Name: Deux photons imagerie intracellulaire de Ca 2+ Manipulation et production doxyde nitrique endothélial et en cellules de muscle lisse dun Rat aorte isolée (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-06-10T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 8 s
Description: Découvrez l'imagerie biphotonique pour mesurer le calcium et l'oxyde nitrique intracellulaires dans les cellules endothéliales et musculaires lisses d'aorte de rat isolée. Cette méthode offre une résolution élevée pour étudier la signalisation vasculaire.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Nous remercions le Dr William Cashdollar, et le Centre Foundation Imaging Northwestern Mutual à l&#39;Institut de recherche de sang du Wisconsin de l&#39;aide pour les études d&#39;imagerie. Nous remercions également le Dr Daria Ilatovskaya pour la lecture critique de ce manuscrit et de discussion utile. Cette étude a été soutenue par les National Institutes of Health des subventions HL108880 (AS) et DP2-OD008396 (à AMG).

Les procédures expérimentales décrites ci-dessous ont été approuvés par le Comité institutionnel de protection des animaux et l&#39;utilisation (IACUC) au Collège médical du Wisconsin et étaient en conformité avec les National Institutes of Health Guide pour le soin et l&#39;utilisation des animaux de laboratoire. 1. Isolement de l&#39;aorte Rat <ol><li> Anesthésier rats avec de l&#39;isoflurane (5% induction, 1,5 à 2,5% maintenance) ou d&#39;une autre méthode IACUC approuvé. </li><li> Placez le rat dans une position couchée. Afin d&#39;exposer les organes abdominaux, faire une petite incision médiane ventrale à travers la peau et du tissu sous-cutanée abdominale. Utilisation des tampons de gaze dévier doucement les intestins pour exposer l&#39;aorte et la veine cave comme représenté sur la figure 1. </li><li> En bref, l&#39;aorte Blunt disséquer du tissu conjonctif et de la veine cave. Utilisation de suture, attacher l&#39;aorte aussi proche que possible du rein. Disséquer environ 1 - 2 cm de l&#39;aorte et le placer dans un 15 ml conique tuêtre contenant physiologique normale de Salt Solution (PSS; en mm: 140 NaCl, 1,2 MgCl2, 2 CaCl2, KCl 4,5, 6 glucose, 10 HEPES) sur de la glace. </li><li> Une fois que l&#39;aorte est isolé, l&#39;euthanasie de l&#39;animal selon des protocoles approuvés IACUC. À la fin de non-survie procédures euthanasier les animaux profondément anesthésiés par thoracotomie induire pneumothorax pour assurer la disparition de l&#39;animal humain. 3 </li><li> En utilisant un microscope de dissection, pinces à pointe fine, et microciseaux dissèquent la graisse et du tissu conjonctif hors de l&#39;aorte. Une fois l&#39;aorte est propre, couper l&#39;aorte longitudinalement et le placer dans PSS sur la glace pour plus tard. </li></ol> 2. Chargement Dye et incubation <ol><li> Pipet 7 pi de 1 mM Fluo-quatre heures colorant, qui est fourni en solution à base de DMSO, en particuliers des tubes de 500 pi qui ont été couverts d&#39;une feuille d&#39;aluminium. Conserver au congélateur à -20 ° C pour préserver les propriétés de colorant au fil du temps. Remarque: si ces aliquoteslutions doivent être stables pendant au moins six mois. </li><li> Avant utilisation, permettent les solutions de colorant se réchauffer à la température ambiante avant ouverture. Préparer des solutions de travail immédiatement avant utilisation. Ne pas stocker réactif dilué pour une utilisation ultérieure. </li><li> Ajouter 7 pi de ready-made 1 mM Fluo-quatre heures colorant dissous dans une solution de DMSO à 450 ul du PSS ne contenant pas de calcium. Ajouter 40 pi de solution non de DMSO base de 10% d&#39;acide Pluronic au cocktail de chargement pour aider à disperser les acétoxyméthyliques (AM) esters et améliorer le chargement du colorant de calcium. </li><li> Placez les aortes disséqués dans les tubes 500 pi contenant le cocktail de chargement (comme décrit dans le paragraphe 2.3) pendant 1 h. Couvrir tous les tubes avec du papier et le placer sur un agitateur rotatif à la température ambiante. </li><li> Pour surveiller la production de NO dans le système vasculaire, utilisez DAF-FM diacétate colorant. Incuber l&#39;aorte dans une solution contenant 450 ul de PSS, 40 ul d&#39;acide Pluronic et 5 ul de 10 mM de diacétate de DAF-FM. Comme pour le protocole d&#39;incubation de calcium (décrite au point 2.3), placer l&#39;aortedans un tube de 500 ul contenant la solution NO-teinture couvert de feuille et le placer sur un agitateur rotatif pendant 30 min