Name: Pairwise croissance de la concurrence analyse pour déterminer la condition physique réplication du virus de limmunodéficience humaines (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-05-04T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 19 s
Description: Découvrez les essais de compétition de croissance par paires pour mesurer la fitness de réplication du VIH-1. Cette méthode utilise la PCR quantitative et le séquençage Sanger pour analyser les cinétiques virales.

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Ces études ont été financées par des subventions des services de santé publique des États-Unis P01AI057005, R01AI047734, R01AI111806 et le Functional Profiling and Computational Biology Core du Center for AIDS Research de l’Université de Washington (P30 AI027757).

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<li>Martinez-Picado, J., Savara, A. V., Sutton, L., D'Aquila, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replicative+fitness+of+protease+inhibitor-resistant+mutants+of+human+immunodeficiency+virus+type+1%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Replicative fitness of protease inhibitor-resistant mutants of human immunodeficiency virus type 1.</a> J Virol. 73 (5), 3744-3752 (1999).</li>
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<li>Maarseveen, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+real-time+PCR+assay+to+determine+relative+replication+capacity+for+HIV-1+protease+variants+and%2For+reverse+transcriptase+variants%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol+Methods%22%5BJournal%5D)">A novel real-time PCR assay to determine relative replication capacity for HIV-1 protease variants and/or reverse transcriptase variants.</a> J Virol Methods. 133 (2), 185-194 (2006).</li>
<li>Liu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolution+of+human+immunodeficiency+virus+type+1+cytotoxic+T-lymphocyte+epitopes%3A+fitness-balanced+escape%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Evolution of human immunodeficiency virus type 1 cytotoxic T-lymphocyte epitopes: fitness-balanced escape.</a> J Virol. 81 (22), 12179-12188 (2007).</li>
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<li>Abraha, A., Troyer, R. M., Quinones-Mateu, M. E., Arts, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+to+determine+HIV-1+ex+vivo+fitness%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Methods to determine HIV-1 ex vivo fitness.</a> Methods Mol Biol. 304, 355-368 (2005).</li>
<li>Liu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+sensitive+real-time+PCR+based+assay+to+estimate+the+impact+of+amino+acid+substitutions+on+the+competitive+replication+fitness+of+human+immunodeficiency+virus+type+1+in+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol+Methods%22%5BJournal%5D)">A sensitive real-time PCR based assay to estimate the impact of amino acid substitutions on the competitive replication fitness of human immunodeficiency virus type 1 in cell culture.</a> J Virol Methods. 189 (1), 157-166 (2013).</li>
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Les auteurs déclarent qu&#39;ils ont aucun intérêt financier concurrentes. Les opinions exprimées sont celles des auteurs et ne doivent pas être interprétées comme officiel ou représentant les opinions du ministère américain de la Défense ou du ministère de l&#39;Armée.

