Name: Etudier le cancer du pancréas Stem Cell Caractéristiques pour le développement de nouvelles stratégies de traitement (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-06-20T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 29 s
Description: Découvrez la culture sans ancrage pour étudier les cellules souches cancéreuses du pancréas et évaluer les effets métaboliques de nouvelles thérapies ciblées. Cette méthode permet de développer des stratégies de traitement innovantes.

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La présente recherche a été soutenue par un ERC Advanced Investigator Grant (Pa-CSC 233 460), septième programme-cadre de la Communauté européenne (FP7 / 2007-2013) en vertu de convention de subvention n ° 256974 (EPC-TM-NET) et n ° 602783 (CAM-Pac ), la Sous-Direction générale de Evaluación y Fomento de la Investigación, Fondo de Investigación Sanitaria (PS09 / 02129 &amp; PI12 / 02643), et le Programa Nacional de internacionalización de la I + D, Subprogramma: FCCI 2009 (PLE2009-0105; Ministerio de Economía y Competitividad, Espagne). E. Lonardo a été soutenu par Roche Fellowship. M. Cioffi a été soutenu par le Programme de bourses Predoctoral La Caixa.

PDAC tumeurs humaines ont été obtenus avec le consentement éclairé écrit (Comunidad de Madrid, Espagne (CP CNIO-CTC-11 -. CI 11/103-E) Implantation des tumeurs pancréatiques humaines dans des souris immunodéficientes nécessite l&#39;approbation du comité d&#39;examen institutionnel ainsi que institutionnelle . Animal Care et l&#39;utilisation Comité (IACUC) Les procédures de modèles de souris de tumeurs pancréatiques xénogreffes doivent être menées en conformité avec les réglementations nationales et institutionnelles (ici comité d&#39;éthique de l&#39;Instituto de Salud Carlos III; Madrid, Espagne; Protocole PA 34_2012). 1. Culture Media <ol><li> Préparer milieu complet. <ol><li> Supplément milieu RPMI avec 10% de FBS, 100 unités / ml de pénicilline / streptomycine. Pour 500 ml de RPMI ajouter 55 ml de FBS inactivé à la chaleur et 6 ml de pénicilline / streptomycine (10 000 U / ml, 100X). </li><li> Conserver le milieu complet à 4 ° C. </li></ol></li><li> Préparer CSC moyenne. <ol><li> Compléter le DMEM / F12 mediu sans sérumm avec 100 unités / ml de pénicilline / streptomycine et glutamine 2 mM. </li><li> Conserver le milieu SCC à 4 ° C. B27 (01:50) et 20 ng / ml de bFGF sont fraîchement ajoutés au milieu avant chaque expérience. REMARQUE: L&#39;ajout de B27 a été montré pour augmenter la formation de la sphère de la tumeur et de soutenir plusieurs passages de cultures de la sphère 32. La composition du milieu est une étape cruciale et doit être testé pour chaque type cellulaire dans la culture. Nous recommandons de tester l&#39;auto-renouvellement et la capacité de différenciation de sphères et analysons l&#39;expression des marqueurs du SCC par cytométrie de flux (c.-à-CD133 + et CD44 +). </li></ol></li><li> Préparer extracellulaire Flux milieu de dosage. <ol><li> Ce milieu spécifique est DMEM basale 5030 contenant des vitamines, acides aminés et autres suppléments, mais manquant de glutamine, le glucose, pyruvate et de bicarbonate. </li><li> Pour l&#39;essai en cours, compléter le milieu avec de la glutamine 2 mM, 8 mM de glucose et du pyruvate de sodium à 2 mM à une activité métabolique mitochondrial complet. NOTE: L&#39;absence de bicarbonate de sodium est essentielle afin de mesurer avec précision l&#39;acidification extracellulaire des cellules en croissance dans la culture, puisque milieu contenant du bicarbonate régulière en mémoire tampon des variations de pH pendant l&#39;essai. En outre, l&#39;utilisation d&#39;un milieu de base permet un contrôle serré de la concentration de L-glutamine (comme la L-alanyl-glutamine) de glucose, pyruvate de sodium ou nécessaire pour des conditions différentes et / ou des applications analytiques. </li></ol></li></ol> 2. Sphère essai de formation et de l&#39;analyse REMARQUE: Tous les protocoles de culture de tissus et de manipulations doivent être effectuées en utilisant des techniques stériles avec une grande attention à l&#39;aide propre, sans détergent, verrerie stérile. Avant utilisation, pré-chaud tout moyen et solution dans un bain-marie à 37 ° C (comme alternative, vous pouvez utiliser des solutions préchauffé à la température ambiante moyenne et). Obtenir tumeurs PDAC humain comme détaillé précédemment 21. <ol><li> Isolation des CSC de PDAC humain (Figure1) <ol><li> Dans une enceinte de biosécurité stérile transférer le tissu PDAC humaine à une boîte de 60 mm x 15 de culture contenant 1 ml de 1X tampon phosphate salin stérile (PBS). Émincer la tumeur en petits morceaux (1 - 5 mm) à l&#39;aide d&#39;un scalpel et pince stérile. </li><li> Ajouter 1 ml de solution stérile PBS 1X à la boîte de culture et répétez l&#39;étape de trituration jusqu&#39;à ce que le tissu est complètement dissocié, régulièrement cela nécessite 3-4 tours. Transférer la suspension de tissu (en haut jusqu&#39;à un volume final de 5 ml avec PBS 1X) dans un tube stérile et homogénéiser mécaniquement avec un dissociateur comme gentleMACS. </li><li> Incuber le tissu homogénéisé avec de la collagénase (en utilisant 2,5 mg / ml de collagénase dans 1X PBS) pendant 60 min à 37 ° C puis centrifuger pendant 5 min à 900 x g. Décanter le surnageant et remettre en suspension les culots cellulaires dans 10 ml de milieu complet. On filtre la suspension de cellules à travers un tamis de 40 um et centrifuger pendant 5 min à 900 x g. </li><li> Décanter