à 4 ° C puis 30 min à température ambiante prochaine. </li><li> Lorsque la production de NO est mesurée, utilisez la NO synthase endothéliale bloqueur, L-NAME, de bloquer la production de NO comme un contrôle comme montré dans la figure 4B. Pour cette procédure, ajouter à cocktail (tel que décrit à 2,5) 100 nM L-NAME pour les 30 dernières minutes d&#39;incubation (à température ambiante). </li></ol> 3. balayage laser Deux Protocole photon Microscopie <ol><li> Après l&#39;incubation de 1 h, laver l&#39;aorte 2 - 3 fois en propre PSS à éliminer le colorant extracellulaire. </li><li> Transférer l&#39;aorte dans un plat recouvert de silicone contenant soit PSS normale ou Ca 2+ tampon exempt (dépend du protocole expérimental). Pin de l&#39;aorte vers le bas sur le revêtement de silicone avec l&#39;adventice en contact avec la silicone (par exemple, lumière endotheliales exposées à l&#39;ouverture de plat) à l&#39;aide des broches en forme de μ. Sinon, utilisez un ancrage Slicegrille ou d&#39;une colle pour fixer le tissu. Remarque: Pour réduire le stress et artefacts mécaniques possibles, le transfert et fixer aorte Ca 2+ exempt de solution et d&#39;attendre 5 à 10 minutes avant de commencer l&#39;expérience. </li><li> Raccorder une pompe péristaltique ou une seringue à la plaque revêtue de silicone pour une application manuelle ou automatique de la drogue ou pour modifier la solution extracellulaire. </li><li> Placer le plat sous le morceau de la verticale à deux photons microscope nez, et à installer et positionner un 25 × (NA 1,05 et distance de travail 2 mm) immersion dans l&#39;eau objectif au-dessus du spécimen. Remarque: Si cet objectif spécifique ne sont pas disponibles, utilisez un objectif spécifiquement fabriqués pour deux imagerie photonique, car il peut augmenter de façon spectaculaire la résolution par rapport à un objectif régulier de signal. </li><li> Activez le laser à deux photons en utilisant le logiciel (le laser commence à pomper et allumez). Tune l&#39;excitation laser à 820 nm. </li><li> Utilisation épifluorescence, localiser l&#39;aorte et de se concentrer sur l&#39;objectifla surface endothéliale en utilisant ajustement grossier. </li><li> Mettez le microscope en mode de balayage laser à deux photons, veiller à ce que le laser d&#39;excitation est mode verrouillé, les détecteurs non-descanned sont engagés et les filtres d&#39;émission appropriées pour les spectres d&#39;émission attendue sont installés. Remarque: Ici, l&#39;FV10-MRL / R (495 à 540 nM) ont été utilisés. </li><li> Lancer la numérisation en direct en utilisant environ 5% de la puissance laser et ajuster finement l&#39;objectif afin de visualiser les cellules endothéliales. Remarque: Les cellules endothéliales présenteront un signal fluorescent forte lorsqu&#39;elle est incubée dans PSS normale. Ce sera nettement plus faible lorsque les vaisseaux sont incubés dans un tampon sans calcium. Les cellules endothéliales sont présents sur la partie supérieure de l&#39;aorte ouvert et les cellules du muscle lisse peut être vu juste en dessous des cellules endotheliales (voir figure 2). Parce que les vaisseaux sanguins ne sont ni lisse ni même, il y aura des endroits où les deux cellules musculaires lisses et des cellules endothéliales sont présents. &lt;/ Li&gt; <li> Une fois que les cellules sont en discussion, le programme de logiciel de microscope pour recueillir des images séquentielles en mode de balayage rapide (balayage de trame, 512 x 512 pixels de fenêtre avec une fréquence de collecte de trame de 1,1 s). En parallèle avec Fluo-quatre heures fluorescence, collecter transmis des images en lumière afin de détecter des changements dans contraction des vaisseaux et de mieux visualiser les conditions expérimentales. </li><li> Après la collecte d&#39;images de signaux de référence, modifier la concentration en ions Ca 2+ dans la solution externe ou lentement appliquer des agents de relance pharmacologiques utilisant la pompe péristaltique en imagerie. Observez l&#39;augmentation de signal fluorescent dans les cellules chargées. Remarque: Les cellules endothéliales de répondre aux changements dans la circulation, il est donc recommandé d&#39;utiliser des applications de laminaires bas et essais de véhicules avant l&#39;application d&#39;activateurs pharmacologiques de Ca 2+ ou NO signalisation. Pour recalculer calcium intracellulaire à des valeurs de concentration en nM navires chargés avec du Fluo-4 (constante de dissociation de Fluo-4 is 345 nM), l&#39;intensité de la fluorescence peut être enregistrée au début et après plus d&#39;ionomycine et MnCl 2. 