Etudier le cancer du pancréas Stem Cell Caractéristiques pour le développement de nouvelles stratégies de traitement

L’objectif global de la procédure suivante est d’étendre les cellules souches cancéreuses in vitro à l’aide d’une technique de culture indépendante d’Anchorage, puis de tester les effets métaboliques de nouvelles thérapies ciblant les cellules souches cancéreuses. Ceci est accompli en dissociant d’abord un échantillon de tissu d’adénocarcinome pancréatique humain en une suspension unicellulaire. Dans la deuxième étape, le tissu tumoral est digéré à l’aide d’enzymes, puis ensemencé sur une plaque de gélatine Pour éliminer la population de cellules fibroblastiques, les cellules cancéreuses isolées sont ensuite ensemencées dans une plaque multi-puits à très faible attache, et traitées avec le médicament d’intérêt pour évaluer l’activité métabolique et la formation des sphères tumorales.

En fin de compte, le médicament d’intérêt peut être utilisé chez des souris immunodéprimées portant des xénogreffes dérivées de patients pour valider les effets du médicament in vivo. Cette méthode est un outil puissant pour étudier la biologie des cellules souches cancéreuses et constitue une première étape pour le développement de nouvelles thérapies ciblant les cellules souches cancéreuses. La démonstration de la procédure sera faite par moi-même, chercheur junior au Centre sur les cellules souches dans le cancer et le vieillissement de l’Institut du cancer du sein et Tini Cruz, doctorant de mon laboratoire, pour isoler les cellules souches cancéreuses d’un adénocarcinome canalaire pancréatique dans une enceinte de biosécurité stérile.

À l’aide d’un scalpel stérile et d’une pince, hachez la tumeur humaine dans une boîte de culture de 60 x 15 millimètres contenant un millilitre de PBS stérile, en ajoutant trois à quatre millilitres supplémentaires de PBS si nécessaire jusqu’à ce que le tissu soit complètement dissocié. Transférez la suspension tissulaire dans un tube conique stérile et ajoutez du PBS à un volume final de cinq millilitres. Ensuite, homogénéisez mécaniquement l’échantillon à l’aide d’une centrifugeuse à dissociation et digérez le tissu homogénéisé avec de la collagénase à 37 degrés Celsius.

Après une heure de centrifugeuse, les cellules se réhydratent, suspendant la pastille dans 10 millilitres de milieu complet. Filtrez la suspension cellulaire à travers une crépine de 40 micromètres et faites tourner à nouveau les cellules. Cette fois, en suspendant la pastille dans cinq millilitres d’un CK Après cinq minutes à température ambiante, retirez le tampon de lyse des globules rouges par centrifugation et remettez la pastille en suspension dans un milieu de cellules souches cancéreuses.

Ensuite, incubez les cellules sur une boîte enrobée de gélatine à 37 degrés Celsius pour éliminer la plupart des cellules fibroblastiques qui se fixent rapidement. Après une heure, récupérez le surnageant et quantifiez le nombre de cellules cancéreuses du pancréas viables pour faciliter la formation de la sphère tumorale pour le cancer. L’enrichissement en cellules souches dilue les cellules dans le volume approprié de milieu de cellules souches cancéreuses jusqu’à une concentration finale de deux fois 10 à trois cellules par millilitre, et les refroidit sur de la glace pendant quelques minutes.

Ensuite, après avoir ajouté 500 microlitres de PBS aux première et dernière rangées d’une plaque de cellules à très faible attache, remettez les cellules en suspension à l’aide d’une pipette et ensemencez un millilitre de cellules par puits dans les puits vides de la plaque. Traitez quatre puits de cellules avec le médicament d’intérêt et au moins quatre puits de contrôle négatif avec véhicule. Ensuite, incubez les cellules à 37 degrés Celsius avec 5 % de dioxyde de carbone pendant une semaine.

Tous les deux jours, ajoutez un nouveau traitement à notre véhicule à chacun des puits. Le cinquième ou le septième jour, évaluez le nombre de sphères tumorales formées à l’aide d’un compteur de cellules automatisé qui permet d’identifier des structures plus grandes pour l’emballage en série des sphères tumorales. Le septième jour, utilisez une passoire à cellules de 40 micromètres pour récolter les sphères.

Ensuite, faites tourner les sphères et incubez-les dans un millilitre de trypsine pendant 20 minutes à 37 degrés Celsius pour dissocier la pastille en une suspension unicellulaire. Ensuite, développez les cellules pendant sept jours supplémentaires, comme nous venons de le démontrer, pour préparer les sphères à mesurer leur espèce réactive de l’oxygène ou la production de ROS après dissociation, comme nous venons de le démontrer, faites tourner les sphères vers le bas et remettez la pastille en suspension dans HBSS contenant la sonde appropriée. Après une incubation de 20 minutes dans l’obscurité à 37 degrés Celsius, placez les cellules sur de la glace jusqu’à l’analyse par cytométrie en flux pour préparer les sphères à la mesure de leur consommation d’oxygène.

Enduire d’abord une plaque de culture cellulaire à 96 puits d’adhésif pour cellules et tissus pendant au moins 20 minutes à température ambiante. Ensuite, dissociez les sphères et la trypsine comme démontré. Ensuite, lavez la plaque deux à trois fois avec de l’eau pour enlever l’excès de plaque adhésive, les cellules singulières à trois fois 10 à la cinquième cellules par puits.

Dans 150 microlitres de milieu de dosage de la consommation d’oxygène contenant du glucose et du pyruvate de sodium, collez les cellules au fond des puits par centrifugation jusqu’à ce que 100 fois G ait été atteint. Laisser la centrifugeuse s’arrêter avec la pause. Ensuite, inversez l’orientation de la plaque et répétez l’essorage.

Maintenant, incubez les cellules pendant 30 minutes à 37 degrés Celsius sans dioxyde de carbone. Pendant ce temps, chargez les importations de cartouches de test. A, B et C.Injectez respectivement 25 microlitres d’une concentration de trois, six et neuf millimolaires du médicament d’intérêt, et importez D à 25 microlitres d’une concentration micromolaire d’une concentration micromolaire de l’inhibiteur mitochondrial.

Lorsque les cellules sont prêtes, calibrez la cartouche et chargez la plaque de culture cellulaire. Enfin, exécutez le test avec le protocole standard de mélange et de mesure Dans ces expériences représentatives, le traitement des cellules souches du cancer du pancréas avec de la metformine a fortement diminué la taille et le nombre des sphères tumorales. De plus, ces réductions ont été observées par les cultures des sphères secondaires et tertiaires.

Même lorsque seule la culture de la sphère primaire avait été traitée avec de la metformine, la metformine agirait comme un inhibiteur mitochondrial. En effet, dans cette expérience, il a été observé que le médicament induisait une diminution rapide et dose-dépendante de la consommation d’oxygène dans les cellules tumorales, en corrélation avec sa capacité à induire la production de ROS. Il est important de noter que les souris traitées à la metformine présentent une réduction à court terme mais significative de la progression de l’adénocarcinome pancréatique par rapport aux animaux témoins.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de dissocier les tumeurs humaines fraîches. Isolez des cellules cancéreuses primaires, mettez-les en culture de formation de sphères et évaluez l’activité métabolique des cellules souches du cancer du pancréas.