Les protocoles présentés se composait de deux parties principales: la construction du VIH-1 clones moléculaires recombinantes et des essais de compétition de croissance. Afin de distinguer les deux virus dans une culture de cellules doublement infectées, il est important que les clones moléculaires concurrentes contiennent des marqueurs de séquences, qui peuvent être détectés par un dosage amorce-sonde RT-qPCR ou par séquençage de Sanger. Ce protocole utilise les Vifa et VifB étiquettes, qui occupent la même région de HIV-1 NL4-3 vif et codent pour la séquence d&#39;acides aminés identique, mais diffèrent par six mutations synonymes. Ces mutations ont été présentés pour ne pas affecter la réplication virale remise en forme 20. La méthode de clonage par PCR utilisée dans ce protocole prévoit une plus grande flexibilité dans le choix des sites de clonage, par rapport à des sites de restriction clonage basé. Cependant, l&#39;efficacité de clonage PCR diminue à mesure que la taille augmente insert. La limite de courant de la taille de l&#39;insert est 34 ~ 5 kb. Pour le clonage basé sur la PCR et du site dirigé mutagenesis, l&#39;utilisation d&#39;une ADN polymerase haute fidélité est essentiel de réduire la probabilité de mutations supplémentaires. L&#39;utilisation du nombre minimal de cycles PCR nécessaires pour obtenir des quantités suffisantes de produits est également recommandé. Dans notre expérience, nous ne détectons aucune mutation supplémentaire après le clonage et dirigée vers le site étapes de mutagenèse basées sur la PCR décrites ici. Néanmoins, les produits de PCR doivent être séquencés pour vérifier toutes les mutations indésirables. Idéalement, la région codante entière du VIH doit être reséquencé. Au moins trois points de temps échantillonnage doivent être examinées dans la phase de croissance exponentielle 9. La cinétique de croissance virales doivent d&#39;abord être établies en utilisant échantillonnage quotidien pour déterminer la période de culture et de temps d&#39;échantillonnage des points appropriés pour la compétition de croissance. Un facteur qui affecte la cinétique de croissance virale est la multiplicité d&#39;infection (MOI). Ce protocole utilise un total de 0,005 MOI pour les mono-infection et de la concurrence de la croissance, comme il a été montré pour donner plus de roRésultats buste que IAM inférieur 9. Néanmoins, IAM inférieures peuvent être utilisées pour obtenir une phase de croissance exponentielle plus si nécessaire, mais au détriment de la cohérence résultat. Ce protocole indique un rapport de 50:50 de l&#39;infection initiale, en supposant que la différence de forme physique des virus sont généralement inconnue à l&#39;avance. Cependant, l&#39;utilisation de ratios d&#39;entrée inégales sont appropriées quand il ya des données préliminaires suggérant des différences significatives dans la cinétique de la réplication virale. Dans ces cas, un rapport d&#39;infection de 70:30 est recommandé afin de permettre la détection d&#39;une grande différence de remise en forme où le virus moins en forme est mis en excès neuf. Le protocole pour déterminer la DICT 50, la cinétique de croissance virales, et pour effectuer la croissance des essais de compétition ont été optimisés en utilisant le VIH-1 sous-type B, NL4-3 COTB-p24, et PBMC provenant d&#39;un seul donneur dont CMSP ont démontré la sensibilité cohérente pour le VIH une infection in vitro. La période de cultureet les points de temps d&#39;échantillonnage présentés dans ce protocole sont susceptibles d&#39;être adapté à l&#39;étude des virus VIH-1 groupe M dans les CMSP humaines. Utilisation CMSP d&#39;une source unique est fortement recommandé d&#39;obtenir des résultats cohérents que la réplication virale peut varier dans différentes cellules du donneur 35. Bien que moins souhaitable, des PBMC mises en commun provenant de plusieurs donneurs peuvent être utilisés comme une substitution à condition que le même pool est utilisé dans toutes les expériences. Une autre alternative est l&#39;utilisation de lignées cellulaires. Le protocole présenté ici a été utilisé avec succès par la lignée de cellules T CEMx174 23,36. Cependant, il est important que le nombre de cellules ensemencées sont ré-optimisées pour atteindre une croissance cellulaire cohérente. La cinétique de croissance virales doivent être rétablis, car il est susceptible de varier dans différentes lignées cellulaires, afin de déterminer les points de temps d&#39;échantillonnage appropriés dans les étapes de compétition de croissance. Deux méthodes différentes pour déterminer le rapport virale pour le calcul de remise en forme sont inclus dans le protocol. La première utilise RT-qPCR pour mesurer virale nombre de copies d&#39;ADNc à chaque point de temps d&#39;échantillonnage. La réplication virale remise en forme a ensuite été calculée à partir du rapport virale, sur la base de l&#39;ADNc nombre de copies. En variante, le rapport viral peut être déterminée sur la base du rapport de la hauteur de pic de chromatogramme sur les sites d&#39;étiquette VifAB. Les deux méthodes ont donné des résultats comparables (Figure 4). Le procédé de la hauteur de pic chromatogramme peut être appliquée à d&#39;autres souches du VIH-1 sans un marqueur de séquence d&#39;ingénierie. Pour RT-qPCR, l&#39;utilisation des amorces ou des sondes pour distinguer les variants viraux doit d&#39;abord être évaluée avec soin (voir 20). Néanmoins, RT-qPCR fournit une meilleure sensibilité pour des échantillons contenant une petite quantité de l&#39;ARN viral, telles que celles du premier point de temps à l&#39;intérieur de la phase de croissance exponentielle. La mesure directe des ADNc viral permet également de détecter les problèmes techniques qui peuvent survenir de l&#39;extraction de l&#39;ARN et la synthèse d&#39;ADNc. Utilisation de clones moléculaires avec des étiquettes de séquence fournit une solution rentable to les méthodes de RT-qPCR, car seuls deux couples d&#39;amorces et sondes sont nécessaires pour étudier les virus multiples. Cette stratégie évite également le problème de la variation en hauteur de pic séquence chromatogrammes en raison de bases voisines 37, comme le séquençage est réalisé sur le même site à travers tous les virus dans l&#39;étude. Les produits de PCR obtenus pour la RT-PCR quantitative et séquençage de Sanger peut également être utilisé avec d&#39;autres méthodes pour déterminer le rapport viral tel que le séquençage des clones individuels en vrac de 12,13, 4,7,17,19 HTA, ou le dosage de ligation d&#39;oligonucléotides (OLA) 38 .