4 </li></ol> 4. Traitement et calculs image <ol><li> Téléchargez et installez Fidji logiciel de traitement d&#39;image. </li><li> Ouvrez le fichier d&#39;image dans les îles Fidji. Après l&#39;importation du fichier, diviser les canaux (de lumière transmise et de signal fluorescent) lorsque vous êtes invité. Utilisez uniquement le signal fluorescent pour l&#39;analyse des données. </li><li> Dans le programme Fidji, cliquez sur l&#39;onglet d&#39;analyser et de faire défiler à l&#39;option d&#39;outils. Sous l&#39;option d&#39;outils, trouver l&#39;onglet qui dit gestionnaire de ROI et cliquez dessus; une nouvelle fenêtre apparaît. </li><li> Après cela, cliquez sur ensemble des mesures sous l&#39;onglet analyser. Sélectionnez les mesures spécifiques d&#39;intérêt. Pour les mesures transitoires de calcium, utilisez l&#39;option de la valeur moyenne de gris. </li><li> Avec l&#39;outil de trace circulaire, commencer à tracer les régions d&#39;intérêt (ROI) et cliquez sur &quot;ajouter&quot; sur l&#39;écran du gestionnaire de ROI pour chaque ROI. Une fois que toutes les cellules d&#39;intérêt ont été tracées, dans la fenêtre du gestionnaire de ROI, sélectionnez multi Mesure sous l&#39;onglet «plus». Pensez à sauvegarder soit les mesures directement ou copier et coller toutes ces mesures dans un tableur. </li><li> Ouvrir fichier * .txt ou un tableur Excel de Fidji et de transférer les numéros d&#39;une nouvelle feuille de calcul d&#39;origine. Remarque: Vous pouvez également utiliser un programme comme Sigma Plot ou Prism pour une analyse ultérieure. </li><li> Dans le programme d&#39;origine, utilisez le menu Plot → Ligne + Symbole d&#39;observer un aperçu de toutes les réponses transitoires. Décochez les cellules ne répondent pas. </li><li> Recalculer numéro de trace à l&#39;échelle de temps (axe X), utiliser la colonne → Définir valeurs de colonnes et de multiplier la colonne de numéro de trace à la fréquence de collecte d&#39;images (dans notre cas, 1,1 s). </li><li> Utilisez Analysis → Statistiques sur les lignes pour tous les enregistrements sélectionnés pour calculer moyenne (axe Y) et trace d&#39;erreur standard. Tracer Graphique finale pour le groupe actuel de cellules Plot → Ligne + Symbole. </li><li> Le mean calcium calcul transitoire est décrit comme suit. <ol><li> Pour diffusion totale de calcium dans le programme d&#39;origine, cliquez sur Graphique, puis utilisez le menu Analyse → → Intégrer Calcul. Intégrante totale de la zone sous la courbe apparaît dans Résultat Connexion. </li><li> Pour cinétiques transitoires, cliquez sur Graphique, puis utilisez le menu: Analyse → Curve non-linéaire Fit → Choisir Data Set (choisissent axe X vont de maximale à la fin de la réponse transitoire). Lancer Fitting → Sélectionnez → Fonction exponentielle Decay 1 → Terminé. Remarque: raccord exponentielle apparaît dans la fenêtre graphique et le résultat Connexion. Obtenu données (valeurs) représentent quantité totale de calcium libéré, et la cinétique des canaux médiés la réponse transitoire. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Molitoris, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+2-photon+microscopy+to+understand+albuminuria%5BTitle%5D)+AND+%22Trans.+Am.+Clin.+Climatol.+Assoc%22%5BJournal%5D)">Using 2-photon microscopy to understand albuminuria.</a> Trans. Am. Clin. Climatol. Assoc. 125, 343-357 (2014).</li>
<li>Burford, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+imaging+of+podocyte+calcium+in+glomerular+injury+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">Intravital imaging of podocyte calcium in glomerular injury and disease.</a> J. Clin. Invest. 124, 2050-2058 (2014).</li>
<li>Palygin, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+electrochemical+detection+of+ATP+and+H%282%29O%282%29+release+in+freshly+isolated+kidneys%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Renal+Physiol%22%5BJournal%5D)">Real-time electrochemical detection of ATP and H(2)O(2) release in freshly isolated kidneys.</a> Am. J. Physiol. Renal Physiol. 305, F134-F141 (2013).</li>
<li>Ilatovskaya, D. V., et al. Single-channel analysis and calcium imaging in the podocytes of the freshly isolated. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aIlatovskaya%2C+DV+%22J+Vis.+Exp%22">J Vis. Exp</a>. In Press, (2015).</li>
