Capture réparation des tissus chez le poisson zèbre larves avec Time-lapse Brightfield stéréomicroscopie

Ce vidéo montre une méthode permettant de capturer la dynamique de réparation tissulaire au microscope stéréo à l’aide d’imagerie en accéléré. Cette approche consiste d’abord à élever des embryons de poisson zèbre jusqu’au stade larvaire, moment où la nageoire caudale est suffisamment développée pour que des amputations puissent être facilement réalisées. Cela est généralement obtenu après l’éclosion.

La deuxième étape consiste à amputer la nageoire caudale à l’aide d’une aiguille de seringue. La troisième étape consiste à monter les larves dans une chambre d’imagerie et à capturer un film en prise de vue séquentielle sur un microscope stéréo. La dernière étape consiste à quantifier la régénération de la nageoire caudale à l’aide d’un logiciel d’analyse d’image tel que Bit Plains S ou le logiciel libre ImageJ. Bonjour. Mon laboratoire étudie la réparation des plaies et la régénération tissulaire en utilisant le poisson zèbre comme modèle.

Aujourd'hui, nous allons démontrer une méthode permettant de capturer en temps réel la dynamique de ces processus à l'aide d'une microscopie stéréo en champ clair. Nous présenterons une méthode qui saisit les premiers stades de la régénération tissulaire en utilisant la nageoire caudale de larves de poisson zèbre. La méthode d'imagerie décrite offre la possibilité d'observer et d'analyser des comportements à l'échelle du tissu entier dans un dispositif microscopique simple, facilement adaptable à tout microscope stéréo équipé d'une fonction d'acquisition en laps de temps.

Commençons donc. Élevage des zebrafish jusqu'aux stades larvaires. La réparation de la plaie dans la nageoire caudale peut être observée de manière optimale après les stades d'éclosion, car la nageoire caudale est suffisamment développée à ce moment-là, et les amputations peuvent être réalisées facilement sans endommager la moelle épinière ni d'autres tissus.

En proximité immédiate, recueillir les œufs et les incuber toute la nuit dans un incubateur à 28 degrés Celsius. Le lendemain matin, retirer les embryons morts et rincer avec du milieu pour embryons contenant une solution saline d'aquarium Instant Ocean à 0,03 %. Si nécessaire, ajouter au plat du milieu pour embryons contenant 0,003 % de phéno-thyroïde afin d'éviter la pigmentation des larves.

Pour cette démonstration, nous laissons les embryons se développer jusqu'à deux jours après la fécondation dans l'incubateur, lorsque les larves ont éclos de leurs kons, en préparation de la chambre d'imagerie. Dans cette étape, nous proposons deux méthodes pour construire la chambre d'imagerie. La méthode un consiste en une chambre d'imagerie fabriquée à partir de tubes en PVC ou en téflon de qualité eau potable, que l'on peut se procurer dans n'importe quel magasin de bricolage.

Utilisez un tube de 25 millimètres de diamètre extérieur et de 20 millimètres de diamètre intérieur, car cette dimension convient à l'attachement des lamelles. Coupez le tube en anneaux de 10 millimètres d'épaisseur aussi réguliers que possible. Lissez les bords à l'aide de papier de verre, puis rincez à l'eau et à l'éthanol.

Laisser sécher à l'air la chambre. La méthode deux consiste soit à utiliser une chambre d'imagerie préfabriquée en verre mat avec fond et couvercle en verre, soit à fabriquer une chambre d'imagerie à partir d'une petite boîte de Pétri. Pour fabriquer votre propre chambre d'imagerie, utilisez une boîte de Pétri de 35 ou 50 millimètres et percez un trou de 10 millimètres dans le couvercle.

Ensuite, appliquer de la graisse silicone à l'extérieur de la lame et fixer une lame carrée ou ronde de 25 sur 25 millimètres à l'extérieur à l'aide d'une pointe de pipette propre afin de garantir que le montage en agarose reste fermement attaché. Pendant la procédure d'imagerie, fixer une fine maille en plastique à l'intérieur de la lame. Cela peut être réalisé en découpant la maille selon le diamètre intérieur de l'anneau, puis en découpant un petit rectangle d'environ trois fois la taille des larves au milieu de la maille.

Montage et imagerie des larves avant blessure. Cette étape est appropriée pour la quantification ultérieure de la régénération des nageoires. Tout d'abord, préparez une solution d'agarose à faible fusion à 0,5 % dans du milieu embryonnaire afin d'immobiliser l'échantillon en transférant la larve anesthésiée dans la solution d'agarose maintenue à 42 degrés Celsius.

Dans un bloc chauffant, transférez les larves avec une goutte d'agaros dans une petite boîte de Pétri et positionnez les larves sur le côté. À l'aide d'une micropipette munie d'un embout bouché, laissez l'agaros durcir, puis ajoutez la solution de trica. Poursuivez vers le microscope stéréo qui sera utilisé ultérieurement.