le surnageant et remettre laun culot avec 5 ml de tampon de lyse de globules rouges (chlorure d&#39;ammonium-potassium, ACK), et incuber le </li><li> Reprendre le culot dans un milieu CSC, plaque sur un plat revêtu de gélatine, et incuber à 37 ° C pendant 1 h. Cette étape permettra d&#39;éliminer la plupart des cellules de fibroblastes qui se fixent rapidement sur la plaque. </li><li> Retirer la plaque de l&#39;incubateur et récupérer soigneusement suspension de cellules et de quantifier le nombre de cellules viables (trypan bleu-négatives) à l&#39;aide d&#39;un hémocytomètre. Pour ce faire, mélanger doucement la suspension et la pipette 20 ul de la suspension dans un tube Eppendorf. Ajouter 20 pi (1: 1 ratio) de bleu trypan pour les cellules dans le tube à centrifuger et bien mélanger. Introduire à la pipette environ 10 ul du mélange sur la hémocytomètre. </li><li> Comptez toutes les cellules claires parmi les quatre quadrants de coin de la chambre de comptage pour le comptage des cellules viables. Note: La viabilité et le rendement des cellules peuvent varier considérablement entre les échantillons de tumeurs. Pour PDAC échantillons viabilité varie régulièrement between 45 à 70%, et de morceaux de tissu à partir d&#39;un échantillon de la tumeur macroscopique d&#39;un diamètre de 3-5 mm doivent céder à environ 5x10 6 cellules viables. </li></ol></li><li> Formation Sphère dosage et de traitement de metformine <ol><li> Prenez le nombre requis de cellules et ajouter le volume approprié de milieu CSC de préparer une concentration cellulaire de 2000 cellules / ml. Ne gardez pas la suspension de cellules sur la glace pendant plus d&#39;1h et bien mélangés avant le placage. </li><li> Ajouter 500 pi de PBS 1X à la première et la dernière rangée d&#39;une plaque de 24 puits pour l&#39;humidification afin d&#39;aider à minimiser l&#39;évaporation moyenne. Ensemencer les cellules dans des cellules de fixation ultra-basses des plaques à une densité de 2000 cellules par puits dans 1 ml de milieu de sphère de la tumeur (2000 cellules / ml). REMARQUE: Le nombre de cellules utilisées pour la sphère de la tumeur dosages de formation peut varier entre les types de tumeurs. </li><li> Traiter au moins quatre puits avec le véhicule (témoin négatif) et quatre puits avec chaque traitement alloué, par exemple., 3 mM de metformine. Place les cellules dans un incubateur réglé à 37 ° C et de fournir les cellules avec 5% de CO 2 pendant une semaine. NOTE: Le support ne doit pas être modifié afin de permettre la formation de sphères non perturbé de la tumeur, mais peut être complété avec des facteurs de croissance sur une base quotidienne, comme ils ne sont pas stables dans un milieu de culture. </li><li> Ajouter tous les deux jours de traitement, par ex., 3 mM de metformine ou d&#39;un véhicule à chacun des puits. Évaluer le nombre de sphères de tumeurs formées après 5 et / ou 7 jours par l&#39;utilisation d&#39;un compteur de cellules automatisé qui permet de compter des structures plus grandes (figure 2). NOTE: Seuls les sphères tumorales avec au moins 40 um doit être envisagée et peut être classé comme faible (40 - 80 um) ou grande (80 - 120 um), respectivement. Les résultats peuvent être illustrées comme le pourcentage de sphères de tumeur divisée par le nombre initial de cellules ensemencées (par exemple, 2.000 cellules). </li></ol></li><li> Le passage en série de sphères de tumeurs de première génération <ol&gt; <li> Après 7 jours d&#39;incubation récolter les sphères tumorales en utilisant un tamis cellulaire de 40 pm et les centrifuger pendant 5 min à 900 x g à température ambiante. </li><li> Dissocier le culot de sphères de tumeurs à cellules uniques en utilisant la trypsine, puis développez le nouveau cellules unicellulaires suspension obtenue pendant sept jours, comme décrit ci-dessus (voir 2.2). </li></ol></li></ol> 3. Analyse du métabolisme (ROS Production et consommation d&#39;oxygène) <ol><li> ROS production <ol><li> Dans ce protocole, nous avons utilisé carboxy-DCFDA comme un exemple de mesurer la production de ROS, car il est une sonde abordable, rapide et largement utilisé pour la détection ROS. Cependant, il existe plusieurs autres sondes et des méthodes qui peuvent être utilisées pour cet essai. </li><li> Traiter sphères tumorales avec la metformine comme décrit dans 2.2 pour le montant alloué de temps. A la fin du traitement, les sphères récolte tumorales en utilisant un tamis cellulaire de 40 pm, centrifuger les cellules à 900 xg pendant 5 min et remettre en suspension le culot dans 1 ml de trypsen. Incuber pendant 20 min à 37 ° C. </li><li> Une fois que les cellules sont singularisés, centrifuger à 900 xg et remettre en suspension les cellules dans HBSS contenant 2,5 uM carboxy-DCFDA. Incuber les cellules pendant 20 min à 37 ° C dans l&#39;obscurité. </li><li> Avant de cytométrie en flux analyse protéger cellules colorées de la lumière comme carboxy-DCFDA peut être photo-oxydé donner des résultats faussement positifs. Placer les tubes sur de la glace jusqu&#39;à l&#39;analyse. REMARQUE: carboxy-DCFDA est fluorescent après réaction avec une variété d&#39;espèces réactives de l&#39;oxygène et de l&#39;azote, étant détectée en FL1 (ex 488 nm, em 520 nm..). </li></ol></li><li> Consommation d&#39;oxygène Mesure <ol><li> Pour ce protocole, nous allons utiliser le système extracellulaire Flux Analyseur de Seahorse Biosciences, à titre d&#39;exemple. Manteau de la plaque de culture cellulaire désirée avec une solution de 22,4 ug / ml de