<li>Zhu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+superoxide+and+angiotensin+II+suppression+in+salt-induced+changes+in+endothelial+Ca2%2B+signaling+and+NO+production+in+rat+aorta%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Heart+Circ.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Role of superoxide and angiotensin II suppression in salt-induced changes in endothelial Ca2+ signaling and NO production in rat aorta.</a> Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 291, H929-H938 (2006).</li>
<li>Endres, B. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutation+of+Plekha7+attenuates+salt-sensitive+hypertension+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Mutation of Plekha7 attenuates salt-sensitive hypertension in the rat.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 111, 12817-12822 (2014).</li>
<li>Williams, D. A., Fogarty, K. E., Tsien, R. Y., Fay, F. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+gradients+in+single+smooth+muscle+cells+revealed+by+the+digital+imaging+microscope+using+Fura-2%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Calcium gradients in single smooth muscle cells revealed by the digital imaging microscope using Fura-2.</a> Nature. 318, 558-561 (1985).</li>
<li>Mansfield, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+elastin+network%3A+its+relationship+with+collagen+and+cells+in+articular+cartilage+as+visualized+by+multiphoton+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Anat%22%5BJournal%5D)">The elastin network: its relationship with collagen and cells in articular cartilage as visualized by multiphoton microscopy.</a> J. Anat. 215, 682-691 (2009).</li>
<li>Sathanoori, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shear+stress+modulates+endothelial+KLF2+through+activation+of+P2X4%5BTitle%5D)+AND+%22Purinergic+Signal%22%5BJournal%5D)">Shear stress modulates endothelial KLF2 through activation of P2X4.</a> Purinergic Signal. 11, 139-153 (2015).</li>
<li>Hall, A. M., Molitoris, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+Multiphoton+Microscopy%3A+Focusing+Light+on+Acute+Kidney+Injury%5BTitle%5D)+AND+%22Physiology%22%5BJournal%5D)">Dynamic Multiphoton Microscopy: Focusing Light on Acute Kidney Injury.</a> Physiology. 29, 334-342 (2014).</li>
<li>Campese, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Salt+sensitivity+in+hypertension.+Renal+and+cardiovascular+implications%5BTitle%5D)+AND+%22Hypertension%22%5BJournal%5D)">Salt sensitivity in hypertension. Renal and cardiovascular implications.</a> Hypertension. 23, 531-550 (1994).</li>
<li>Cowley, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+and+nongenetic+determinants+of+salt+sensitivity+and+blood+pressure%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Clin.+Nutr%22%5BJournal%5D)">Genetic and nongenetic determinants of salt sensitivity and blood pressure.</a> Am. J. Clin. Nutr. 65, 587S-593S (1997).</li>
<li>Flister, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+hypertension+susceptibility+loci+on+rat+chromosome+12%5BTitle%5D)+AND+%22Hypertension%22%5BJournal%5D)">Identification of hypertension susceptibility loci on rat chromosome 12.</a> Hypertension. 60, 942-948 (2012).</li>
<li>Flister, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identifying+multiple+causative+genes+at+a+single+GWAS+locus%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Identifying multiple causative genes at a single GWAS locus.</a> Genome Res. 23, 1996-2002 (2013).</li>
<li>Mattson, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+mutation+of+recombination+activating+gene+1+in+Dahl+salt-sensitive+rats+attenuates+hypertension+and+renal+damage%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Regul.+Integr.+Comp.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Genetic mutation of recombination activating gene 1 in Dahl salt-sensitive rats attenuates hypertension and renal damage.</a> Am. J. Physiol. Regul. Integr. Comp. Physiol. 304, R407-R414 (2013).</li>
<li>Rudemiller, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD247+modulates+blood+pressure+by+altering+T-lymphocyte+infiltration+in+the+kidney%5BTitle%5D)+AND+%22Hypertension%22%5BJournal%5D)">CD247 modulates blood pressure by altering T-lymphocyte infiltration in the kidney.</a> Hypertension. 63, 559-564 (2014).</li>
<li>Flister, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CXM+-+a+new+tool+for+mapping+breast+cancer+risk+in+the+tumor+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">CXM - a new tool for mapping breast cancer risk in the tumor microenvironment.</a> Cancer Res. 74, 6419-6429 (2014).</li>
</ol>