Pour l'imagerie en time-lapse, nous utilisons un microscope stéréo ZES Discovery V12 et le logiciel Axio Vision à des fins de démonstration. Commencez par régler les paramètres du microscope en sélectionnant l'objectif et le grossissement appropriés pour l'imagerie. Ensuite, sélectionnez le mode de détection de la caméra sur le microscope dans le logiciel Alvis.

Sélectionnez le mode direct pour visualiser la larve à l'écran. Ouvrez la fenêtre des propriétés pour détecter automatiquement la luminosité, puis réglez manuellement le contraste à la base d'illumination transversale du microscope. Déplacez les larves hors du champ de vision et sélectionnez la fonction de correction d'ombrage.

Pour minimiser le bruit de fond, replacez les larves dans le champ de vision et prenez une image. Enregistrez l'image afin de vous préparer à la blessure. Retirez les larves des aros en grattant d'abord les aéros de la tête.

Cela permet aux larves de pouvoir s'extraire délicatement des aros en tirant doucement la tête loin du reste de l'assay d'amputation aros. Préparez une boîte de gélose aros à 1,5 % en utilisant une solution saline d'Instant Ocean. Sous un microscope stéréo, placez les larves sur le côté sur l'agarose solidifiée et amputez la partie distale de la nageoire caudale à l'aide d'une aiguille de seringue de calibre 23.

Montage des larves pour l'acquisition d'images en laps de temps. Nous présenterons deux méthodes d'acquisition d'images en laps de temps. Dans la première méthode, nous montrerons comment acquérir des images des larves dans un anneau de chambre après le montage des larves.

Retirez soigneusement l'agaros solide entourant la nageoire caudale distale à l'aide d'une pointe de pipette micro-loader munie d'un capuchon. Cela permet une cicatrisation adéquate ou une régénération tissulaire. Sans entraver le tissu, veillez à ne pas blesser à plusieurs reprises la nageoire. Pendant cette procédure, éliminez les débris indésirables qui pourraient gêner l'imagerie en remplaçant la solution ancienne dans la chambre.

Avec une solution Trica fraîche, appliquez de la graisse silicone sur le dessus de la chambre et remplissez l'anneau de la chambre avec une solution trica fraîche. Appliquez une lame de verre sur le dessus pour sceller la chambre selon la méthode deux. Dans cette méthode, nous allons vous montrer comment imager les larves dans une boîte de Pétri à fond en verre.

Monter les larves sur le couvercle, la lame et remplir le couvercle avec la solution trica. Racler l'agarose depuis la nageoire caudale.

Ensuite, appliquer de la graisse au silicone sur le rebord supérieur de la chambre inférieure et remplir la chambre avec la solution trica. Verser soigneusement la solution trica à partir du couvercle et retourner le couvercle afin d'immerger la larve dans la solution trica de la chambre inférieure, ce qui peut être fait selon un léger angle. Pour éviter la formation de poches d'air, la chambre sera scellée avec la graisse au silicone pour l'imagerie en lapse de temps, en veillant à maintenir une température adéquate de 28 degrés Celsius.

Assemblez une chambre d'incubation chauffée fabriquée en carton et papier bulle pour l'isolation, ainsi qu'un dôme électrique tel que celui utilisé pour l'incubation des œufs de poule comme source de chaleur. Placez la chambre d'incubation autour du microscope et réglez la température à 28 degrés Celsius. Pendant environ 10 à 20 minutes, ou jusqu'à ce que la température se stabilise, ouvrez l'avant de la chambre d'incubation chauffée et placez la chambre d'imagerie sur le microscope.

Placez-vous avec la lame couvre-objet orientée vers le haut, face à l'objectif. Positionnez la nageoire larvaire de manière à ce qu'un tiers du champ de vision reste inoccupé, afin de garantir la capture de la croissance et de la régénération de la nageoire au cours de la procédure d'acquisition d'images. Sans avoir à repositionner les larves dans la fenêtre d'acquisition multidimensionnelle à 60 positions du logiciel, sélectionnez l'option pile Z et acquisition temporelle (time-lapse) dans l'onglet Zack, ainsi que le mode de coupe.

Sélectionnez l'épaisseur de coupe, puis choisissez le mode de début et d'arrêt. Définissez les positions supérieure et inférieure de la pile dans le tableau de laps de temps. Sélectionnez l'intervalle et la durée du film, puis appuyez sur le bouton de démarrage pour commencer l'enregistrement.

Durant la première heure, vérifiez les limites des larves et celles de Zack. Si nécessaire, repositionnez les larves au fil du temps, car elles peuvent avoir bougé en raison de la croissance ou de différences dans la composition de l'agarose. Enregistrez le fichier à la fin de l'enregistrement en time-lapse et passez à l'analyse des données, incluant le post-traitement et la quantification.

