Haut-débit quantitative en temps réel RT-PCR analyse pour déterminer les profils d'expression de types I et III sous-types d'interféron

L’objectif global de cette procédure est de préparer et d’exécuter 384 plaques de dosage pour l’analyse à haut débit d’un groupe de gènes hautement homologues, tels que les sous-types d’interféron de type un et trois. Pour ce faire, il faut d’abord préparer la dilution en série standard utilisée pour l’exécution des plaques de test. Ensuite, la sonde d’amorçage et les mélanges de matière opérationnelle sans contrôle de gabarit utilisés pour la fabrication des plaques sont préparés.

Ensuite, les plaques d’analyse à 384 puits sont préparées à l’aide d’un pipeteur multicanaux automatisé et elles sont séchées pour être stockées. Enfin, les plaques d’analyse de 384 puits sont analysées. En fin de compte, le test quantitatif RT PCR R en temps réel à haut débit est utilisé pour définir les signatures d’expression de l’interféron dans des modèles de culture tissulaire, l’étude d’agents pathogènes ou dans des échantillons cliniques dans le contexte de maladies infectieuses ou auto-inflammatoires.

Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes telles que la PCR quantitative R deux, utilisant des sondes linéaires standard ou cyberg green, est que les sondes fluorescentes à acide nucléique moléculaire et à bulle de verrouillage peuvent être utilisées pour discriminer les différences de paire de bases uniques entre des séquences très similaires Après décongélation, vortex et centrifugation brève d’un spermatozoïde standard et saumon ou S-S-D-N-A. Préparez le mélange d’eau SSD NA pour les 17 kits de dilution standard en mélangeant 51 microlitres de S-S-D-N-A avec 20,3 millilitres d’eau. Distribuez 190 microlitres du mélange d’eau d’ADN SS dans le premier tube d’une bandelette PCR de huit tubes et 180 microlitres dans les cinq tubes suivants.

Effectuez une dilution de un à 20 en transférant 10 microlitres du stock standard 50 Picomolar dans le tube avec 190 microlitres de S-S-D-N-A mélange d’eau vortex et centrifugez rapidement. La bandelette PCR effectue une dilution de un à 10 en transférant 20 microlitres du tube le plus récemment dilué au tube suivant dans le vortex de la série et centrifuge rapidement la bandelette PCR. Répétez la dilution de un à 10 jusqu’à ce que le dernier tube de la série ait reçu l’étalon.

Après avoir étiqueté jusqu’à 17 tubes de deux millilitres, utilisez une pipette électronique multicanaux de 12,5 microlitres pour ajouter deux microlitres de S-S-D-N-A à chaque tube à l’aide d’amorces et de sondes préparées selon le protocole de texte. Ajoutez l’amorce directe, l’amorce inversée et la sonde appropriées à chaque amorce. Ensemble de sondes pour préparer les mélanges de matériau de travail sans gabarit ou NTC.

Transférez 14,3 microlitres de chaque sonde d’amorçage réglée dans le tube de mélange NTC approprié conformément à ce tableau. Après le retrait d’un Eloqua des jeux de sondes d’amorçage nécessaires pour le matériau de travail NTC, les mélanges à 1,5 millilitre d’eau pour porter le volume final de chaque tube de matériau de travail du jeu de sonde d’amorce à 1,7 millilitre. Pour préparer une plaque source de 96 puits des ensembles de sondes d’amorce et des mélanges NTC.

Placez une nouvelle plaque à 96 puits dans un bloc de refroidissement réfrigéré à 96 puits et désignez les puits avec le bon jeu de sondes d’amorce ou le bon mélange NTC à l’aide d’une pipette électronique multicanaux de 250 microlitres. Ajoutez 66 microlitres d’eau à chaque ensemble de sondes d’amorce. Puits distribuez 82,5 microlitres d’eau aux quatre puits cibles 17.

Versez 27,5 microlitres d’eau dans chaque mélange anti-C. Ensuite, ajoutez 54 microlitres des sondes d’amorce correctes au stock de travail aux sondes d’amorce désignées à la distribution des puits. 67,5 microlitres de l’amorce cible 17 Stock de l’ensemble de travail de la sonde à l’objectif 17 désigné Sondes d’amorce aux puits.

Ajouter 22,5 microlitres du bon mélange de matière première NTC aux puits désignés. Ensuite, utilisez un joint de plaque adhésif pour sceller la plaque à 96 puits et centrifugez pendant une minute à 700 G pour vous assurer que le contenu est au fond des puits avec l’adaptateur à 96 puits. Placez la plaque dans le mélangeur vortex et mélangez à 1000 RP pendant une minute.