Les auteurs ont rien à révéler.

Présentation expérimentale. Pour mieux comprendre la contribution de calcium et NON à la physiologie vasculaire, une nouvelle méthode a été développée pour mesurer [Ca 2+] i et de NO dans les cellules musculaires lisses et endothéliales des aortes intactes isolées. Ensemble, ce protocole se compose de ces étapes critiques: 1) l&#39;isolement et la préparation mécanique (digestion enzymatique pas) du navire. Il est important de garder le tissu sain et intact autant que possible pour obtenir...

Le calcium est un second messager fondamental à l&#39;intérieur de cellules vasculaires tels que des cellules endotheliales et des muscles lisses. Il est le stimulus primaire pour la contraction vasculaire et joue un rôle majeur dans la dilatation vasculaire, y compris ses effets par le biais de la production de NO dans le endothélium. En raison des limites des technologies d&#39;imagerie, il a été pratiquement impossible d&#39;observer la manipulation de calcium dans le récipient intact. Le développement de deux systèmes d&#39;imagerie photonique et la création de nouvelles calcium ou pas de colorants d&#39;étiquetage, il est possible de l&#39;image à une profondeur et une résolution suffisantes pour commencer à comprendre la dynamique de calcium et la production de NO dans le système vasculaire. La microscopie à deux photons a récemment été appliquée dans les tissus, les organes et les études sur les animaux entiers, même en raison de sa capacité supérieure pour pénétrer profondément les tissus à faible fluorescence de fond et de la sensibilité du signal haute. 1,2 Le spectre étroit de deux excitation photonique au illumination point focal et l&#39;utilisation de détecteurs non-descanned sont les raisons pour lesquelles les deux microscopie photon est supérieure à la microscopie confocale traditionnelle. La microscopie confocale ne peut pas produire des images de haute qualité à la profondeur de tissu nécessaire en raison de l&#39;auto-fluorescence et la diffusion de la lumière hors-focus dans le sténopé confocal. Par conséquent, nous avons développé une méthode utilisant un microscope à deux photons pour mesurer [Ca 2+] i la signalisation et la production de NO dans les cellules intactes, individuels des vaisseaux sanguins avec une résolution élevée et un faible rapport signal sur bruit.

<table><tbody><tr><td>DAF-FM</td><td>Life Technologies</td><td>D-23842</td><td></td></tr><tr><td>Fluo-4 AM</td><td>Life Technologies</td><td>F14217</td><td>500 & micro ; l dans la solution DMSO</td></tr><tr><td>Pluronic F-68</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5556</td><td></td></tr><tr><td>L-NAME</td><td>Tocris</td><td>0665</td><td></td></tr><tr><td>Olympus microscope droit</td><td>Olympus</td><td>Fluoview FV1000</td><td></td></tr><tr><td>MaiTai HP DeepSee-OL&nbsp ;</td><td>Spectra Physics</td><td></td><td>Ti : laser saphir 690nm &mdash ; 1040nm</td></tr><tr><td>Filtres</td><td>Olympus</td><td>FV10-MRL/R&nbsp ;</td><td>495 à 540 nm&nbsp ;</td></tr><tr><td>25 fois l’objectif à immersion dans l’eau</td><td>Olympus</td><td>XLPL25XWMP</td><td>N.A. 1.05 et la distance de travail 2 mm</td></tr><tr><td>Slice Anchor grid&nbsp ;</td><td>Warner Instrument&nbsp ;</td><td>SHD-27LH</td><td></td></tr><tr><td>Autres réactifs de base&nbsp ;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

deux photons imagerie intracellulaire de ca<sup&gt; 2+</sup&gt; manipulation et production d&#39;oxyde nitrique endothélial et en cellules de muscle lisse d&#39;un rat aorte isolée

Two-photon Imaging of Intracellular Ca2+ Handling and Nitric Oxide Production in Endothelial and Smooth Muscle Cells of an Isolated Rat Aorta

Le calcium est un régulateur important de nombreux processus physiologiques dans les tissus vasculaires. La plupart des fonctions endothéliales et musculaires lisses dépendent fortement des changements de calcium intracellulaire ([Ca 2+] i) et de l&#39;oxyde nitrique (NO). Afin de comprendre comment [Ca 2+] i, NO et des molécules en aval sont traitées par un vaisseau sanguin en réponse à des vasoconstricteurs et vasodilatateurs, nous avons développé une nouvelle technique qui applique calcium-étiquetage (ou NO-étiquetage) colorants comportant deux microscopie photonique à mesurer la manipulation de calcium (ou de la production de NO) dans les vaisseaux sanguins isolés. Décrit ici est une procédure détaillée étape par étape qui montre comment isoler une aorte d&#39;un rat, l&#39;étiquette de calcium ou de NO dans les cellules endothéliales ou musculaires lisses, et l&#39;image transitoires de calcium (ou la production de NO) à l&#39;aide d&#39;un microscope à deux photons suivante physiologique ou des stimuli pharmacologiques. Les avantages de l&#39;utilisation de la méthode sont multiples: 1) il est possible d&#39;simultanély mesurer les transitoires de calcium dans les cellules endothéliales et les cellules des muscles lisses en réponse à différents stimuli; 2) elle permet de cellules endotheliales de l&#39;image et des cellules musculaires lisses dans leur milieu d&#39;origine; 3) cette méthode est très sensible au calcium intracellulaire ou pas de changements et génère des images à haute résolution pour des mesures précises; et 4) approche décrite peut être appliquée à la mesure d&#39;autres molécules, telles que les espèces réactives de l&#39;oxygène. En résumé, l&#39;application de deux microscopie biphotonique d&#39;émission laser pour contrôler les transitoires de calcium et la production de NO dans les endothéliales et musculaires lisses des cellules d&#39;un vaisseau sanguin isolé a fourni des données quantitatives de haute qualité et de la promotion de notre compréhension des mécanismes de régulation de la fonction vasculaire.