La réplication virale remise en forme est définie comme la capacité d&#39;un virus à produire une descendance infectieuse dans un environnement donné 1 et est un facteur important dans la détermination de la prévalence d&#39;une variante du virus au niveau de la population au fil du temps 2. Comme les études in vivo de remise en forme ne sont pas réalisables avec des virus pathogènes humains, telles que le VIH-1, divers in vitro et ex vivo tests de conditionnement physique de réplication ont été développés pour étudier les effets sur la condition physique découlant de la résistance aux médicaments et des mutations d&#39;échappement immunitaire, épistasie et de l&#39;évolution des populations virales 3-6. Parmi les différents tests de conditionnement physique, des essais de compétition de croissance sont reconnus pour obtenir des mesures plus sensibles et valides de différences de forme physique, comme deux ou plusieurs variantes virales en compétition pour la même population cellulaire exactement dans les mêmes conditions environnementales, comme cela se produit in vivo 1,7,8. Avant de commencer des expériences de compétition de croissance, plusieurs variables besoin d&#39;être déterminée, y compris l&#39;utilisation de différentes multiplicités d&#39;infection (MOI), le ratio d&#39;entrée virale, et le calendrier de l&#39;échantillonnage pour analyse. Nous avons étudié les effets de ces paramètres sur la cinétique de croissance virales et sur ​​les résultats des expériences de compétition, et nous avons identifié des facteurs clés nécessaires pour les mesures robustes de VIH-1 de remise en forme dans la culture de cellules 9. En plus des variables d&#39;analyse, il existe une variété de méthodes pour la quantification de variants viraux dans des expériences de compétition de croissance. Bulk 10,11 ou 12,13 clonale séquençage a été utilisé pour déterminer le rapport des virus concurrentes sur la base des fréquences de nucleotides au niveau du site (s) d&#39;intérêt. Remise en forme relative est dérivé de variations de ce ratio au fil du temps. Cette méthode est pratique que des services de séquençage d&#39;ADN sont largement disponibles. Le séquençage spécifique d&#39;allèle parallèle méthode (PASS) permet le séquençage à des sites multiples et la détection de recombinants 14 </sup&gt;, Mais elle exige également des réactifs développés spécifiquement et des systèmes de détection. Essentiellement, ces méthodes ont été développées pour étudier les souches virales avec un petit nombre de différences de nucleotides dans une région d&#39;intérêt. D&#39;autres méthodes utilisent une petite gène rapporteur 15 ou synonymes mutations 4,16-18 que des étiquettes pour distinguer les virus concurrents par séquençage, tests de suivi hétéroduplex (ETS) 4,7,17,19 ou inverser PCR quantitative transcription quantitative (RT-qPCR) 15,16,18,20, qui peuvent tous être rendue applicable à étudier souches concurrence indépendamment de similarité de séquence. Une étape supplémentaire est nécessaire pour introduire les mots-clés dans les génomes viraux et le dosage par RT-PCR quantitative nécessite également des réactifs et des instruments spécifiques. Nous avons constaté que vrac séquençage Sanger donne des résultats comparables 9. Suite à la concurrence de la croissance, la réplication virale remise en forme est présentée comme remise en forme relative, ou un rapport de remise en forme entre two variants viraux. L&#39;aptitude relative d&#39;un virus peut être défini comme la proportion finale d&#39;une variante virale normalisée par sa proportion dans l&#39;inoculum initial ou à la différence nette du taux de croissance entre les deux virus concurrentes. Nous avons constaté que cette dernière méthode, en utilisant les points de données longitudinales que dans la phase exponentielle de croissance, a donné les résultats les plus robustes 9,20. Les essais in vitro de remise en forme sont utilisés principalement pour étudier clones biologiques 6-8 et clones moléculaires infectieux du VIH-1. Ce dernier, se prêter à la manipulation génétique, sont souvent employés pour étudier l&#39;effet sur ​​l&#39;aptitude de certaines mutations ou des séquences spécifiques d&#39;intérêt 3-5,21,22. Les protocoles suivants décrivent un flux de travail du point de construire de nouvelles pleine longueur infectieuses VIH-1 clones moléculaires du VIH-1 en utilisant des vecteurs contenant un marqueur de séquence, l&#39;introduction de mutations d&#39;intérêt, faisant stocks viraux et d&#39;établir la cinétique de croissance virales, De réaliser le dosage de la concurrence de la croissance et de calcul physique relative (Figure 1). Grâce à nos procédures optimisées, nous avons créé trois mutants recombinants du VIH-1 et déterminé leur aptitude de réplication. Le clone moléculaire recombinant a été construit en remplaçant la région des gènes du VIH-1 gag-p24 de pNL4-3, un plasmide contenant une longueur génome complet infectieuse du VIH-1 souche de laboratoire NL4-3, avec un COTB synthétique (Centre-of Arbre, sous-type B) séquence gag-p24 23 pour créer la souche prototype. Acides changements simples (T186M, T242N et I256V) ont ensuite été introduits pour créer trois clones mutants. Chaque mutant a été disputé contre le virus prototype d&#39;observer l&#39;impact de fitness de chaque mutation dans le fond génétique donné. Les trois mutants ont démontré des niveaux de réplication fsitness variant de légère à significativement plus faible que le virus prototype. La mutation a été précédemment rapporté T242N d&#39;avoir un Fitne modéréess coûte 24 à 26, similaire au résultat montré dans cette étude. Le coût de la remise en forme des deux autres mutations avait pas été signalé précédemment.