cellules et de tissu adhésif pendant 20 minutes à température ambiante. Rincer les puits avec de l&#39;eau 2 - 3 fois avant l&#39;ensemencement des cellules. </li><li> A la fin du traitement, les sphères récolte tumorales en utilisant un 40 um tamis cellulaire, centrifuger les cellules à 900 xg pendant 5 min et remettre en suspension le culot dans 1 ml de trypsine. Incuber pendant 20 min à 37 ° C. </li><li> Plaque de cellules dans la plaque de culture cellulaire singularisée à une densité de 30 000 cellules / puits pour une plaque à 96 puits (volume final: 150 ßl). Resuspendre les cellules dans un milieu de dosage de la consommation d&#39;oxygène contenant du glucose et 8 mM de pyruvate de sodium à 2 mM. </li><li> Centrifuger les cellules au fond du puits par une centrifugation des puits jusqu&#39;à 100 XG a été atteint, puis de laisser l&#39;arrêt de la centrifugeuse avec frein off. Inverser l&#39;orientation de la plaque et répéter le processus. Transférer la plaque à un incubateur à 37 ° C sans addition de CO 2 pendant 30 min. </li><li> Entre-temps, préparer la cartouche pour le dosage. Chacun a bien 4 injecteurs différents à charge (25 pl / port): <ol><li> Port A: la metformine. Pour obtenir une concentration finale de 3 mM dans le puits, préparer une solution 8x (24 mM) en tant que volume final sera 175ul après l&#39;injection de l&#39;orifice A. </li><li> Port B: la metformine. Pour ajouter 3 mM et obtenir une concentration finale de 6 mM dans le puits, préparer une solution 9x (27 mM) en tant que volume final de 200 pi sera après l&#39;injection de l&#39;orifice B. </li><li> Port C: la metformine. Pour ajouter 3 mM et obtenir une concentration finale de 9 mM dans le puits, préparer une solution 10x (30 mM) en tant que volume final de 225 pi sera après l&#39;injection de l&#39;orifice C. </li><li> Port D: roténone 11 pM, 1 pM d&#39;obtenir que la concentration finale dans le puits (11x). Remarque: roténone inhibe complètement l&#39;activité mitochondriale résiduel quelconque. </li></ol></li><li> Calibrer la cartouche et charger la plaque de culture cellulaire. Effectuez le test avec le protocole standard de mélange et de mesure. </li><li> Calculer le pourcentage d&#39;inhibition de la respiration mitochondriale total réalisé par la metformine comme le pourcentage d&#39;inhibition obtenu avec la roténone (défini comme 100%). </li></ol></li></ol> 4.Modèle de xénogreffe de cancer du pancréas humain chez la souris immunodéprimée Remarque: L&#39;ordre des nombres suffisants de modèles féminins athymiques nues ou d&#39;autres, plus immunodéprimés tels que souris NOD-SCID, SCID-beige, ou NSG pour les expériences 33. Autoclave tous les instruments chirurgicaux avant l&#39;expérience et leur permettre de refroidir à température ambiante avant utilisation. Pour les tumeurs sous-cutanées, nous avons utilisé un minimum de 4 souris par état avec une tumeur par le flanc pour un total de 8 tumeurs. <ol><li> Xénogreffe Transplantation <ol><li> Préparer morceaux de tumeur à partir d&#39;échantillons de tissus cancéreux pancréatiques humaines. Transférer la tumeur dans une boîte de Pétri et disséquer le tissu en petits morceaux (2 mm de diamètre, 8 ~ 3 mm) en utilisant un scalpel et des pinces pour maintenir le tissu. Tremper les morceaux obtenus en gélatineuse solution de mélange de protéines maintenu sur de la glace. </li><li> Anesthésier la souris en utilisant de 1 - 3% isofluorane ou d&#39;autres anesthésiques par inhalation ou injectables. NOTE: Avant de commencer toute proc chirurgicaleedure, veiller à ce que les souris ont complètement perdu connaissance en stimulant la peau de l&#39;abdomen ou mèches avec une paire de pince à échardes. Appliquer une pommade oculaire pour prévenir la sécheresse. </li><li> Une fois l&#39;anesthésie a pris effet, essuyer le dos de la souris avec la peau contenant de l&#39;éthanol antiseptique. Administrer la buprénorphine (0,05 mg / kg de poids corporel) avant la chirurgie pour assurer l&#39;analgésie post-opératoire. </li><li> Soulevez la peau du dos avec une pince, faire un 0,7 à 1,0 cm de long incision avec micro ciseaux stériles et préparer ensuite carrément une petite poche sous-cutanée, dans laquelle un morceau de tissu de cancer du pancréas patient dérivée est insérée (~ 8 mm 3). </li><li> Fermer la plaie en utilisant 1 - 2 agrafes de la peau. Retirez-les après 7 jours. Retourner les souris dans leurs cages et les garder sur un coussin chauffant ou sous une lampe chauffante jusqu&#39;à ce qu&#39;ils soient à nouveau pleinement actif. </li><li> Après l&#39;implantation de la tumeur, les souris surveiller au moins deux fois par semaine pour la croissance tumorale et les signes généraux de morbidité résultant comme fourrure froissée, hunched posture, et l&#39;immobilité. </li><li> Une fois que les tumeurs ont atteint une taille moyenne de 200 mm3, les souris sont randomisées à des traitements respectifs. Administrer véhicule ou la metformine quotidiennement par des injections ip (150 mg / kg pc) ou par l&#39;intermédiaire de l&#39;eau potable (150 mg / kg de poids corporel) avec des effets de traitement comparables. </li><li> Surveiller la charge tumorale en utilisant un pied à coulisse et calculer le volume de la tumeur une fois par semaine (mesure du volume de la tumeur = 1/2 longueur x largeur x souffle). </li><li> Sacrifiez les souris une fois les tumeurs ont atteint 1 cm de diamètre ou souris commencent à montrer des signes de douleur ou une maladie grave comme indiqué ci-dessus. </li></ol></li></ol>