Afin d&#39;évaluer avec précision la contribution de calcium à la physiologie vasculaire (vasodilatation et la vasoconstriction), un protocole a été conçu pour charger colorants de calcium dans les cellules endothéliales et les cellules musculaires lisses dans isolé aorte intacte. Le dispositif expérimental général mis en place le montre la figure 1, montre la stratégie de base pour l&#39;isolement et la préparation du navire avant l&#39;imagerie. Brièvement, après isolement de l&#39;aorte de rat, il do...

La fonction des cellules vasculaires dépend de l’activité des messagers intracellulaires. Il s’agit d’une méthode d’imagerie ex vivo à deux photons qui permet de mesurer les niveaux intracellulaires de calcium et d’oxyde nitrique en réponse à des stimuli physiologiques et pharmacologiques dans les cellules endothéliales et musculaires lisses individuelles d’une aorte isolée.

Deux photons imagerie intracellulaire de Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Manipulation et production d&#39;oxyde nitrique endothélial et en cellules de muscle lisse d&#39;un Rat aorte isolée

Calcium is a very important regulator of many physiological processes in vascular tissues. Most endothelial and smooth muscle functions highly depend on ...

L'objectif général de cette procédure est de mesurer le calcium ou l'oxyde nitrique dans un vaisseau fraîchement isolé à l'aide de la microscopie à deux photons. Cela est réalisé tout d'abord par l'isolement mécanique et la préparation du vaisseau. Ensuite, le vaisseau est incubé dans un colorant de marquage du calcium ou dans un colorant de marquage de l'O avec l'acide onique.Ensuite, le vaisseau est fixé sur une boîte recouverte de silicone munie d'une grille et de broches afin d'obtenir une vue stable pendant l'imagerie à deux photons. Enfin, l'imagerie à deux photons est réalisée et les résultats sont quantifiés. Cette vidéo montre l'augmentation de la signalisation calcique intracellulaire dans les cellules endothéliales de vaisseaux sanguins isolés en réponse à des variations de la concentration calcique extracellulaire.En fin de compte, cette méthode permettra aux chercheurs de surveiller les variations du calcium ou de l'oxyde nitrique dans les cellules endothéliales ou les cellules musculaires lisses d'un vaisseau sanguin fraîchement isolé. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes réside dans sa capacité à offrir une meilleure résolution du signal et des mesures précises des processus intracellulaires dans les tissus vasculaires. Ici, cette technologie a été appliquée en combinaison avec des dés classiques, non géométriques, afin de mesurer les transitoires calciques et la production d'oxyde nitrique dans des cellules individuelles d'une oreille-de-mer isolée creuse.Nous pensons que cette technique contribuera à faire progresser nos connaissances sur les mécanismes régulant les niveaux intracellulaires de calcium et d'espèces oxygénées réactives au sein des différents types cellulaires vasculaires. L'imagerie par microscopie à excitation biphotonique de cellules vivantes, en particulier dans des tissus intacts tels que les vaisseaux sanguins, offre l'avantage d'un signal haute résolution et d'une faible fluorescence de fond hors foyer. La localisation étroite de l'excitation biphotonique illumine un seul volume focal dans le tissu, réduit fortement l'absorption hors foyer et diminue la diffusion de la lumière, ce qui nous permet d'observer la dynamique des fluorures dans des tissus fortement autofluorescents contenant des fibres de collagène et d'élastine.Après avoir isolé une aorte de rat conformément au protocole décrit, sous un microscope stéréoscopique, utilisez une pince fine et des ciseaux microchirurgicaux pour disséquer les tissus adipeux et conjonctifs entourant l'aorte. Une fois l'aorte nettoyée, sectionnez l'organe longitudinalement et transférez-le dans une solution saline physiologique en vue d'une utilisation ultérieure. Pour préparer le mélange de chargement, ajoutez sept microlitres d'une solution prête à l'emploi contenant un millimolaire de fluo-4 AM dissous dans du DMSO à 450 microlitres de solution saline physiologique sans calcium.Ensuite, ajoutez 40 microlitres de solution d'acide 10 % non à base de DMSO au mélange de chargement pour aider à disperser les esters acétiques de méthyle et améliorer le chargement du colorant calcique. Placez les aortes disséquées dans des tubes de 500 microlitres contenant le mélange de chargement. Couvrez les tubes avec du papier d'aluminium et placez-les sur un agitateur rotatif à température ambiante pendant une heure.Après avoir suivi le protocole écrit pour fixer le tissu aortique à la surface d'une boîte recouverte de silicone, placez la boîte sous l'objectif d'un microscope à deux photons droit et installez et positionnez un objectif à immersion