<table><tbody><tr><td>Construction de clones</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>recombinants Amorce chimérique/Amorces mutagènes/séquençage IDT</td><td></td><td></td><td>Oligos d’ADN personnalisés</td></tr><tr>Plasmide <td></td><td></td><td>pNL4-3VifA et pNL4-3VifB</td><td>Veuillez contacter Dr. James I Mullins (jmullins@uw.edu)</td></tr><tr><td>ADN polymérase haute fidélité</td><td>Thermo Scientific</td><td>F-549S</td><td></td></tr><tr><td>Tampon</td> <td>haute fidélitéThermo Scientific</td><td>F-549S</td><td></td></tr><tr><td>dNTP</td><td>Bioline</td><td>Bio-39026</td><td></td></tr><tr><td>Thermocycleur</td><td>Life Technologies</td><td></td><td>Applied Biosystems&reg ; GeneAmp&reg ; PCR System 9700</td></tr><tr><td>Colorant de chargement d’ADN</td><td>Thermo Scientific</td><td>R0631</td><td></td></tr><tr><td>1 kb Plus Échelle d’ADN</td><td>Invitrogen</td><td>10787-018</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick PCR Purification Kit</td><td>Qiagen</td><td>28104</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick gel extraction kit</td><td>Qiagen</td><td>28704</td><td></td></tr><tr><td>DpnI</td><td>enzyme New England Biolabs</td><td>R0176S</td><td></td></tr><tr><td>TOP10 chimiquement compétent Escherichia coli</td><td>Invitrogen</td><td>C4040-10</td><td></td></tr><tr><td>Luria Broth poudre de base</td><td>Invitrogen</td><td>12795-084</td><td></td></tr><tr><td>Carbenicillin</td><td>Research Products International</td><td>C46000-25.0</td><td></td></tr><tr><td>QIAprep Spin Miniprep kit&nbsp ;</td><td>Qiagen</td><td>27104</td><td></td></tr><tr><td>EndoFree Plasmid Maxi Kit</td><td>Qiagen</td><td>12362</td><td></td></tr><tr><td>Réactif de transfection</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>d’ADN X-tremeGENE 9</td><td>Roche</td><td>6365787001</td><td></td></tr><tr><td>HEK 293T-17</td><td>ATCC</td><td>CRL-11268</td><td>http://www.atcc.org/</td></tr> <tr><td>0.22 &#956 ; tube supérieur du filtre m</td><td>VWR International</td><td>89220-716&nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>Culture</td><td></td><td></td><td></td>cellulaire</tr><tr><td>Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM)</td><td>Life Technologies</td><td>10566016</td><td></td></tr><tr><td>Iscove&prime ; s Dulbecco modifié&prime ; s Medium (IMDM)</td><td>Life Technologies</td><td>31980-030</td><td></td></tr><tr><td>RPMI-1640 media</td><td>Life Technologies</td><td>61870-036</td><td></td></tr><tr><td>Phytohémagglutinine (PHA)</td><td>Thermo Scientific</td><td>R30852801</td><td></td></tr><tr><td>Human Interleukin-2</td><td>Roche</td><td>11147528001</td><td></td></tr><tr><td>Sérum fœtal bovin</td><td>JR Scientific</td><td>43640</td><td></td></tr><tr><td>Pénicilline et streptomycine</td><td>Corning Cellgro</td><td>30-001-CI</td><td></td></tr><tr><td>Plaque à 6 puits</td><td>VWR Scientific</td><td>73520-906</td><td></td></tr><tr><td>Plaque à 48 puits</td><td>VWR Scientific</td><td>62407-338</td><td></td></tr><tr><td>Plaque à fond plat à 96 puits</td><td>ISC Bioexpress</td><td>T-3015-4</td><td></td></tr><tr><td>Plaque à fond rond à 96 puits</td><td>BD Falcon 353077</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1,5 ml Tube de microcentrifugation</td><td>Mt. Baker Bio</td><td>MBD-1500</td><td></td></tr><tr><td>Tubes de 1,5 ml avec joint torique</td><td>VWR Scientific</td><td>89004-290</td><td></td></tr><tr><td>Tube conique de 50 ml</td><td>ISC Bioexpress</td><td>C-3317-6</td><td></td></tr><tr><td>ELISA</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Triton-X 100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X100</td><td></td></tr><tr><td>Tampon de phosphate salin (PBS)</td><td>Invitrogen</td><td>14190-250</td><td></td></tr><tr><td>Sérum de veau fœtal (FBS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F0392</td><td></td></tr><tr><td>glycérol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5516</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1379</td><td></td></tr><tr><td>Albumine sérique bovine (BSA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2153</td><td></td></tr><tr><td>Lapin anti-VIH-1 SF2 p24 antisérum</td><td>NIH AIDS Reagent Program</td><td>4250</td><td></td></tr><tr><td>Chèvre anti-lapin HRP</td><td>KPL</td><td>474-1516</td><td></td></tr><tr><td>Substrat de peroxydase TMB Microwell</td><td>KPL</td><td>52-00-01</td><td></td></tr><tr><td>H2SO4</td><td>Fisher Scientific</td><td>A300-500</td><td>Provoque de graves brûlures par toutes les voies d’exposition. Utilisez un équipement de protection individuelle. Utiliser uniquement sous une hotte chimique. Rincer immédiatement et abondamment à l’eau pendant au moins 15 min.</td></tr><tr><td>HIV p24 standard</td><td>AIDS and Cancer Virus program (NCI-Frederick)</td><td></td><td>Pour plus de détails sur la commande, veuillez contacter Julian Bess, Jr. (bessjw@mail.nih.gov) ; http://ncifrederick.cancer.gov/Programs/Science/Acvp/bio/Bess.aspx</td></tr><tr><td>Lecteur de microplaques</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td>VMax Kinetic ELISA Lecteur de microplaques</td></tr><tr><td>Isolement de l’ARN Synthèse de l’ADNc</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>QIAxtractor</td><td>Qiagen</td><td></td><td>http://www.qiagen.com/products/catalog/automated-solutions/sample-prep/qiaxtractor</td></tr><tr><td>QIAamp Mini Kit d’ARN viral</td><td>Qiagen</td><td>52906</td><td></td></tr><tr><td>dNTP</td><td>Bioline</td><td>Bio-39026</td><td></td></tr><tr><td>SuperscriptIII</td><td>Invitrogen</td><td>18080-085</td><td></td></tr><tr><td>Tampon premier brin&nbsp ;</td><td>Invitrogen</td><td>18080-085</td><td></td></tr><tr><td>Dithiothréitol (DTT)</td><td>Invitrogen</td><td>18080-085</td><td></td></tr><tr><td>Inhibiteur de la rnase</td><td>Roche</td><td>3335402001</td><td></td></tr><tr><td>RnaseH</td><td>Invitrogen</td><td>18021-071</td><td></td></tr><tr><td>qPCR</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Machine de qPCR en temps réel Life</td><td>Technologies</td><td></td><td>Applied Biosystems 7300 PCR en temps réel&nbsp ;</td></tr><tr><td>TaqMan&reg ; Expression génique Master Mix</td><td>Life Technologies</td><td>4369016</td><td></td></tr><tr><td>Amorce avant, inverse</td><td>IDT</td><td></td><td>Commande personnalisée</td></tr><tr><td>Sonde</td><td>Life Technologies</td><td></td><td>Commande personnalisée</td></tr><tr><td>Plaque de réaction optique 96 puits</td><td>Life Technologies</td><td>I19N3Q216</td><td></td></tr><tr><td>PCR+séquençage</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Taq ADN polymérase (Biolase)</td><td>Bioline</td><td>Bio-21043</td><td></td></tr><tr><td>Tampon NH4&nbsp ;</td><td>Bioline</td><td>Bio-21043</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Bioline</td><td>Bio-21043</td><td></td></tr><tr><td>Amorce de séquençage</td><td>IDT</td><td></td><td>Commande personnalisée</td></tr><tr><td>QIAxcel</td><td>Qiagen</td><td></td><td>http://www.qiagen.com/products/catalog/automated-solutions/detection-and-analysis/qiaxcel-advanced-system</td></tr><tr><td>Fournisseur de services de séquençage de l’ADN</td><td>http://www.htseq.org/</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Outil web GRC</td><td>http://indra.mullins.microbiol.washington.edu/grc/</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Outil web ChromatQuan</td><td>http://indra.mullins.microbiol.washington.edu/cgi-bin/chromatquant.cgi</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

pairwise croissance de la concurrence analyse pour déterminer la condition physique réplication du virus de l&#39;immunodéficience humaines