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</ol>

Les auteurs ont aucun intérêt à divulguer concurrence.

Avec l&#39;émergence et la validation ultérieure du concept SCC pour de nombreuses tumeurs, le domaine du développement de médicaments a pris un nouvel élan, avec le potentiel de développement de traitements contre le cancer plus efficaces et par la suite réduire le risque de rechute de la maladie. Cependant, le champ SCC est encore à un stade précoce et plus doit être accompli en termes de compréhension origine et la propagation du SCC, et leur rôle dans l&#39;élaboration de l&#39;architecture de la tumeur et la promotion de la métastase. Dans ce contexte, l&#39;utilisation de tests SCC reproductibles et significatifs ainsi que l&#39;interprétation éclairée des données obtenues représentent un élément crucial pour faire avancer notre compréhension de la biologie du SCC. De nombreux points de vue biologique, la formation de la sphère a émergé comme un dosage extrêmement précieux; néanmoins les utilisateurs devraient être conscients de ses limites afin d&#39;interpréter correctement les résultats expérimentaux. Un aspect important à considérer avant même l&#39;évaluation de la sphère formation de données est à l&#39;origine de l&#39;échantillon étudié, étant donné que les résultats obtenus à partir des échantillons frais de patients dérivés pourraient être significativement différents de ceux obtenus à partir de lignées de cellules cancéreuses établies. Classiques des dosages de formation de sphères consistent à ensemencer des cellules à densité clonale dans des plaques ultra-fixation et l&#39;évaluation de la formation de sphère en présence de facteur de croissance épidermique (EGF) et / ou le facteur de croissance des fibroblastes (b-FGF) enrichi, mais un milieu sans sérum 21, 34. La composition du milieu de culture est aussi un problème important à considérer. Dans notre expérience, nous avons constaté que le milieu DMEM / F12 additionné de B27, le bFGF et la glutamine en l&#39;absence de sérum est un milieu optimal de croître, étendre et maintenir la SCC dans des conditions non différenciées. Nous avons constaté que dans cet état de culture (milieu et de la suspension) les cellules expriment des quantités élevées de marqueurs de cellules souches du cancer (y compris CD133 +, CD44 + et CD24 +) et ne reflètent pas les protéines de différenciation associé (CK-20 Et CK-19). L&#39;une des hypothèses fondamentales de ces essais est que chaque sphère est clonal, à savoir, une sphère résulte de l&#39;expansion d&#39;une cellule souche unique. Cependant, les sphères sont intrinsèquement des structures dynamiques qui sont sujettes à fusionner, même à faible densité de semis 35. Étalement des cellules est une étape critique dans le protocole et la densité d&#39;une cellule / puits peut certainement contourner le problème d&#39;agrégation. Mais même pour les progéniteurs prospective triés, cela se traduit régulièrement dans la formation très faible sphère raison de la faible activité de formation de la sphère intrinsèque et peut également être attribuée à la stimulation autocrine limité en raison des effets de dilution. Dans notre expérience, nous avons constaté que seulement 30% des cellules étalées sont capables de former des sphères. Nous vous recommandons d&#39;utiliser au moins 100 cellules / puits pour obtenir des résultats cohérents et reproductibles. Autres méthodes de culture à SCC de croissance sont fondées sur les cultures 3D solide ou semi-solide (par exemple, sur la base de mAtrigel, du collagène ou de la méthylcellulose). Ces méthodes ont été utilisées pour limiter la mobilité de la cellule et l&#39;agrégation de cellules 36 ultérieur. Cependant, chacune de ces matrices porte leurs propres limites. Par exemple, matrigel est une membrane de sous-sol soluble isolé du Engelbreth-Holm-Swan (EHS) tumeur et, bien que l&#39;extrait ressemble à l&#39;environnement de la tumeur extracellulaire complexe trouvé dans de nombreux tissus, il contient de multiples facteurs de croissance plus ou moins bien définies qui rend souvent mécaniste études pour les éléments réglementaires spécifiques très difficiles. Un autre point à considérer est que les fonctions cellulaires sphère capacité de former et de la tige ne ​​sont pas des termes interchangeables 34. On a montré que tandis que certaines cellules souches et progénitrices de présenter une insuffisance sphère formant capacité de 37, pour produire des sphères in vitro ne pas exclure vivo en fonction souches / progénitrices. Par exemple, des cellules souches quiescentes peuvent tout simplement pas répondre aux signaux fournis par le extracellulairessélectionné dans des conditions de culture in vitro. Ainsi, à long terme in vitro et in vivo la capacité d&#39;auto-renouvellement des populations de cellules purifiées, de préférence au cours de passages en série, devrait être évaluée afin de prouver ou de réfuter la fonction des cellules souches. Dans ce contexte, la capacité de se propager de façon prospective et simultanément diverses populations de cellules souches et progénitrices est un aspect crucial de l&#39;analyse de la sphère de formation et rend cet essai très précieux pour le domaine du SCC; aussi longtemps que ses limites sont gardés à l&#39;esprit pour l&#39;interprétation des données obtenues. dosages de Sphère formation ont été largement utilisés pour identifier rétrospectivement cellules souches en fonction de leur capacité à l&#39;auto-renouvellement et de différenciation au niveau de la cellule unique in vitro. La découverte de marqueurs qui permettent l&#39;isolement éventuel de cellules souches et de leur descendance à partir de leur niche in vivo permet les propriétés fonctionnelles des populations purifiées à définir. Les combinaison d&#39;essai de formation de la sphère et la FACS est une stratégie efficace pour isoler les cellules du tissu solide ou sous-populations spécifiques enrichir de PDAC dans la culture. Par exemple, l&#39;expression simultanée de EpCAM, CD24 et CD44 définit une sous-population de cellules souches cancéreuses en mesure de: l&#39;auto-renouvellement, de se différencier et d&#39;initier une tumeur, ce qui reflète l&#39;hétérogénéité de la tumeur d&#39;origine. Hermann et al. ont montré que les cellules CD133 + possédaient la capacité de prolifération augmentée et le SCC dispose de 15. D&#39;autres marqueurs ont également été utilisées pour la caractérisation de cellules souches cancéreuses: une ALDH- (aldéhyde déshydrogénase-1) expression est associée à des cellules hautement tumorigènes dans 38 le cancer du pancréas; cellules capables d&#39;exclure le colorant d&#39;ADN Hoechst 33342, la population de côté appelé (SP) des cellules, ont la capacité certifié pour initier des tumeurs 39. Récemment, nous avons montré que un compartiment d&#39;autofluorescence subcellulaire caractérise une population distincte de cellules humaines avec des traits SCC exclusifs à travers différents types de tumeurs40. Même si aucun de ces marqueurs semble caractériser sélectivement une population pure de CSC, combinaisons de plus en plus complexes de marqueurs doivent être utilisés pour purifier FACS populations les plus raffinés de cellules. Beaucoup de questions demeurent sur le rôle précis des CSC dans l&#39;origine, la progression et la résistance aux médicaments des tumeurs. Par exemple, une façon d&#39;aborder la question de l&#39;évolution clonale de définir si et comment un seul CSC lance une tumeur, pourrait être d&#39;analyser les échantillons des patients à différents stades de la maladie, et plus particulièrement de suivre le nombre de CSC pendant et après le traitement. En répondant à ces questions, nous pouvons réaliser des progrès significatifs de notre connaissance de CSC dans les tumeurs solides et de développer des thérapies pour prévenir finalement la progression tumorale et la rechute.