dans l'eau de 25 x au-dessus de l'échantillon ; installez ensuite un filtre d'émission correspondant dans le port du microscope. À l'aide du logiciel, activez le laser infrarouge à deux photons et réglez l'excitation laser à 820 nanomètres en lumière transmise. À l'aide du réglage grossier de l'objectif, localisez l'aorte et focalisez l'objectif sur la surface endothéliale.Passer le microscope en mode de balayage laser à deux photons, en veillant à ce que le laser d'excitation soit verrouillé en mode. Les détecteurs non DS balayés sont activés avec environ 5 à 10 % de la puissance du laser. Commencer le balayage en direct.Et enfin, régler l'objectif afin de mettre au point les cellules endothéliales ou musculaires lisses. Acquérir des images en séquence conformément au protocole expérimental indiqué. Enregistrer les images dans un format incluant les métadonnées afin d'effectuer le traitement d'images et les calculs. Télécharger et installer le logiciel de traitement d'images Fiji, publié sous licence publique générale.À l'aide du logiciel, ouvrez un fichier image. Ensuite, lorsque vous y êtes invité, séparez les canaux de lumière transmise et de fluorescence afin d'utiliser uniquement les canaux fluorescents pour l'analyse des données dans le programme Fiji. Cliquez sur l'onglet Analyser et faites défiler vers l'option Outils.Ensuite, cliquez sur l'onglet Gestionnaire de ROI, et une nouvelle fenêtre apparaîtra. Ensuite, sous l'onglet Analyser, cliquez sur « Définir les mesures » et sélectionnez les mesures spécifiques d'intérêt. Pour les mesures des transitoires calciques.Utilisez l'option de valeur moyenne de gris. Ensuite, avec l'outil de tracé circulaire, commencez à délimiter les régions d'intérêt et, dans le gestionnaire de ROI, cliquez sur « ajouter » pour chaque ROI sélectioné. Une fois que toutes les cellules d'intérêt ont été tracées, allez dans l'onglet « plus » du gestionnaire de ROI et sélectionnez « mesures multiples ».Enfin, enregistrez directement les mesures ou copiez-les et collez-les dans un tableur, puis effectuez les calculs conformément au protocole décrit dans le texte. Grâce au protocole décrit dans cette vidéo, les cellules endothéliales de l'aorte sont faciles à localiser en raison de leur forme et de leur signal fluorescent intense. Les cellules musculaires lisses seront également visibles dans le même champ que les cellules endothéliales, ce qui permettra de mieux comprendre comment ces deux types cellulaires réagissent conjointement mais indépendamment à divers agonistes et stimuli, démontrant ainsi l'utilité de cette méthode.Des mesures de la réponse à l'acétylcholine ou à un agoniste cholinergique (CHA) provoquant une vasodilatation dépendante du calcium et de l'endothélium ont été déterminées comme indiqué ici, après l'ajout d'un CH, une augmentation de la fluorescence des cellules endothéliales par rapport aux cellules dans le PSS seul, indiquant une augmentation rapide du calcium intracellulaire qui revient lentement à la ligne de base. Ce protocole est également adapté à la détection de la production de monoxyde d'azote endothélial. Dans cette expérience, les cellules endothéliales aortiques ont été chargées avec l'acétate de DAF FM D.La production de DYE ENO augmentait de manière dépendante du calcium en réponse à une stimulation par CH, et cette réponse était bloquée par l'inhibiteur de la synthase OCH endothéliale L name. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la physiologie cardiovasculaire. L'utilisation de la procédure expérimentale décrite ici, conjointement avec plusieurs modèles animaux génétiquement modifiés disponibles, offre de nouvelles perspectives pour l'application de la microscopie à deux photons en recherche fondamentale et translationnelle.L'utilisation de cette approche pourrait vous fournir une compréhension approfondie et des connaissances mécanistiques détaillées sur des voies de signalisation intracellulaires spécifiques au sein des cellules des vaisseaux sanguins. Après avoir visionné cette vidéo, vous saurez comment appliquer cette technique pour le suivi en temps réel des niveaux de calcium et d'oxyde nitrique dans des cellules individuelles de vaisseaux sanguins fraîchement isolés.

two-photon-imaging-intracellular-ca2-handling-nitric-oxide-production

Research

Recherche

JoVE Journal

Biology

Biologie

Détails des méthodes à haute résolution...

Ca focale 2 + Détection de transitoires dans le muscle lisse

Voici une nouvelle région d'intérêt protocole d'analyse basée sur le tri des ellipses meilleur ajustement attribués aux régions de signal positif dans le temps à deux dimensions image laps séquences est démontrée. Cet algorithme peut permettre aux enquêteurs d'analyser de manière approfondie les signaux physiologiques + Ca 2 avec entrée minimale de l'utilisateur et de partialité.

