Capture réparation des tissus chez le poisson zèbre larves avec Time-lapse Brightfield stéréomicroscopie

Cette vidéo présente une méthode pour capturer la dynamique de réparation des tissus sur un stéréomicroscope à l’aide de l’imagerie en accéléré. Ceci est accompli en élevant d’abord les embryons de poisson-zèbre jusqu’aux stades larvaires lorsque la nageoire caudale s’est suffisamment développée à une taille dans laquelle les amputations peuvent être facilement effectuées. Ceci est généralement réalisé après l’éclosion.

La deuxième étape consiste à amputer la nageoire caudale à l’aide d’une aiguille de seringue. La troisième étape consiste à monter les larves dans une chambre d’imagerie et à capturer un film en accéléré sur un stéréomicroscope. La dernière étape consiste à quantifier la régénération de la nageoire caudale à l’aide d’un logiciel d’analyse d’imagerie tel que Bit Plains S ou le logiciel open source image J.Hi.My en laboratoire étudie la réparation des plaies et la régénération des tissus en utilisant le poisson-zèbre comme modèle.

Aujourd’hui, nous allons faire la démonstration d’une méthode qui capture la dynamique de ces processus en temps réel à l’aide de la stéréomicroscopie à fond clair. Aujourd’hui, nous allons faire la démonstration d’une méthode qui capture les premiers processus de régénération des tissus à l’aide de la nageoire caudale larvaire du poisson-zèbre. La méthode d’imagerie présentée offre la possibilité d’observer et d’analyser les comportements à l’échelle de l’ensemble des tissus dans un simple réglage de microscope, qui est facilement adaptable à tout stéréomicroscope équipé de capacités de time-lapse.

Alors commençons. Élevage du poisson-zèbre Jusqu’aux stades larvaires. La réparation de la plaie de la nageoire caudale peut être mieux observée après les étapes d’éclosion, car la nageoire caudale s’est suffisamment développée à ce moment-là, et les amputations peuvent être facilement effectuées sans endommager la moelle épinière ou d’autres tissus.

À proximité, collectez les œufs et incubez-les dans un incubateur à 28 degrés Celsius pendant la nuit. Le lendemain matin, retirez les embryons morts et rincez-les avec un milieu embryonnaire contenant 0,03 % de solution saline instantanée d’aquarium océanique. Si nécessaire, ajoutez un milieu embryonnaire avec 0,003 % de phénothyroïde dans la boîte pour éviter la pigmentation des larves.

Pour cette démonstration, nous avons laissé les embryons se développer jusqu’à deux jours après la fécondation dans l’incubateur lorsque les larves ont éclos de leur préparation de la chambre d’imagerie. Dans cette étape, nous proposons deux méthodes pour construire la chambre d’imagerie. La première méthode consiste en une chambre d’imagerie fabriquée à partir de tubes en PVC ou en téflon de qualité eau potable, qui peuvent être obtenus dans n’importe quelle quincaillerie.

Utilisez un tube avec un diamètre extérieur de 25 millimètres et un diamètre intérieur de 20 millimètres, car il a la taille appropriée pour la fixation de la lamelle. Coupez le tube pour faire des anneaux de 10 millimètres d’épaisseur aussi uniformes que possible. Utilisez du papier de verre pour lisser les bords et rincez à l’eau et à l’éthanol.

Laissez la chambre sécher à l’air. La deuxième méthode consiste soit à utiliser un fond en verre technique mat préfabriqué, une chambre d’imagerie supérieure en verre, soit à fabriquer une chambre d’imagerie à partir d’une petite boîte de Pétri. Pour fabriquer votre propre chambre d’imagerie, utilisez une boîte de Pétri de 35 ou 50 millimètres et percez un trou de 10 millimètres dans le couvercle.

Ensuite, appliquez de la graisse silicone à l’extérieur de la lamelle et fixez une lamelle carrée ou ronde de 25 x 25 millimètres à l’extérieur avec une pointe de pipette propre pour vous assurer que l’agros de montage reste fermement fixé. Pendant la procédure d’imagerie, fixez un filet en plastique fin à l’intérieur de la lamelle. Cela peut être accompli en coupant le treillis à la taille du diamètre de l’anneau intérieur, puis en coupant un petit rectangle d’environ trois fois la taille des larves au milieu du treillis.

Montage et imagerie des larves avant la blessure. Cette étape convient à la quantification ultérieure de la régénération des nageoires. Tout d’abord, préparez une solution agro à faible point de fusion à 0,5 % dans un milieu embryonnaire pour l’immobilisation de l’échantillon transférant la larve anesthésiée dans la solution aro qui a été maintenue à 42 degrés Celsius.

Dans un bloc chauffant, transférez les larves avec une goutte d’agros dans une petite boîte de Pétri et positionnez les larves sur le côté. À l’aide d’une pointe de micro-chargeur bouchée, laissez l’aros se solidifier et ajoutez la solution trica. Passez au stéréomicroscope qui sera utilisé plus tard.