Pancréatique adénocarcinome canalaire (PDAC) est l&#39;une des tumeurs solides les plus agressifs. Il est actuellement le 4 ème décès lié au cancer le plus fréquent dans la société occidentale et devrait augmenter à la cause 2 ème plus fréquente dans la prochaine décennie (~ 400.000 décès par an dans le monde) 3 .Au moment du diagnostic 90% des patients présentent avec une maladie avancée, qui a une survie à 5 ans de moins de 5%. Ce taux de survie a malheureusement restée inchangée au cours des 50 dernières années, malgré les activités de recherche de plus en plus intensifs 4. Sur les 10% de patients restants qui ont potentiellement la maladie &quot;curable&quot; par résection chirurgicale, 80% mourront de récidive dans les 5 ans. Depuis de nombreuses années la norme de soins pour la maladie avancée a été monothérapie gemcitabine, mais cela ne confère un avantage de survie marginale 5. De petites améliorations dans la survie à court terme ont été obtenus par l&#39;additionde l&#39;erlotinib 6 ou 7 capécitabine, mais le bénéfice de survie est de l&#39;ordre de semaines à la médiane de survie globale encore ~ 6 mois. Récemment, des résultats plus encourageants sont apparus pour la gemcitabine / nab -paclitaxel 8 et la combinaison de FOLFIRINOX régime 9,10. Ces thérapies améliorent la survie médiane par un 2 et 4 mois respectivement modestes, mais sont hautement toxiques et les survivants à long terme sont encore une exception rare. Bien que le traitement offre le potentiel d&#39;amélioration, ce sont les régimes toxiques à laquelle de nombreux patients ne répondent pas ou ne montrent que l&#39;amélioration progressive de la survie globale. En conséquence, il ya un besoin urgent de compléter les traitements actuels et à développer de nouvelles approches thérapeutiques multimodales les plus probables. L&#39;hétérogénéité tumorale Il devient de plus en plus évident que l&#39;hétérogénéité du cancer ne se limite pas à l&#39;évolution distincte sous-clones within 11 chaque tumeur, mais aussi entraîné par hétérogénéité phénotypique et fonctionnelle et la plasticité au sein de chaque sous-clone 12. Les soi-disant cellules souches du cancer (CCM) ou des cellules tumorales de promotion sont responsables de l&#39;hétérogénéité intraclonale 13-16. Plus précisément, les CSC représentent un sous-ensemble de cellules cancéreuses, pour lesquels nous et d&#39;autres avons fourni des preuves concluantes, jusqu&#39;à la cellule unique, qu&#39;ils représentent la racine de la maladie en donnant naissance à tous les descendances différenciées au sein de chaque sous-clone du cancer 17. Plus important encore, ces cellules sont essentiels pour le comportement métastatique et représentent aussi une source importante de rechute de la maladie après un traitement, même avec des médicaments relativement efficaces capables d&#39;induire une régression de la tumeur initiale (par exemple, -paclitaxel nab) 15,18-20. Il est important de noter que les CSC ne représentent pas nécessairement de bonne foi cellules souches, pas plus qu&#39;ils ne se posent à partir de cellules souches de tissus dans de nombreux cas, mais plutôt ils ont acquired certaines caractéristiques des cellules souches. La plupart d&#39;entre eux sont fonctionnellement définie, par exemple CSC sont équipées avec une capacité d&#39;auto-renouvellement indéfini qui les rend résistants à la chimiothérapie conventionnelle, et de montrer envahissant qui favorise l&#39;activité métastatique augmenté. Fonctionnels phénotypes cellulaires souches du cancer Le phénotype fonctionnel de CSC est basée sur leur capacité d&#39;auto-renouvellement, qui peut être testé in vitro en utilisant la formation de la sphère de série et des essais de formation de colonies respectivement. Plus important encore, les CSC capables d&#39;auto-renouvellement ours dans tumorigenicity vivo qui peuvent être testés en limitant la dilution in vivo que la lecture fonctionnelle ultime, de préférence lors de la transplantation de série indicative de tumorigénicité exclusive à long terme. En outre, il existe une hétérogénéité dans le compartiment du SCC, avec une sous-population distincte des CSC portant la capacité exclusive de donner lieu à des métastases qui est non seulement unconséquence directe de leur exclusivité dans tumorigenicity vivo. En effet, CSC metastastitic acquièrent la capacité de se soustraire à la tumeur primaire, et finalement survivre anoïkis translocation et épépiner les sites secondaires. Ces capacités fonctionnelles évoluées peuvent être testés in vitro en utilisant des essais d&#39;invasion modifiés et in vivo en utilisant des analyses de métastases. Ciblant les cellules souches du cancer Nous et d&#39;autres avons fourni des preuves convaincantes que les traitements se concentrant sur ​​la tumeur en masse de cellules PDAC différenciées, même en combinaison avec des agents du stroma-ciblage, ne pas avoir un impact majeur sur la progression tumorale et l&#39;issue subséquente, sauf combinée avec une stratégie CSC-ciblage 21, 22. Ainsi, sur la base des fonctions cruciales de CSC dans la progression de la maladie et de la résistance à la thérapie, ces cellules doivent signifier une composante essentielle de toute approche de traitement 18,20 roman, mais il faudra une compréhension beaucoup plus approfondie of le mécanisme de réglementation des CSC. Bien que les CSC et leurs descendances plus différenciées portent états génétiques identiques au sol par rapport à des altérations génétiques, CSC présentent l&#39;expression des gènes distincts et donc épigénétiquement déterminé profils part modules avec des cellules souches pluripotentes. La plupart des gènes impliqués dans la production induite par les cellules souches pluripotentes (Nanog, Oct3 / 4, Klf4, Sox2) ont non seulement été liée au cancer, mais leur expression se limite essentiellement au compartiment CSC. En outre, la pertinence fonctionnelle des CSC par des expériences de perte de fonction à l&#39;aide des outils génétiques pour cibler CCF ont désormais fermement établi le concept SCC pour plusieurs types de cancer 23-25. Alors que la plupart de ces approches sont basées sur des modèles de souris et donc ne sont pas facilement transférables dans la clinique, ils ne fournissent la preuve de concept pour la pertinence clinique potentielle de ciblage CSC en combinaison avec des cellules tumorales en vrac. L&#39;étude des cellules souches du cancer Dans Vitro pour identifier leur talon d&#39;Achille Afin d&#39;identifier des façons nouvelles et cliniquement applicables pour cibler les cellules souches cancéreuses, leurs caractéristiques sont régulièrement étudiés in vitro et la formation de la sphère est largement utilisé dans ce contexte. Initialement développé pour l&#39;étude de la biologie des cellules souches normales, y compris l&#39;auto-renouvellement et la capacité de différenciation, cet essai a ensuite été adapté pour étudier CSC in vitro et a été utilisé pour étudier les CSC isolés à partir de 20 PDAC. Nous avons trouvé que les sphères de tumeurs formées à partir de cellules primaires humaines PDAC portent toutes les caractéristiques distinctes de CSC, indiquant ainsi qu&#39;ils contiennent bona fide pancréatiques CSC 21. Ainsi, le dosage de la sphère de la tumeur représente un outil puissant à l&#39;écran pour des thérapies plus efficaces in vitro, mais les résultats doivent encore être évalués dans plus strictes des essais in vivo. En effet, les données générées avec ce dosage in vitro doivent être traités avec beaucoup de prudence, car ee dosage peut faire l&#39;objet d&#39;erreur significative. Protocoles hautement standardisés, y compris le comptage automatique de sphères formées, devraient être mis en place pour assurer que les données reproductibles et prédictifs. Dans ce contexte, nous avons récemment utilisé ce test pour dépister CSC pancréatiques dérivées d&#39;un ensemble diversifié de PDAC humains primaires et montré que ces cellules sont très vulnérables à la reprogrammation métabolique par antidiabétique metformine composé. Auparavant, la metformine a été démontré pour inhiber le cancer expansion cellulaire par activation indirecte de la protéine kinase activée par l&#39;AMP (AMPK) de signalisation et l&#39;inhibition ultérieure de mTOR 26, ayant pour résultat la synthèse des protéines et réduit la prolifération des cellules 27. En plus de ces effets sur la population de la tumeur en vrac, nous et d&#39;autres avons découvert que la metformine est capable de cibler et éliminer réellement la sous-population CSC dans un certain nombre de tumeurs solides telles que du sein, cancer de l&#39;œsophage, le glioblastome et le cancer du pancréas 28-31 &lt;/ Sup&gt;. Ainsi, la metformine représente une nouvelle stratégie thérapeutique prometteuse et sûre pour plusieurs cancers ayant des besoins médicaux non satisfaits actuellement. En outre, en utilisant la formation de la sphère comme un moyen pour enrichir CSC, nous avons montré que les effets primaires de la metformine sur la CSC pancréatiques était indépendante de l&#39;activation de l&#39;AMPK et surtout compté sur sa toxicité mitochondriale modeste (par inhibition de complexe I), qui était apparemment mortelle pour le sous-ensemble des CSC seulement. Pour ce dernier, nous avons pu évaluer leur consommation d&#39;oxygène et la production cellulaire ROS mitochondriale comme des indicateurs de la toxicité de la drogue au niveau cellulaire. Par la suite, ces données in vitro pourraient être validés dans des modèles murins précliniques et bien entraîné prolongé significativement la survie 31. La méthodologie présentée ici permet la génération rapide des profils de sensibilité aux médicaments pour les CSC, y compris des études sur leurs effets sur le métabolisme du SCC. Nous fournissons maintenant étendu détails expérimentaux sur le com utilisécomplémentaire in vitro et dans des procédures in vivo.