Ensuite, centrifugez la plaque à 700 G pendant cinq minutes. Pour préparer les plaques d’analyse à 384 puits, allumez le pipeteur multicanaux automatisé et double-cliquez sur l’icône du logiciel pour ouvrir le protocole de fabrication des plaques d’analyse d’interféron pour la configuration de la plate-forme. Placez une boîte d’embouts de pipette complètement pleine en position de plate-forme un, la plaque source de 96 puits en position quatre et une nouvelle plaque de 384 puits en position six.

Commencez la course en appuyant sur le bouton de lecture lorsque la course est terminée. Tapotez doucement la plaque de dosage à 384 puits sur une surface plane pour vous assurer que les fluides se trouvent au fond des puits et appliquez un joint de plaque adhésif après avoir fait tourner la plaque à 700 G pendant une minute. Retirez le joint de la plaque adhésive.

Placez la plaque de dosage à 384 puits dans le sécheur à plaques et positionnez le collecteur à 384 puits directement au-dessus des puits. Une fois que le contenu des 384 plaques de dosage est sec. Appliquez un nouveau sceau de plaque adhésive, une étiquette en aluminium rapide et conservez-le dans l’obscurité à quatre degrés Celsius jusqu’à ce qu’il soit utilisé pour charger et exécuter la plaque de test.

Préparez deux mélanges de gènes ou de HKG en diluant deux microlitres de S-S-D-N-A dans 84,9 microlitres d’eau. Ajoutez ensuite deux microlitres du SSD NA dilué 11,8 microlitres d’eau, 23 microlitres de mélange principal et 9,2 microlitres de la sonde d’amorçage correcte de 20 XHKG réglée sur chaque tube HKG étiqueté, vortex et centrifugez brièvement après avoir préparé les échantillons et l’ADNC de contrôle positif à 78,8 microlitres de mélange principal et 54,8 microlitres d’eau à chaque échantillon de 24 microlitres et tube de contrôle positif. Pour préparer les étalons et les mélanges de puits NTC à ajouter à une plaque d’analyse séchée de 384 puits, ajoutez 165 microlitres d’eau à 275 microlitres de mélange principal dans un tube de 1,5 millilitre pour le puits NTC, mélangez à 52,5 microlitres d’eau à 52,5 microlitres de mélange principal dans un tube de 1,5 millilitre.

Retirer une plaque d’analyse séchée à 384 puits préalablement préparée à quatre degrés Celsius et centrifuger à 700 GS pendant une minute. Avec la pipette électronique multicanaux de 30 microlitres, distribuez 7,5 microlitres de NTC. Bien mélanger à chaque NTC.

Bien distribuer six microlitres des étalons bien mélanger et 1,5 microlitres de l’étalon à chaque étalon. Versez ensuite 7,5 microlitres de l’échantillon dans les puits désignés avec une pipette électronique multicanaux de 12,5 microlitres. Distribuez 2,5 microlitres de l’amorce HKG La sonde se mélange aux puits désignés après avoir utilisé un film adhésif optique pour sceller la plaque et une centrifusion à 700 G pendant une minute vortex la plaque scellée à 384 puits dans le mélangeur à vortex à 2, 600 tr/min pendant deux minutes et centrifuger à 700 fromage pendant cinq minutes.

Enfin, placez la plaque de test scellée dans la machine Q-R-T-P-C-R. Ouvrez le modèle pour la présentation du test et en utilisant les conditions de réaction suivantes. Commencez l’exécution, exportez et analysez les données selon le protocole textuel comme le montre cette figure, les signatures d’expression de l’interféron de type un et trois ont été analysées dans des cellules mononucléées du sang périphérique ou des BMC p de six donneurs stimulés avec des ligands de récepteurs de type toll.

Les données sont présentées sous forme de graphiques radar sur une échelle logarithmique à l’aide de deux méthodes d’analyse, y compris la valeur absolue de CQ normalisée au gène de ménage et le nombre de copies de la matrice par microgramme d’ARN total. Les données montrent que les signatures d’expression de l’interféron humain induites par les agonistes du TLR sont des signatures d’expression spécifiques au ligand de l’interféron de type un et trois dans Resus Maccas. Dans cette expérience, les PBMC de trois donneurs ont été stimulés avec trois ligands pendant trois heures.

L’expression du sous-type de l’interféron dans les cellules non stimulées au départ était faible, comme le montre ici. Un nombre limité de sous-types d’interféron alpha ont été exprimés en réponse au LPS et au poly ic. En revanche, l’expression de l’interféron en réponse à l’imiquimod était élevée et l’expression du sous-type était une expression large de l’interféron bêta et de l’interféron.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de préparer, d’exécuter et de analyze. 3D quatre plaques de dosage pour l’analyse à haut débit d’un groupe de gènes très similaire comme le type un et trois sous-types d’interféron.