Pour l’imagerie en accéléré, nous utilisons un stéréomicroscope zes discovery V 12 et le logiciel de vision Axio pour la démonstration. Tout d’abord, ajustez les paramètres du microscope en sélectionnant l’objectif et le grossissement appropriés pour l’imagerie. Sélectionnez ensuite le mode de détection de la caméra sur le microscope dans le logiciel alvis.

Sélectionnez le mode en direct pour voir la larve à l’écran. Ouvrez la fenêtre des propriétés pour détecter automatiquement la luminosité, ajuster manuellement le contraste à la base de transillumination du microscope. Déplacez les larves hors du champ de vision et sélectionnez la fonction de correction de l’ombrage.

Pour minimiser le bruit de fond, replacez les larves dans le champ de vision et prenez une photo. Enregistrez l’image pour vous préparer à la blessure. Retirez les larves de l’aros en grattant d’abord les aéros de la tête.

Cela permet aux larves de pouvoir glisser hors de l’aéros en éloignant doucement la tête du reste de l’essai d’amputation aéros. Préparez une plaque aérodynamique à 1,5 % en utilisant une solution instantanée de sel de mer. À l’aide d’un microscope stéréoscopique, placez les larves sur le côté sur les aros solidifiés et amputez la partie distale de la nageoire caudale à l’aide d’une aiguille de seringue de calibre 23.

Montage des larves pour l’imagerie en accéléré. Nous présenterons deux méthodes d’imagerie time-lapse. Dans la première méthode, nous montrerons comment imager les larves dans l’anneau de la chambre après le montage des larves.

Grattez soigneusement les agros solidifiés entourant la nageoire caudale distale à l’aide d’une pointe de pipette à micro-chargeur. Cela permet une bonne cicatrisation des plaies ou une régénération des tissus Sans restreindre les tissus, essayez de ne pas blesser la nageoire à plusieurs reprises. Au cours de cette procédure, retirez de la chambre les débris indésirables qui interfèrent avec la procédure d’imagerie en remplaçant l’ancienne solution.

Avec une solution de Trica fraîche, appliquez de la graisse de silicone sur le dessus de la chambre et remplissez l’anneau de la chambre avec une solution de Trica fraîche. Appliquez une lame de verre sur le dessus pour sceller la chambre méthode deux. Dans cette méthode, nous allons vous montrer comment imager les larves dans une boîte de Pétri en verre.

Montez les larves sur le couvercle, couvrez-le et remplissez le couvercle. Avec la solution trica. Grattez l’agros de la nageoire caudale.

Ensuite, appliquez de la graisse de silicone sur le bord supérieur de la chambre inférieure et remplissez la chambre avec une solution de trica. Décantez soigneusement la solution trica du couvercle et retournez le couvercle pour immerger la larve dans la solution trica de la chambre inférieure, ce qui peut être fait à un léger angle. Pour éviter les poches d’air, la chambre sera scellée avec l’imagerie time-lapse à la graisse de silicium pour s’assurer qu’une température appropriée de 28 degrés Celsius est maintenue.

Assemblez une chambre d’incubation chauffée faite de papier bulle en carton pour l’isolation et un dôme câblé comme utilisé pour l’incubation des œufs de poule comme source de chaleur. Placez la chambre d’incubation autour du microscope et ajustez la température à 28 degrés Celsius. Pendant environ 10 à 20 minutes ou jusqu’à ce que la température se soit stabilisée, ouvrez l’avant de la chambre d’incubation chauffée et placez la chambre d’imagerie sur le microscope.

Tenez-vous debout, le couvercle tourné vers le haut vers l’objectif. Positionnez la nageoire larvaire de manière à ce que les deux tiers du champ de vision restent inoccupés afin d’assurer la capture de la croissance et de la régénération de la nageoire au cours de la procédure d’imagerie. Sans avoir à repositionner les larves dans la fenêtre d’acquisition multidimensionnelle 60 du logiciel, sélectionnez l’option Pile Z et time-lapse dans l’onglet Zack et le mode slice.

Sélectionnez l’épaisseur de la tranche, puis sélectionnez le mode de démarrage et d’arrêt. Définissez les positions supérieure et inférieure de la pile dans la table time-lapse. Sélectionnez l’intervalle et la durée de la vidéo, puis appuyez sur le bouton de démarrage pour commencer l’enregistrement.

Dans la première heure, vérifiez les limites et Zack des larves. Si nécessaire, repositionnez les larves au fil du temps car elles peuvent s’être déplacées en raison de la croissance ou des différences dans la composition de l’agros. Enregistrez le fichier à la fin de l’enregistrement time-lapse et procédez à l’étape de post-traitement et d’analyse des données de quantification.