<table><tbody><tr><td>Chambre de comptage/hémocytomètre&nbsp ;</td><td>Hausser Scientific Co</td><td>3200</td><td></td></tr><tr><td>CASY Compteur et analyseur de cellules pour la mesure de la prolifération et de la viabilité</td><td>Roche Innovatis</td><td>AG CASY Modèle TTC 45,60,150 &mu ; m</td><td></td></tr><tr><td>Dissociateur GentleMACS&nbsp ;</td><td>Miltenyi Co</td><td>130-093-235</td><td></td></tr><tr><td>Tubes GentleMACS C&nbsp ;</td><td>Miltenyi Co</td><td>130-093-237</td><td></td></tr><tr><td>Plaques de fixation ultra-basses à 24 puits&nbsp ;</td><td>Corning</td><td>3474</td><td></td></tr><tr><td>Boîtes de culture tissulaire de 100 mm&nbsp ;</td><td>BD Falcon</td><td>353803</td><td></td></tr><tr><td>Crépine à cellules&nbsp ;</td><td>BD Falcon</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>Tube conique en polypropylène de 15 ml.</td><td>BD Falcon</td><td>352097</td><td></td></tr><tr><td>tube conique en polypropylène de 50 ml.</td><td>BD Falcon</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>Tubes stériles de 1,5 ml&nbsp ;</td><td>Eppendorf</td><td>0030 120.086</td><td></td></tr><tr><td>50 ml tubes à centrifuger&nbsp ;</td><td>Corning</td><td>430828</td><td></td></tr><tr><td>Boîtes de Pétri stériles, boîtes de 10 cm&nbsp ;</td><td>Aiguilles</td><td>Corning 353003</td><td></td></tr><tr><td>26 G&nbsp ;</td><td>BD Falcon</td><td>300600</td><td></td></tr><tr><td>100 ul Hamilton Seringue&nbsp ;</td><td>Hamilton Seringue Co</td><td>81075</td><td></td></tr><tr><td>Collagénase de type IV&nbsp ;</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>7909</td><td></td></tr><tr><td>RPMI Medium 1640&nbsp ;</td><td>Life technologies</td><td>11875-085</td><td></td></tr><tr><td>Solution de pénicilline/streptomycine, 100X&nbsp ;</td><td>Technologies du vivant</td><td>SV30010</td><td></td></tr><tr><td>la metformine&nbsp ;</td><td>Sigma</td><td>D150959-5G</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamine, 200 mM, 100X&nbsp ;</td><td>Technologies du vivant</td><td>25030-081</td><td></td></tr><tr><td>D-Glucose&nbsp ;</td><td>Sigma</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>100mM Pyruvate de sodium solution&nbsp ;</td><td>Life technologies</td><td>11360-070</td><td></td></tr><tr><td>Seahorse Support d’essai&nbsp ;</td><td>Seahorse Bioscience</td><td>100965-000</td><td></td></tr><tr><td>BD Cell-TAK Adhésif pour cellules et tissus&nbsp ;</td><td>BD Biosciences</td><td>354240</td><td></td></tr><tr><td>Solution de trypsine, 0,05 %&nbsp ;</td><td>Technologies du vivant</td><td>25300054</td><td></td></tr><tr><td>B27 Supplément 50x&nbsp ;</td><td>Life technologies</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>Facteur de croissance des fibroblastes de base&nbsp ;</td><td>Sigma</td><td>F0291</td><td></td></tr><tr><td>Albumine sérique bovine&nbsp ;</td><td>Sigma</td><td>A9576</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s Eagle Medium modifié/F12&nbsp ;</td><td>Sigma</td><td>D8437</td><td></td></tr><tr><td>Stérile 1x Dulbecco' s Saline tamponnée au phosphate&nbsp ;</td><td>Sigma</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Bleu&nbsp ;</td><td>Life technologies</td><td>15250-061</td><td></td></tr><tr><td>Carboxy-DCFDA(5-(et-6)-Carboxy-2',7'-DichlorofluorescéineDiacétate)&nbsp ;</td><td>Life technologies</td><td>C-369</td><td></td></tr><tr><td>Rotenone</td><td>Sigma</td><td>R8875</td><td></td></tr><tr><td>Éthanol 70 % (vol/vol)&nbsp ;</td><td>Sigma</td><td>459844</td><td></td></tr><tr><td>Isofluorane</td><td>IsoVet, Braun</td><td>571105.8</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>BD Biosciences</td><td>35620</td><td></td></tr><tr><td>Applicateur stérile à embout en coton</td><td>&nbsp ; Puritan medical</td><td></td><td></td></tr><tr><td>XF96e FluxPak avec plaques cellulaires, calibrateur et cartouches</td><td>Seahorse Bioscience</td><td>102416-100</td><td></td></tr><tr><td>XF96e Analyseur de flux extracellulaire</td><td>Seahorse Bioscience</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Incubateur avec entrée CO2</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Micro ciseaux</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pince</td><td></td><td></td><td></td>courbe</tr><tr><td>Pince à échardes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pied à</td><td></td><td></td><td></td> étrier</tr></tbody></table>