Analyse automatisée de dynamique Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; Signaux de séquences d&#39;images

Dans cet article , nous décrivons une méthode relativement facile adaptée en utilisant le colorant fluorescent diaminofluorescéine-2 diacétate (DAF-2DA) et dihydroethidium (DHE) pour en face à la détection simultanée et la visualisation de l' oxyde nitrique intracellulaire (NO) et l' anion superoxyde (O 2 .- ) respectivement, fraîchement isolés aortes intactes d'un modèle d'obésité de la souris.

En détection de visage de l&#39;oxyde nitrique et de superoxyde dans la couche endothéliale des artères intactes

Actuellement, la plupart des indicateurs calciques disponibles sont utilisés pour quantifier les transitoires calciques cytoplasmiques en tant que mesures indirectes du calcium libéré par le réticulum sarcoplasmique dans les cellules musculaires lisses en culture. Ce protocole décrit l’utilisation d’un indicateur spécifique basé sur le FRET qui permet de mesurer directement les signaux calciques dans la lumière du réticulum sarcoplasmique.

Imagerie confocale à base de FRET mesure des fluctuations de calcium à l&#39;intérieur du réticulum sarcoplasmique de Cultured cellules musculaires lisses Utilisation

Cellules endothéliales primaires de la veine ombilicale humaine (HUVECs) ont été cultivées jusqu’à la confluence au sein d’un dispositif de réseau microfluidique. La jonction cellulaire endothéliale et les distributions de l’actine F ont été illustrées et les changements dans la concentration intracellulaire de calcium et la production d’oxyde nitrique en réponse à l’adénosine triphosphate (ATP) ont été quantifiés en temps réel au niveau cellulaire individuel.

Développement et caractérisation de<em&gt; In vitro</em&gt; Microvaisseaux réseau et des mesures quantitatives de l&#39;endothélium [Ca<sup&gt; 2+</sup&gt;]<sub&gt; i</sub&gt; Et production d&#39;oxyde nitrique

La calcification vasculaire est un prédicteur important et un contributeur aux maladies cardiovasculaires humaines. Ce protocole décrit des méthodes pour induire la calcification de cellules musculaires lisses vasculaires primaires en culture et pour quantifier la calcification et la charge macrophage dans les aortes animales à l’aide de l’imagerie par fluorescence proche infrarouge.

Calcification vasculaire des cellules musculaires lisses et imagerie de Aortic calcification et Inflammation

Ce manuscrit décrit les protocoles de microscopie vidéo in vitro pour l’évaluation de la fonction vasculaire dans les artères de résistance cérébral de rat. Le manuscrit décrit également les techniques pour l’évaluation des microvaisseaux densité avec la perfusion lectine et tissu fluorescent étiquetée à l’aide de débitmétrie Doppler Laser.

Évaluation des mécanismes de contrôle vasculaire utilisant la microscopie vidéo des artères de résistance isolée de Rats

Ce manuscrit décrit un protocole simple pour l’isolement des artérioles de la rétine de rat qui peut être utilisé dans, calcium imagerie et pression myographie des études électrophysiologiques.

Isolement des artérioles rétiniennes Ex Vivo études de physiologie cellulaire

Montré ici sont des protocoles d’isolement (1) fraîchement endothélium cérébrales intacts « tubes » et des mesures (2) simultanées de calcium endothéliale et potentiel durant l’Hyperpolarisation dérivé de l’endothélium de membrane. En outre, ces méthodes permettent d’avoir écouté pharmacologique du calcium des cellules endothéliales et signalisation électrique comme variables expérimentales individuels ou interactives.

Mesure simultanée de Calcium intracellulaire et le potentiel de Membrane dans l’endothélium cérébral de souris fraîchement isolées et intacte

Présenté ici est un protocole pour étudier la microcirculation coronaire dans le tissu cardiaque murin vivant par la surveillance ex vivo de la pression artérielle de perfusion et le flux qui maintient la pression, ainsi que les composants vasculaires de l’arbre, y compris les lits capillaires et péricytes, que l’artère septale est cannulée et pressurisée.

Mesure dynamique et imagerie des capillaires, artérioles et péricytes dans le cœur de souris

Découvrez l'imagerie biphotonique pour mesurer le calcium et l'oxyde nitrique intracellulaires dans les cellules endothéliales et musculaires lisses d'aorte de rat isolée. Cette méthode offre une résolution élevée pour étudier la signalisation vasculaire.

Deux photons imagerie intracellulaire de Ca 2+ Manipulation et production doxyde nitrique endothélial et en cellules de muscle lisse dun Rat aorte isolée (Vidéo) | JoVE Journal

Deux photons imagerie intracellulaire de Ca

Explorer plus de vidéos