Pairwise Growth Competition Assay for Determining the Replication Fitness of Human Immunodeficiency Viruses

Les tests de fitness in vitro sont des outils essentiels pour déterminer l’aptitude à la réplication virale pour des virus tels que le VIH-1. Diverses mesures ont été utilisées pour extrapoler la valeur adaptative de la réplication virale, allant du nombre de particules virales par unité infectieuse, du taux de croissance en culture cellulaire et de la valeur adaptative relative dérivée des essais de compétition de croissance à cycles multiples. Les essais de compétition de croissance fournissent une mesure particulièrement sensible de la valeur adaptative, car les virus sont en compétition pour des cibles cellulaires dans des conditions de croissance identiques. Plusieurs facteurs expérimentaux doivent être pris en compte lors de la réalisation d’essais de compétition de croissance, notamment la multiplicité de l’infection (MOI), les temps d’échantillonnage et les méthodes de détection virale et de calcul de la valeur adaptative. Chaque facteur peut affecter le résultat final et doit donc être soigneusement pris en compte lors de la conception expérimentale. Le protocole présenté ici comprend des étapes allant de la construction d’un nouveau clone recombinant du VIH-1 à la réalisation d’essais de compétition de croissance et à l’analyse des résultats expérimentaux. Ce protocole utilise des valeurs de paramètres expérimentaux précédemment démontrées pour produire des résultats cohérents et robustes. Des alternatives sont discutées, car certains paramètres doivent être ajustés en fonction du type de cellule et des virus étudiés. Le protocole contient deux méthodes alternatives de détection virale pour offrir une certaine souplesse, car la disponibilité des instruments, des réactifs et de l’expertise varie d’un laboratoire à l’autre.

Pour étudier l&#39;impact de remise en forme des changements d&#39;acides aminés uniques dans le VIH-1 Gag p24, nous avons utilisé oligonucléotide mutagenèse dirigée pour introduire des mutations dans un plasmide contenant pNL4-3 du VIH-1 COTB-p24 gène 23,32,33. Les stocks viraux ont été générés par transfection de cellules 293T et récoltées après 48 heures. Nous avons estimé la dose de 50% de la culture de tissus infectieux (DICT 50) de chaque stock virale par la méthode de Reed-Muench 31. La TCID50 du virus mutants prototype et variaient entre 10 avril à 10 mai UI / ml (Figure 3A). La cinétique de virus recombinants de croissance ont été établis dans les CMSP à partir d&#39;un seul donneur à une MOI de 0,005. RT-qPCR a été utilisé pour mesurer virale nombre de copies d&#39;ADNc par jour pendant six jours. Tous les virus mutants et prototypes ont augmenté de façon exponentielle entre le jour 2 et le jour 4, après quoi a ralenti la croissance virale, comme indiqué par une diminution de la pente de l&#39;augmentation du nombre de copies virales d&#39;ARN (&lt;strong&gt; figure 3B). La diminution du nombre de copies d&#39;ADNc entre le jour 0 (correspondant à l&#39;inoculum) et jour 2 est due à l&#39;absorption du virus à des cellules et l&#39;élimination des virions non liés par lavage le jour 1 (étape 5.1.6). Dans la phase de croissance exponentielle, les trois mutants ont un taux de croissance plus lent (g) que le virus prototype (figure 3C). Tous les trois mutants ont été en compétition contre le virus prototype dans des tests de compétition de croissance à un total de 0,005 MOI. La cinétique de la croissance virale dans des cultures doublement infectées étaient similaires à celle de la mono-infection; la phase exponentielle de croissance virale était entre les jours 2 et 4, et de la croissance virale a atteint un plateau autour de cinq jours (figure 4A). Les différences de taux de croissance virales ont été obtenues à partir de la variation du rapport viral dans le temps. Le rapport viral a été calculé sur la base du nombre de copies d&#39;ADNc de la référence et les virus mutants à l&#39;aide de RT-qPCR, et en comparant les hauteurs de picchromatogrammes en séquence au niveau de sites de nucleotides qui distinguent les deux virus (figure 4B). Les différences de taux de croissance déterminées en utilisant le pic-hauteur et copie de l&#39;ARN viraux méthodes numériques ont donné des résultats similaires (figure 4C). Tous les trois mutants avaient inférieure remise en forme de réplication que les virus des prototypes avec le I256V mutant ayant l&#39;aptitude la plus faible (figure 4C). <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/52610/52610fig1.jpg" /> Figure 1: Schéma de principe des protocoles présentés dans le présent document Le Virus protocoles de préparation concernent la construction du VIH-1 clones recombinants et la génération de stocks viraux.. Les protocoles de remise en forme dosages sont pour établir la cinétique de croissance virales et déterminer l&#39;aptitude virale relative. Les lignes pointillées représentent les flux alternatifs pour les protocoles. Par exemple, une mutation peut être introduite directement dans le VIH-1 NL4-3clone moléculaire sans générer un clone recombinant. <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/52610/52610fig2.jpg" /> Figure 2:. Construction du VIH-1 NL4-3 COTB Gag p24-clones moléculaires recombinantes en utilisant l&#39;extension de PCR de chevauchement (A) Concevoir les amorces chimériques. La 5 &#39;moitiés des amorces contiennent la séquence du vecteur NL4-3 et 3&#39; contiennent des moitiés des extrémités de la séquence de l&#39;insert. (B) amorces chimériques sont utilisés pour amplifier le fragment d&#39;insertion, COTB Gag p24. (C) Les fragments d&#39;insertion sont utilisés comme amorces pour une seconde PCR pour générer un nouveau plasmide recombinant. <img alt="Figure 3" src="/files/ftp_upload/52610/52610fig3.jpg" /> Figure 3:. Caractéristiques de croissance virale dans les CMSP (A) Connexion 10 DICT 50 </sub&gt; des stocks viraux. (B) de la cinétique de la croissance virale dans monoinfections commencé à un MOI = 0,005. (c) Les taux de croissance virale de plus de six jours, y compris la phase exponentielle de croissance (jours 2-4) dérivé de panneau (B). Les valeurs indiquées représentent la moyenne de trois répétitions d&#39;une expérience. Les barres d&#39;erreur représentent les intervalles de 95% de confiance. <img alt="Figure 4" src="/files/ftp_upload/52610/52610fig4.jpg" /> Figure 4: croissance virale et de conditionnement physique par rapport déterminations (A) de la croissance virale dans les cultures de CMSP doublement infectés.. (B) Les ratios de virus T242N et prototypes déterminés par RT-qPCR ou la méthode de séquençage de pointe hauteur. (C) des différences nettes virales du taux de croissance (d) entre le mutant et les virus dans des cultures de prototypes doublement infectées, comme représenté en (A). d valeurs ont été calculées fROM Le viraux données de rapport indiqués dans (B). Les valeurs indiquées représentent la moyenne de trois répétitions d&#39;une expérience. Les barres d&#39;erreur représentent les intervalles de 95% de confiance.