etudier le cancer du pancréas stem cell caractéristiques pour le développement de nouvelles stratégies de traitement

Studying Pancreatic Cancer Stem Cell Characteristics for Developing New Treatment Strategies

Adénocarcinome ductal pancréatique (PDAC) contient un sous-ensemble de cellules souches cancéreuses tumorigènes exclusivement (CCM) qui se sont révélées conduire à l&#39;initiation de la tumeur, les métastases et la résistance à la radio- et chimiothérapie. Nous décrivons ici une méthodologie spécifique pour la culture de cellules souches cancéreuses pancréatiques humaines primaires que des sphères tumorales dans des conditions de l&#39;ancrage indépendant. Les cellules sont cultivées en absence de sérum, des conditions non-adhérentes afin d&#39;enrichir pour CSC tandis que leurs descendances plus différenciés ne survivent et prolifèrent pendant la phase initiale après l&#39;ensemencement des cellules individuelles. Ce dosage peut être utilisé pour estimer le pourcentage de cellules souches cancéreuses présentes dans une population de cellules tumorales. Les deux taille (qui peut varier de 35 à 250 micromètres) et le nombre de sphères formés représente tumorales SCC activité soit hébergé en vrac populations de cellules cancéreuses ou des tumeurs de culture fraîchement récoltées et digérés 1,2. L&#39;utilisation de ce test, nous avons récemment constaté que la metformine ablation sélective pancreatCSC ic; une constatation qui a ensuite été corroboré par démontrant expression réduite des gènes / marqueurs de surface de pluripotence-associé et réduit la tumorigénicité in vivo de cellules de metformine-traitée. Comme la dernière étape pour le développement préclinique, nous avons traité des souris porteuses de tumeurs établies avec la metformine et a trouvé significativement prolongé la survie. Les études cliniques évaluant l&#39;utilisation de la metformine chez des patients avec PDAC sont actuellement en cours (par exemple, NCT01210911, NCT01167738, et NCT01488552). Mécaniquement, nous avons constaté que la metformine induit une crise de l&#39;énergie fatale dans les CSC en améliorant les espèces réactives de l&#39;oxygène (ROS) et la réduction de potentiel transmembranaire mitochondrial. En revanche, les non-CCM ne sont pas éliminés par un traitement à la metformine, mais plutôt réversible subi un arrêt du cycle cellulaire. Par conséquent, notre étude sert comme un exemple réussi pour le potentiel de la formation in vitro de la sphère comme un outil de dépistage pour identifier des composés qui ciblent potentiellement SCCs, mais cette technique, il faudra en outre in vitro et in vivo de validation pour éliminer les fausses découvertes.