Dans cette section, nous discutons plusieurs façons d'analyser les données générées par la méthode un imas. Premièrement, nous allons expliquer comment déterminer la croissance des nageoires à l'aide du logiciel imas. Ouvrez le film en accéléré dans le logiciel Amaris et enregistrez les fichiers au format MRS.

Pour améliorer les performances du logiciel, sélectionnez la vue orthogonale afin d'afficher le film sous forme de projection. Pour mesurer la longueur de la nageoire, sélectionnez l'option ajouter de nouveaux points de mesure dans la barre d'outils en haut à gauche. Sous la configuration de la liste des valeurs statistiques visibles, choisissez les valeurs statistiques à afficher en mode ligne.

Sous l'onglet Paramètres, sélectionnez paires dans les propriétés des étiquettes, puis sélectionnez nom et distance pour afficher la distance entre les points A et B à côté de la ligne de mesure. Passez ensuite en mode édition et maintenez enfoncée la touche Maj pour sélectionner le premier point à l'extrémité distale de la nageoire. Utilisez ensuite la même configuration pour sélectionner le second point à l'extrémité distale du no accord. La distance s'affichera sur l'image et pourra être exportée sous l'onglet Statistiques.

En sélectionnant le bouton disque « exporter tout » en bas à droite. En alternative à l'option des points de mesure, le visionneur de coupe peut être utilisé pour mesurer les distances en mode d'affichage en coupe. Faites défiler jusqu'à la position souhaitée et cliquez sur la première et la seconde position avec le bouton gauche de la souris ; la distance sera affichée.

Cette option ne permet toutefois pas l'exportation des données. Nous allons maintenant discuter brièvement de la manière de déterminer la surface des nageoires à l'aide du logiciel libre ImageJ. Ouvrez le film TimeLapse dans ImageJ en utilisant un module complémentaire qui reconnaît le format de fichier Zeiss Axio Vision.

Charger éventuellement une séquence TIFF non compressée. Cela permettra de s'assurer que les informations du fichier sont enregistrées sous Analyser, sélectionner Définir l'échelle pour indiquer la distance en pixels et la distance connue, si elle n'est pas conservée dans le fichier. De plus, régler l'unité de longueur en micromètres.

Dans la barre d'outils, sélectionnez l'outil de sélection à main levée et délimitez la plaie en maintenant le bouton gauche de la souris enfoncé. En traçant le long des bords de la plaie.

Cliquez sur l'option Mesurer dans le menu Analyser pour afficher la surface de la plaie, résultats représentatifs. L'amputation de la nageoire entraîne une régénération partielle au cours des 36 heures suivant l'amputation. Les mesures de surface de la nageoire montrent que l'amputation provoque une diminution du tissu de la nageoire jusqu'à environ 14 heures après l'amputation, probablement en raison de la mort cellulaire, suivie ensuite par une faible régénération en longueur.

La comparaison entre la nageoire amputée et la nageoire régénérée montre une augmentation de 2,48 fois de la longueur de la nageoire en 36 heures. L'amputation déclenche initialement un effet de « suture contractile » caractérisé par des contractions via des câbles d'actomyosine présents dans les cellules du repli de la nageoire, qui s'extrudent de la plaie d'amputation et sont ensuite éliminées. La longueur du corps augmente initialement, mais la nageoire ne régénère pas.

Pendant les premières phases. Environ 14 heures après l'amputation, la nageoire commence à se développer depuis les positions proximales vers les positions distales. En résumé, nos résultats démontrent que l'amputation déclenche une contraction de la plaie, qui pourrait être essentielle pour favoriser l'extrusion cellulaire.

Une fois le processus terminé, la nageoire commence à se régénérer. La croissance développementale de la nageoire semble se produire. Indépendamment de ce processus, nous avons présenté une méthode permettant l'observation des processus dynamiques de réparation tissulaire à l'aide de larves de zebrafish vivantes.

Cette procédure exige certains aspects que nous avons testés afin d'optimiser le résultat. Un avantage évident de la méthode d'imagerie présentée est qu'elle s'adapte facilement à tout microscope stéréo muni d'une caméra CCD et d'un logiciel TimeLapse. Elle offre également une alternative peu coûteuse au système d'imagerie confocale, plus onéreux.

Bien que cette méthode n'utilise pas la fluorescence ou la détection cellulaire, elle peut être étendue à de telles applications en ayant recours à un système automatisé de contrôle des éclats et à un logiciel de déconvolution post-imagerie afin d'observer plus en détail les processus de réparation et de régénération des lésions avec une résolution subcellulaire. Cette méthode peut offrir aux étudiants une compréhension approfondie des processus biologiques fondamentaux sous-jacents à la réparation et à la régénération des tissus. La transparence optique, la facilité d'utilisation des zebrafish embryonnaires et larvaires, ainsi que l'adaptabilité du système à tout microscope stéréo, le rendent adapté à l'enseignement de la biologie de base des vertébrés dans un cadre scolaire.