La compétition de croissance entre virus quasi isogéniques fournit une mesure sensible pour déterminer la valeur relative de réplication. Les protocoles décrits ici comprennent la construction de clones recombinants du VIH-1, la propagation et la compétition de croissance du virus et des méthodes d’analyse optimisées pour produire des résultats sensibles et cohérents.

Pairwise croissance de la concurrence analyse pour déterminer la condition physique réplication du virus de l&#39;immunodéficience humaines

In vitro fitness assays are essential tools for determining viral replication fitness for viruses such as HIV-1. Various measurements have been used to ...

L'objectif général de cette procédure est de déterminer la capacité relative de réplication des souches de VIH-1 d'intérêt. Cela est réalisé en premier lieu en construisant des clones moléculaires viraux ou des plasmides d'ADN contenant des séquences complètes du VIH-1 d'intérêt. La deuxième étape consiste à produire des stocks viraux pour chaque clone moléculaire par transfection d'ADN.Ensuite, la cinétique de croissance et la phase de croissance exponentielle de chaque souche de VIH-1 sont établies par des prélèvements longitudinaux de cultures cellulaires mono-infectées. La dernière étape consiste à réaliser des compétitions de croissance par paires ou des infections doubles dans des cultures cellulaires. Enfin, la transcription inverse, la PCR quantitative en temps réel et les hauteurs de pics des chromatogrammes de séquençage ADN obtenus par séquençage d'ADN de type Sanger sont utilisées pour déterminer les rapports viraux, lesquels sont ensuite utilisés pour calculer la capacité de réplication virale relative.L'avantage principal de cette technique par rapport aux méthodes existantes, telles que l'infection para-mono ou l'infection double à deux points temporels, est qu'elle permet d'obtenir des mesures plus sensibles et plus robustes de la différence de capacité de réplication entre deux souches virales. Les protocoles présentés dans cet article comprennent la construction de clones recombinants du VIH-1, l'introduction de mutations d'intérêt par mutagenèse dirigée, la préparation de stocks viraux et la réalisation de tests d'aptitude pour établir la cinétique de croissance virale et déterminer l'aptitude virale relative. Cette vidéo démontrera l'essai de compétition de croissance et deux méthodes différentes.Pour déterminer le rapport viral permettant de calculer la capacité d'adaptation, veuillez vous référer au texte du protocole pour toutes les autres procédures. Pour préparer le test de compétition de croissance, ensemencez trois fois dix puissance cinq cellules mononucléées du sang périphérique stimulées par la PHA, ou PBMC, dans un volume total de 500 microlitres par puits dans une plaque de 48 puits à fond plat. Conservez la plaque à 37 degrés Celsius dans une atmosphère à 5 % de dioxyde de carbone jusqu'à l'inoculation. Ensuite, préparez trois millilitres d'inoculum contenant 6 000 UI pour chaque virus.Dans une expérience typique, plusieurs mutants sont testés, mais aux fins de cette démonstration, un seul mutant sera testé contre le virus prototype. La préparation adéquate de l'inoculum viral est une étape cruciale de cette procédure, car une dilution en série peut être nécessaire avec un stock viral possédant un titre infectieux très élevé. Transférez 1,5 millilitre de chaque inoculum viral dans un tube stérile pour créer l'inoculum d'infection double.Ajoutez 500 microlitres de l'inoculum double aux PBMC stimulés par la PHA dans chaque puits de la plaque 48 puits. Le volume final de culture est d'un millilitre par puits. Répartissez 200 microlitres par puits de l'inoculum double dans deux plaques 96 puits pour l'isolement d'ARN. Conservez une plaque comme sauvegarde. Incubez les cellules inoculées à 37 degrés Celsius dans une atmosphère contenant 5 % de dioxyde de carbone pendant 16 à 24 heures. De 16 à 24 heures après l'inoculation, lavez les cultures, retirez et jetez 750 microlitres du surnageant de culture, puis ajoutez 750 microlitres de milieu complet Iscove modifié de Dulbecco ou cIMDM frais.Enveloppez la plaque dans du film plastique et faites-la centrifuger pendant 10 minutes. À 300 g, retirez et jetez 750 microlitres du surnageant. Ajoutez 750 microlitres de cIMDM frais. Incubez les plaques à 37 degrés Celsius dans une atmosphère contenant 5 % de dioxyde de carbone. Les moments d’échantillonnage doivent être choisis de manière à inclure au moins trois points temporels durant la phase de croissance exponentielle virale.Pour prélever un échantillon, transférez 500 microliters de surnageant de culture dans un tube de centrifugation de 1,8 millilitre et centrifugez pendant une minute à 3000 g. Transférez 200 microliters du surnageant exempt de cellules vers deux plaques d'échantillons de 96 puits destinées à l'isolement de l'ARN. Conservez à nouveau une plaque en tant que sauvegarde. Stockez les surnageants à −80 degrés Celsius jusqu'à l'isolement de l'ARN.Ajoutez 500 microlitres de cIMDM frais à chaque culture et replacez la plaque dans l'incubateur jusqu'au prochain prélèvement. Ensuite, l'ARN est isolé à partir des échantillons, suivi de la synthèse de l'ADNc. Deux méthodes pour déterminer les rapports viraux seront présentées.La première méthode utilise la transcription inverse, la PCR quantitative en temps réel ou RT qPCR, et la seconde utilise les hauteurs des pics