3D organotypiques Co-culture Modèle Soutenir médullaire thymique des cellules épithéliales prolifération, la différenciation et Promiscuous Gene Expression

L’objectif global de cette procédure est de cultiver des cellules thymiques, médullaires, épithéliales ou mtech dans une culture organotypique tridimensionnelle ou un système OTC. Ceci est accompli en plaçant d’abord le matériau d’échafaudage fibreux dans un insert filtrant à 12 puits, suivi de la superposition d’un gel de fibrine fraîchement préparé contenant des fibroblastes de peau humaine. Après quatre à cinq jours de pré-culture, les MTS sont assis sur l’échafaudage et cultivés dans des conditions de culture submergées.

En fin de compte, l’immunohistochimie, l’isolement de l’ARN et les faits peuvent être effectués sur les co-cultures pour évaluer le développement du CED Mtech. Le principal avantage des systèmes de co-culture organotypique 3D par rapport aux systèmes de culture 2D existants est qu’ils sont de loin supérieurs dans la récapitulation de la différenciation mtech, de la prolifération et du maintien de l’expression génique de promiscuité. Aujourd’hui, Iris Martin, une technicienne de notre laboratoire collaboratif, fera la démonstration de cette technique.

Lorsque les fibroblastes dermiques humains atteignent la co-fluidité, préparez les fibres de l’échafaudage en faisant bouillir, sécher et repasser les morceaux de 0,4 à 0,6 millimètre d’épaisseur de matériau fibreux visco non tissé. Utilisez une perforatrice en métal pour les couper en cercles de 11 millimètres. Placez le matériau fibreux coupé entre deux lames, enveloppez les lames dans du papier d’aluminium et autoclavez-les.

Une fois stérilisé, placez les inserts dans les puits d’une plaque stérile à 12 puits, puis chaque échafaudage dans un insert correspondant. Mélangez ensuite, 2,7 fois 10 à la cinquième fibroblastes dans 100 microlitres de sérum de veau fœtal dans 100 microlitres de thrombine fraîchement diluée par échafaudage. Versez le mélange de fibroblastes de thrombine sur chacun des échafaudages, suivi de 200 microlitres de fibrinogène fraîchement dilué.

Mélangez ensuite le mélange cellulaire dans chaque puits, en répartissant la solution uniformément sur l’ensemble de l’échafaudage à l’aide d’un pipetage doux. L’image montre la croissance des fibroblastes dermiques humains avec le gel de fibrine au premier jour et au quatrième jour de la culture. Préparez un gel d’essai dans un puits de contrôle sans échafaudage pour suivre le temps et la formation des caillots à ce moment-là également.

Évaluez la formation du caillot à l’aide d’une pointe de pipette ou en inversant la plaque après les fibroblastes, faites coaguler immerger les cultures d’organes dans le milieu, complété par de l’acide la sorbique et du TGF bêta un pendant quatre à cinq jours le jour de l’ensemencement mtech, remplacez ce milieu par un milieu RFAD contenant 500 unités par millilitre de protéines pour prévenir la fibrinolyse précoce. Sept à huit heures plus tard, semez 2,5 fois 10 à la cinquième MT E suspendue dans 100 microlitres de RFAD sur le dessus de chaque échafaudage, et incubez les co-cultures pendant 24 heures. Le lendemain, remplacez le milieu par un milieu frais contenant 250 unités par millilitre d’une proin pour quatre à sept jours de culture supplémentaires.

Pour évaluer le développement des m Tex par immunohistochimie à la fin de la culture, utilisez une paire de pinces pour séparer l’équivalent dermique de l’échafaudage du filtre de chacun. Bien insérer et intégrer les OTC dans le composé OCT. Congeler les OTC en phase gazeuse sur de l’azote liquide pour isoler l’O-T-C-R-N-A.

Après avoir séparé le tissu de l’échafaudage des filtres, utilisez un scalpel pour couper les OTC en morceaux et transférez les morceaux dans un tube libre d’ARN de deux millilitres contenant un millilitre de solution dénaturante. À l’aide d’un instrument de préparation rapide, déchiquetez mécaniquement les OTC deux fois à une vitesse de 6,0 pendant 30 secondes à chaque fois, avec une période de repos de deux minutes sur la glace entre chaque déchiquetage. Isolez ensuite l’ARN en utilisant l’extraction acide au thiocyanate de thiocyanate de phényle chloroforme comme décrit par le fabricant.

Pour analyser les OTC par cytométrie en flux, retirez la membrane et séparez l’échafaudage du gel de fibroblaste de fibrine. Et enfin, coupez le gel avec un scalpel comme nous venons de le démontrer. Transférez le mouchoir dans un tube de télécopie.

En continuant deux millilitres de collagénase dis-pâte. Placez ensuite le tube à 37 degrés Celsius dans un bain-marie avec agitation magnétique pendant 20 minutes. Agitation, contournez votre pipette une fois toutes les cinq minutes lorsque le tissu est complètement digéré.

Filtrez la suspension cellulaire résultante à travers une passoire de 70 micromètres et colorez les cellules à l’aide des anticorps appropriés, comme illustré. Les MTS peuvent être identifiés par l’expression de leur kératine 14, ce qui les distingue facilement des fibroblastes menton positifs. Il est intéressant de noter que les M Tex immatures et matures présentent des modèles de culture différents mais hautement reproductibles.

Les CD 80 D à faible M Tex immatures, par exemple, forment généralement des bicouches en contact étroit avec les fibroblastes. Alors que les CD 80 D à haute MTS ont tendance à former des agrégats cellulaires compacts délimités par les fibroblastes, les sous-ensembles mtech ne se contentent pas de survivre, mais prolifèrent dans les conditions 3D OTC démontrées, comme en témoigne leur incorporation EDU. Il est intéressant de noter que les technologies CD 80 à faible MT prolifèrent à un rythme plus élevé en présence de rankl.

Bien que l’inverse soit vrai pour les technologies de TA élevées du CD 80, après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de cultiver la MT. Les techniciens utilisant des OTC 3D. Il s’agit d’une méthode bien supérieure à l’utilisation de systèmes de culture 2D en termes de différenciation technologique et de maintenance et d’induction des EGP, avec la possibilité d’étudier ou de manipuler plusieurs paramètres de prise.