposer la trachée.

Tirez un fil sous la trachée, puis ouvrez la trachée avec des micro-ciseaux en utilisant une incision en forme de T dans l’incision. Insérez le tube de ventilation d’environ un demi-centimètre. Faites avancer le tube à l’aide d’une petite pince anatomique.

Fixez ensuite le tube avec des sutures. Ensuite, pour plus de sécurité, suturez le tube à la peau, scellez l’incision dans la peau à l’aide de cyanoacrylate et fixez le tube à la tête de l’animal. À l’aide de ruban adhésif, maintenez l’anesthésie en utilisant un flux continu de fluor iso à 2 %.

Après avoir préparé la souris pour la chirurgie, faites une petite incision cutanée sous le sternum et étendez la coupe latéralement sous les côtes de chaque côté. Cautériser tous les vaisseaux sanguins exposés dans ce processus. Pour minimiser les saignements, effectuez une petite incision initiale au niveau du coude linéaire pour accéder à la cavité abdominale.

Étendez la coupe horizontalement, en scellant tous les vaisseaux sanguins et en donnant accès au foie. Maintenant, transférez la souris à l’étape agro et empilez les lames de chaque côté de l’animal pour l’aider à rester en place. Ces piles doivent correspondre à la hauteur de la souris afin que la scène pour le foie, qui sera placée plus tard, n’applique pas une pression excessive sur l’abdomen.

Maintenant, à l’aide de sutures dans le sternum, rétractez les côtes. Après avoir rétracté les côtes, coupez les ligaments reliant le foie et le diaphragme jusqu’à l’aorte, mais faites très attention à ne pas rompre ou couper le vaisseau. Coupez également le ligament qui relie le foie et le tractus gastro-intestinal.

Tournez la souris de 45 degrés pour améliorer l’accès au plus grand lobe du foie. Prenez une lamelle standard et collez-la le long de ses bords pour qu’elle ne soit pas tranchante. Placez-le sur la cavité abdominale.

Cela servira de scène pour que le foie positionne le foie sur la scène. Glissez soigneusement une sonde à stylet à double boule ou une spatule rembourrée sous le foie et tenez le haut de l’organe. L’utilisation d’une pression mécanique tissulaire humide lésionnera instantanément le tissu hépatique, il est donc essentiel de manipuler l’organe avec soin.

Soulevez ensuite le lobe sur la glissière et tirez-le doucement et mettez-le en position. Le lobe finira généralement par être plié ou plié, essayez de déplier doucement les bords en soulevant le tissu avec une spatule fine ou un chiffon humide. Ensuite, ajoutez des supports latéraux sous forme de lamelles ou de glissières.

Empilez les lamelles pour qu’elles soient de la même hauteur que le lobe du foie. La stadification et la fixation du foie sont l’étape la plus cruciale du protocole. Toute contrainte mécanique, torsion ou pression entraînera des lésions tissulaires instantanées ou au moins une altération de la circulation sanguine dans les vaisseaux sinusoïdaux.

Maintenant, placez une grande lamelle avec des bords collés sur le lobe du foie soutenu par les supports latéraux. Positionnez cette lamelle de recouvrement aussi horizontalement que possible. Il ne doit pas presser le foie.

Les tissus blancs indiquent une altération de la circulation sanguine, à moins que l’imagerie ne se déroule rapidement. Il est maintenant nécessaire d’insérer deux cathéters intrapéritonéaux indépendants pour assurer une anesthésie à long terme et d’appliquer G cinq. Ceux-ci sont assemblés à partir d’aiguilles de calibre 27 et d’un tube en silicone flexible.

Ensuite, commencez leur écoulement à l’aide de pousse-seringues. Insérez les cathéters dans le bas-ventre, près des membres postérieurs. Après avoir fixé les moniteurs vitaux à la souris, préparez 100 millilitres de 3 % aros dans un XPBS.

Lorsque l’aros a refroidi à 41 degrés Celsius, enfoncez-y le foie à l’aide d’une seringue de cinq millilitres avec une aiguille de calibre 18. Une fois que l’aéros a refroidi, utilisez une spatule heideman pour enlever l’excédent et exposer un champ de vision suffisamment grand pour scanner le foie. Procédez ensuite à l’analyse.

Une fois le champ de vision préparé, passez la souris sous le microscope pour sélectionner les zones de balayage appropriées pour l’imagerie en accéléré. Le tissu hépatique est scanné à l’œil nu à l’aide d’une source externe de lumière blanche identifiant des champs représentatifs avec un flux sanguin suffisant et une perturbation minimale de l’échantillon CXCR six souris hétérozygotes GFP ont été soumises à une imagerie intravitale T-P-L-S-M à titre expérimental. Certains ont reçu une injection intrapéritonéale de tétrachlorure pour induire des lésions hépatiques aiguës.

Les cellules modales exprimant la GFP ont été suivies par vidéo et leurs traces ont été superposées pour obtenir un instantané de la mobilité cellulaire. Les pistes ont alors été normalisées. Les foies normaux avaient des cellules avec des schémas de migration aléatoires.

Les foies injectés avec CCI quatre ont montré une altération de la migration cellulaire. En mesurant le déplacement total depuis leur origine, il était clair qu’il y avait piégeage cellulaire 36 heures après le traitement CCI quatre sur le site des lésions hépatocellulaires. Une migration altérée par les lésions hépatiques a également pu être mise en évidence en traçant la vitesse de migration des cellules individuelles au fil du temps, montrant un arrêt partiel après 18 heures et un arrêt migratoire complet après 36 heures.

La réduction de la vitesse des cellules migratrices a également pu s’avérer statistiquement significative lorsque les cellules ont été comparées en tant que populations. Ainsi, cette approche convient pour suivre les changements dans la migration cellulaire et le positionnement dans le développement de la maladie du foie. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de préparer le foie d’une souris pour la multi-photomicroscopie intra-vitale.

La méthode que nous fournissons ici nous permet de stabiliser l’animal pour sa survie à long terme ainsi que de minimiser les artefacts de mouvement grâce à la méthode de fixation douce que nous fournissons. Une fois masquée, cette technique peut être réalisée en environ une heure si elle est correctement exécutée Au cours de cette procédure, il est important de contrôler les paramètres vitaux des animaux stabilisant la température, la fréquence cardiaque, l’oxygène et les niveaux de CO2. Cela peut être réalisé en adaptant la profondeur de la nécrose et de la respiration en suivant cette technique.

D’autres procédures telles que l’analyse par cytométrie en flux ou la micro dissection par capture laser peuvent être effectuées afin de répondre à des questions supplémentaires telles que le phénotype des cellules immunitaires infiltrantes ou les médiateurs sécrétés par les tissus ou les cellules infiltrantes après son développement. Cette technique a permis aux chercheurs de mieux comprendre la dynamique du trafic leucocytaire et des interactions cellulaires dans le foie, ce qui a permis de disséquer la séquence d’événements conduisant aux maladies inflammatoires du foie. Veuillez suivre les directives de sécurité laser en effectuant l’imagerie avec un laser infrarouge à impulsions à haute énergie utilisé pour la multi-photomicroscopie.

Assurez-vous qu’aucune réflexion du rayonnement laser ne peut présenter de danger pour vos yeux et votre peau pendant la réalisation de cette expérience.