du chromatogramme. Pour la qPCR, préparez une série de dilutions standard par dilution sérielle en triple exemplaire du plasmide pNL4-3VifA, en diluant d’un facteur dix à chaque étape, allant de trois fois 10 à la puissance six copies par microlitre à 30 copies par microlitre. Préparez une plaque de réaction qPCR en 96 puits.Chaque plaque doit contenir au moins un témoin négatif, la série de dilutions standards en triplicata et les duplicatas de chaque échantillon d'ADNc. Utilisez un couple amorces-sonde vFIA pour détecter les signaux dans les témoins négatifs, la série de dilutions standards et avec un duplicata de l'échantillon d'ADNc. Utilisez le couple amorces-sonde vIFB avec l'autre duplicata de l'échantillon d'ADNc. Pour chaque réaction de qPCR, utilisez 12,5 microlitres du mélange maître de qPCR, 0,2 micromolaire de la sonde de qPCR, 0,8 micromolaire de chacun des amorces directs et inverses, et un microlitre d'ADNc. Pour la série de dilutions standards, ajoutez la dilution en série de pNL4-3VifA au lieu d'ADNc. Pour les témoins négatifs, utilisez de l'eau ou un tampon à la place de l'ADNc. Réglez les paramètres de cyclage PCR conformément aux instructions du fabricant pour l'utilisation de l'appareil de qPCR. Calculez la courbe standard à l'aide des données d'amplification provenant de la série de dilutions standards.Comparer les données d'amplification des échantillons d'ADNc à la courbe standard pour déterminer le nombre de copies. Utiliser le calcul du taux de croissance viral ou l'outil web GRC pour calculer l'aptitude virale relative. Saisir le nombre de copies d'ADNc obtenu à l'étape de RT qPCR dans le format spécifié indiqué. Le fait de cliquer sur « Calculer » affichera la différence de taux de croissance net entre deux virus en compétition. Pour déterminer les rapports viraux à l'aide des hauteurs des pics du chromatogramme, amplifier par PCR des fragments VIF du VIH-1 contenant la balise de séquence VIFAB en utilisant des amorces VIF sens et VIF antisens. Pour chaque réaction de PCR, utiliser un microlitre d'ADNc, du tampon NH4 1X, 1,5 millimolaire de MgCl2, 0,2 millimolaire de dNTPs, 2,5 U de polymérase Taq et 0,45 micromolaire de chaque amorce.Ajouter de l'eau jusqu'à un volume final de 50 microlitres. Régler les paramètres de cyclage PCR sur trois cycles à 94 degrés Celsius pendant une minute, 55 degrés Celsius pendant une minute et 70 degrés Celsius pendant une minute, suivis de 34 cycles à 94 degrés Celsius pendant 15 secondes, 58 degrés Celsius pendant 30 secondes et 70 degrés Celsius pendant une minute. Enfin, une étape de maintien à quatre degrés Celsius. Purifier ensuite les produits PCR à l'aide d'un kit disponible commercialement et soumettre les produits PCR purifiés à un prestataire de séquençage d'ADN pour un séquençage de Sanger.Vérifiez le score de qualité moyen des lectures fourni par le service de séquençage. Si la précision moyenne des appels de bases est inférieure à 85 %, répétez l'amplification PCR, la purification des produits PCR et le séquençage de Sanger. Utilisez l'outil web quantitatif Chromat pour calculer le ratio viral à chaque point temporel.Les entrées requises sont la séquence leader et le fichier chromatogramme de séquence au format .ab1. L'outil mesure l'intensité du pic au site spécifié.Le rapport des intensités des pics correspond au rapport des deux virus. Utilisez l'outil web GRC pour calculer l'aptitude virale relative. L'entrée est la hauteur des pics du chromatogramme de séquence obtenue à l'aide de l'outil web Chromat quantitative, au format spécifié indiqué. L'outil web GRC calculera la différence de taux de croissance net entre les deux souches virales en compétition. Un virus prototype et trois virus mutants du VIH ont été construits, et leur croissance dans les PBMC a été caractérisée. La DII 50 variait de 10 à la puissance quatre à 10 à la puissance cinq UI par millilitre. Tous les virus ont présenté une croissance exponentielle entre le jour deux et le jour quatre.Pendant la phase de croissance exponentielle, les trois mutants présentaient un taux de croissance plus lent que celui du virus prototype. Chaque mutant a été mis en compétition avec le virus prototype lors de tests de compétition de croissance à une MOI totale de 0,005 ; la cinétique de croissance virale dans les cultures doublement infectées était similaire à celle observée lors d'une infection simple. La phase de croissance exponentielle virale s'est déroulée entre les jours deux et quatre, et la croissance virale a atteint un plateau vers le jour cinq.Les différences de taux de croissance virale ont été déduites de la variation du rapport viral au fil du temps. Le rapport viral a été calculé à partir du nombre de copies d'ADNc des virus de référence et mutants, en utilisant la RT-qPCR, ainsi qu'en comparant les hauteurs de pics dans les chromatogrammes de séquence aux sites nucléotidiques permettant de distinguer les deux virus ; le mutant T242-N est comparé au prototype. Dans cet exemple, les différences de taux de croissance déterminées à l’aide des deux méthodes ont donné des résultats similaires.Les trois mutants présentaient une aptitude reproductive inférieure à celle du virus prototype, le mutant I256-V ayant l'aptitude la plus faible. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment réaliser des essais de compétition de croissance par paires afin de déterminer l'aptitude reproductive relative du VIH-1.