Dans cette section, nous abordons plusieurs façons d’analyser les données générées par la méthode une image. Tout d’abord, nous verrons comment déterminer la croissance des ailerons avec le logiciel imas. Ouvrez le film time-lapse dans le logiciel Amaris et enregistrez les fichiers au format de fichier MRS.

Pour améliorer les performances du logiciel, sélectionnez la vue orthogonale pour afficher le film sous forme de projection. Pour mesurer la longueur de l’aileron, sélectionnez l’option Ajouter de nouveaux points de mesure dans la barre d’outils supérieure gauche. Sous Configurer la liste des valeurs de statistiques visibles, sélectionnez les valeurs de statistiques à afficher en mode ligne.

Sous l’onglet des paramètres, sélectionnez les paires dans les propriétés des étiquettes, sélectionnez le nom et la distance pour afficher la distance entre les points A et B à côté de la ligne de mesure, passez en mode d’édition et maintenez le bouton Maj enfoncé pour sélectionner le premier point au niveau de la nageoire distale. Utilisez ensuite la même configuration pour sélectionner le deuxième point à l’extrémité distale du no accord. La distance sera affichée dans l’image et pourra être exportée sous l’onglet statistiques.

En sélectionnant le bouton du disque, exportez tout en bas à droite. Alternativement à l’option de points de mesure, le visualiseur de tranches peut être utilisé pour mesurer les distances en mode d’affichage en tranche. Faites défiler jusqu’à la position souhaitée et cliquez sur la première et la deuxième position avec le bouton gauche de la souris, la distance s’affichera.

Cette option ne permet toutefois pas l’exportation des données. Nous allons maintenant voir brièvement comment déterminer la surface de l’aileron à l’aide du logiciel open source. Image J.Ouvrez le film TimeLapse dans l’image J à l’aide d’un plug-in qui reconnaît le format de fichier de vision Zeiss Axio.

Vous pouvez également charger dans une séquence TIFF non compressée. Cela garantira que les informations du fichier sont enregistrées sous analyser, sélectionnez définir l’échelle pour définir la distance, les pixels et la distance connue, si elle n’est pas conservée dans le fichier. Réglez également la longueur unitaire sur micromètres.

Dans la barre d’outils. Sélectionnez l’outil de sélection à main levée et tracez le contour de la blessure en maintenant le bouton gauche de la souris enfoncé. Tout en dessinant le long des bords de la plaie.

Cliquez sur l’option de mesure sous Analyser pour afficher la zone des résultats représentatifs de la plaie. L’amputation de la nageoire entraîne une régénération partielle dans les 36 heures suivant l’amputation. Les mesures de surface de la nageoire montrent que l’amputation de la nageoire déclenche une diminution du tissu de la nageoire jusqu’à environ 14 heures après l’amputation, probablement en raison de la mort cellulaire, qui est suivie d’une faible longueur de régénération.

La comparaison de l’aileron amputé et de l’aileron régénéré montre une augmentation de 2,48 fois de la longueur de l’aileron en 36 heures. L’amputation déclenche d’abord un effet de cordon de bourse caractérisé par des contractions via des câbles de myosine d’actine qui sont présents dans le pli de la nageoire, les cellules extrudées de la plaie d’amputation et sont ensuite éliminées. La longueur du corps augmente initialement, mais la nageoire ne se régénère pas.

Au cours des premières phases. Environ 14 heures après l’amputation, la nageoire commence à se développer de la position proximale à la position distale. En résumé, nos résultats démontrent que l’amputation déclenche la contraction de la plaie, ce qui peut être essentiel pour favoriser l’extrusion cellulaire.

Une fois le processus terminé, l’aileron commence à se régénérer. La croissance des nageoires de développement semble se produire. Indépendamment de ce processus, nous avons présenté une méthode qui permet d’observer les processus dynamiques de réparation des tissus à l’aide de larves de poisson-zèbre vivantes.

Cette procédure nécessite certains aspects que nous avons testés afin d’optimiser le résultat. Un avantage évident de la méthode d’imagerie présentée est qu’elle est facilement adaptable à tout stéréomicroscope équipé d’une caméra CCD et d’un logiciel TimeLapse. Il offre également une alternative peu coûteuse au système d’imagerie confocale plus coûteux.

Bien que cette méthode n’utilise pas la fluorescence ou la détection cellulaire, elle peut être étendue à de telles applications en utilisant un système automatisé de contrôle des éclats et un logiciel de déconvolution post-imagerie pour observer davantage les processus de réparation et de régénération des plaies avec une résolution subcellulaire. Cette méthode peut fournir aux étudiants une meilleure compréhension des processus biologiques de base, de la réparation et de la régénération des tissus sous-jacents. La clarté optique et la facilité d’utilisation des poissons-zèbres embryonnaires et larvaires, ainsi que l’adaptabilité du système à n’importe quel stéréomicroscope, le rendent adapté à l’enseignement de la biologie de base des vertèbres dans une salle de classe.