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Immunologie et infection

La région de couronne de différentes séquences de la boucle V3 de la glycoprotéine d'enveloppe de surface (gp120) du VIH-1 peut être structurellement caractérisé dans de nombreux cas dans le repliement in silico des positions 10 à 22 de la boucle à l'aide d'un...

Évaluation des immunologiquement pertinents dynamiques tertiaires Caractéristiques structurelles de l&#39;épidémie de VIH-1 séquence de la boucle V3 de la Couronne par R2<em&gt; Ab initio</em&gt; Pliante

Nous décrivons un protocole pour identifier les rôles clés des molécules de l'hôte de signalisation dans la réplication lytique d'un virus de l'herpès modèle, gamma herpèsvirus 68 (γHV68). L'utilisation de lignées de souris génétiquement modifiées et des fibroblastes embryonnaires de γHV68 réplication lytique, le protocole permet à la fois la caractérisation phénotypique et moléculaire de l'interrogatoire interactions virus-hôte dans la réplication virale lytique.

Dissection hôte-virus interaction dans la réplication lytique d&#39;un virus de l&#39;herpès modèle

Source: Manocheewa, S., et al. Pairwise Growth Competition Assay for Determining the Replication Fitness of Human Immunodeficiency Viruses. J. Vis. Exp. (2015)The video demonstrates the procedure for a growth competition assay to measure the relative replication fitness of two viral strains by comparing their replication in human immune cells.

An Assay for Measuring the Relative Replication Fitness of Viral Strains

Nous décrivons ici la cytotoxicité cellulaire et simples essais d'infectivité rondes qui permettent la sélection rapide et précise des composés de déterminer leur cytotoxicité cellulaire (CC 50) et les valeurs IC50 contre WT et VIH-1 résistant médicament.

Dépistage rapide du VIH de la transcriptase inverse et inhibiteurs de l&#39;intégrase

La pathogenèse du VIH-1 est définie à la fois par les caractéristiques virales et les facteurs génétiques de l’hôte. Nous décrivons ici une méthode robuste qui permet d’effectuer des mesures reproductibles pour évaluer l’impact de la variation de la séquence du gène gag sur la capacité de réplication in vitro du virus.

Une enzyme de restriction basée sur le clonage méthode pour évaluer la<em&gt; In vitro</em&gt; Capacité de réplication du VIH-1 sous-type C Gag-MJ4 chimériques virus

Des méthodes d’évaluation de l’efficacité et de la toxicité des molécules d’ARN ciblant les étapes post-intégration du cycle de réplication du VIH-1 sont décrites. Ces méthodes sont utiles pour cribler de nouvelles molécules et optimiser le format des molécules existantes.

Évaluation de l&#39;efficacité et la toxicité des ARNs Ciblage VIH-1 Production pour utilisation en thérapie génique ou des médicaments

Infection des tissus humains avec le virus de l’immunodéficience humaine (VIH) ex vivo fournit un précieux modèle 3D de la pathogenèse du virus. Nous décrivons ici un protocole pour traiter et infecter des échantillons de tissus d’amygdales humaines et des muqueuses génitales femelles avec le VIH-1 et les maintenir en culture à l’interface air-liquide.

Ex Vivo Infection de la muqueuse génitale humain tissu lymphoïde et femelle avec le Virus de l’immunodéficience humaine 1 et Histoculture

Nous décrivons un essai pour signaler sur la fusion VIH-1 par l’expression de la protéine fluorescente verte détectable par microscopie à écoulement cytometry ou fluorescence cellulaire. Il peut être utilisé pour tester les inhibiteurs d’entrée virale (plus précisément à l’étape de fusion) dans les systèmes de l’infection sans cellule et cellule-cellule.

Un haut débit Cre-Lox activé Membrane virale Fusion test afin d’identifier les inhibiteurs de la Fusion membranaire virale du VIH-1

Ce protocole fournit une méthode pour établir des souris humanisées (hu-NSG) via intrahépatique injection de cellules souches hématopoïétiques humaines à des souris NSG néonatales conditionné par rayonnement. La souris de l’hu-NSG est sensible à l’infection par le VIH et combinatoire antirétrovirales (cART) et sert de modèle physiopathologique adapté pour les enquêtes de réplication et latence du VIH.

(Hu-NSG) souris humanisée NOD/SCID/IL2rγnull modèle d’études de latence et de réplication du VIH

Nous décrivons ici certaines méthodes établies pour déterminer le stress du réticulum endoplasmique (RE) et l’activation de la réponse protéique dépliée (UPR), en mettant l’accent sur l’infection par le VIH-1. Cet article décrit également un ensemble de protocoles pour étudier l’effet du stress du RE/UPR sur la réplication du VIH-1 et l’infectiosité du virion.

Mesure du stress du réticulum endoplasmique et de la réponse protéique dépliée dans les lymphocytes T infectés par le VIH-1 et analyse de son rôle dans la réplication du VIH-1

Découvrez les essais de compétition de croissance par paires pour mesurer la fitness de réplication du VIH-1. Cette méthode utilise la PCR quantitative et le séquençage Sanger pour analyser les cinétiques virales.

Pairwise croissance de la concurrence analyse pour déterminer la condition physique réplication du virus de limmunodéficience humaines (Vidéo) | JoVE Journal

Pairwise croissance de la concurrence analyse pour déterminer la condition physique réplication du virus de l'immunodéficience humaines

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