Metformine cible sélectivement les cellules souches cancéreuses pancréatiques Nous avons d&#39;abord examiné les effets fonctionnels de traitement par la metformine sur la capacité d&#39;auto-renouvellement des cellules souches cancéreuses in vitro. A cet effet, nous avons effectué des dosages de formation de sphères en utilisant des cellules pancréatiques humaines cancéreuses primaires isolées à partir de tissus réséqués PDAC pendant la chirurgie. Nous avons observé que la metformine a fortement diminué la taille des sphères formées (figure 1A). Ce fut probablement par inhibition de l&#39;expansion des descendances du SCC, qui représentent encore l&#39;essentiel des cellules présentes dans les sphères car ils ne sont enrichies en cellules souches cancéreuses. En effet, les sphères plus longues sont cultivées sans repiquage la plus étendue de l&#39;expansion des descendances plus différenciées sera. Ainsi, nous avons trouvé la metformine pour diminuer considérablement le nombre de sphères formées en fait, indépendamment de leur taille, se produisant d&#39;une manière dépendante de la dose qui suggère une forte inhibition de la capacité d&#39;auto-renouvellement de CSC (données non présentées). Nous avons constaté que la metformine à 3 mM diminué de manière significative le nombre de sphères formées (figure 1B). Afin d&#39;étudier de manière plus stricte les effets à long terme de la metformine sur la capacité d&#39;auto-renouvellement des cellules souches cancéreuses, nous avons par la suite à des passages les sphères primaires formés dans les sphères secondaires et tertiaires. Bien que seuls des sphères primaires ont été traitées avec la metformine, la formation de sphères dans les deuxième et troisième passages a été considérablement réduite et de plus en plus, ce qui implique un traitement de metformine a en effet irréversiblement éliminé la majorité des cellules souches cancéreuses (figure 1C). Ainsi, nos données ont montré des effets significatifs du traitement pour la metformine sur la capacité d&#39;auto-renouvellement des cellules souches cancéreuses pancréatiques primaires et donc nous ont encouragés à effectuer d&#39;autres mécanistique ainsi que des études in vivo. Metformine inhibe mitochondrial consommation d&#39;oxygène et induit la production de ROS Depuis metformin a été montré pour agir comme un poison mitochondrial en inhibant partiellement activité du complexe I, nous avons ensuite examiné les effets aigus de la metformine sur la consommation cellulaire d&#39;oxygène dans les cellules dérivées de la sphère. A cet effet, nous avons sélectionné des cellules dérivées de deux tumeurs primaires représentatives PDAC et mesuré la consommation d&#39;oxygène au cours du temps après l&#39;injection séquentielle de metformine 3 mM (trois injections) et 1 uM de roténone (une injection). Comme le montre la Figure 2A, l&#39;injection de la metformine a induit une diminution rapide et dose-dépendante de la consommation d&#39;oxygène, ce qui fait varier considérablement entre les différentes tumeurs. Nous avons calculé l&#39;activité mitochondriale résiduelle lors du traitement de la metformine en injectant la roténone, un complexe inhibiteur puissant I, qui est capable d&#39;inhiber complètement la consommation d&#39;oxygène des mitochondries. Sensibilité à la metformine en termes de consommation d&#39;oxygène mitochondriale corrélée avec sa capacité à induire la production de ROS défini comme un déplacement de la moyenne de la popution après traitement par la metformine (figure 2B, panneau de gauche), qui peut être facilement quantifié (Figure 2B, panneau de droite). Comme on s&#39;y attendait, les cellules primaires qui étaient les plus sensibles à l&#39;inhibition de la consommation d&#39;oxygène ont également montré la plus forte augmentation de la production de ROS lors d&#39;un traitement de metformine. Ainsi, ces expériences métaboliques in vitro montrent que les objectifs de metformine CSC en inhibant leur dépendance sur la fonction mitochondriale, résultant en une augmentation ultérieure de la production mitochondriale de ROS et éventuellement induction de l&#39;apoptose. Metformin Echoppes PDAC Progression In Vivo Nous avons enfin étudié les effets de la metformine in vivo en utilisant des xénogreffes de tissus provenant de différents patients atteints de PDAC. Nous avons observé une réduction significative de la progression de la tumeur chez les souris traitées à la metformine par rapport au groupe de contrôle, mais les tumeurs jamais complètement disappeared (Figure 3). Par la suite, au cours de long terme suivi toutes les tumeurs finalement rechuté suggérant résistance de metformine de cellules survivantes de la phase initiale du traitement. Néanmoins, le traitement de metformine, même lorsqu&#39;il est appliqué en tant qu&#39;agent unique, étendu de manière significative la survie chez toutes les souris. <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/52801/52801fig1.jpg" /> Figure 1. La metformine cible sélectivement le CSC. (A) La metformine a diminué la taille des sphères. Des images représentatives de sphères obtenues après le traitement avec les doses indiquées de la metformine pour 7 jours (panneau de droite). Quantification de la taille de la sphère (de n≥6) (panneau de gauche), les chiffres indiqués dans l&#39;axe des abscisses représente la tumeur individuelle. (B) Sphère de la capacité de formation en présence ou en l&#39;absence de metformine pendant 7 jours (n≥6), les nombres indiqués dans abscissesreprésentent axe tumeur individuelle. (C) de graphe représentant de SCC auto-renouvellement des capacités dans les domaines secondaires et tertiaires de cellules cancéreuses pancréatiques primaires. Les sphères ont été seulement traités lors de la formation de la sphère de première génération pour un total de 7 jours (n = 6). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52801/52801fig1large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/52801/52801fig2.jpg" /> Figure 2. La metformine traitement inhibe la consommation d&#39;oxygène et la production de ROS Induit. (A) plus de la metformine inhibe la consommation d&#39;oxygène (OCR) de cellules de la sphère dérivés. Deux sphères secondaires PDAC différents ont été traités avec la metformine et les changements OCR ont été mesurés par analyse des flux extracellulaire. Injection roténone a été utilisé comme témoin pour la consommation totale mitochondrial OCR.L&#39;axe des X représente le taux de consommation d&#39;oxygène de l&#39;oxygène en pmol / h normalisée par la teneur en protéine dans chaque puits. sphères (B) utilisés dans la PDAC A ont été traités pendant 8 heures avec de la metformine et de la production de ROS a été évaluée par cytométrie en flux en utilisant carboxy-DCFDA. Gauche, flux représentant cytométrie parcelles. Droit, résumé des données provenant de trois expériences indépendantes. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52801/52801fig2large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît, cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <img alt="Figure 3" src="/files/ftp_upload/52801/52801fig3.jpg" /> Figure 3. La metformine Echoppes PDAC Progression In Vivo. Deux tissus de xénogreffes PDAC différents ont été implantés dans des souris immunodéprimées et le traitement a été attribuée après le décollage initial de la tumeur a été vérifiée. Les souris ont été traitées avec la metformine (Met) ajoutés à l&#39;eau potable (150 mg / kg corps weilutte; basé sur 5 ml de la consommation d&#39;eau par jour). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52801/52801fig3large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît, cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a>

Les cellules souches du cancer du pancréas (CSC) peuvent être développées in vitro à l’aide de la technique de culture de sphère indépendante de l’ancrage, qui représente un outil puissant pour étudier la biologie des CSC et peut servir de première étape pour développer de nouvelles thérapies ciblant les CSC. La méthodologie d’expansion, d’analyse et de ciblage des CSC pancréatiques est présentée ici.

Etudier le cancer du pancréas Stem Cell Caractéristiques pour le développement de nouvelles stratégies de traitement

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) contains a subset of exclusively tumorigenic cancer stem cells (CSCs) which have been shown to drive tumor ...

L'objectif général de la procédure suivante est d'agrandir les cellules souches cancéreuses in vitro à l'aide d'une technique de culture indépendante de l'ancrage, puis d'évaluer les effets métaboliques de nouvelles thérapies ciblant les cellules souches cancéreuses. Ceci est réalisé en dissociant d'abord un échantillon de tissu d'adénocarcinome pancréatique humain en une suspension monocellulaire. Dans une deuxième étape, le tissu tumoral est davantage digéré par des enzymes, puis ensemencé sur une plaque de gélatine. Afin d'éliminer la population de cellules fibroblastes, les cellules cancéreuses isolées sont ensuite ensemencées dans une plaque multipuits à attachement ultra faible et traitées avec le médicament d'intérêt afin d'évaluer l'activité métabolique et la formation de sphéroïdes tumoraux.En fin de compte, le médicament d'intérêt peut être utilisé chez des souris immunodéprimées porteuses de xénogreffes dérivées de patients afin de valider les effets du médicament in vivo. Cette méthode constitue un outil puissant pour l'étude de la biologie des cellules souches cancéreuses et sert de première étape pour le développement de nouvelles thérapies ciblant les cellules souches cancéreuses. La démonstration de la procédure sera assurée par moi-même, chercheuse débutante au Centre des cellules souches dans le cancer et le vieillissement à l'Institut du cancer du sein, et Tini Cruz, étudiante au doctorat de mon laboratoire, pour isoler des cellules souches cancéreuses à partir d'un adénocarcinome ductal pancréatique dans un coffret de sécurité biologique stérile.Utilisez un scalpel et des pinces stériles pour hacher la tumeur humaine dans une boîte de culture de 60 par 15 millimètres contenant un millilitre de PBS stérile, en ajoutant trois à quatre millilitres supplémentaires de PBS selon les besoins, jusqu'à ce que le tissu soit complètement dissocié. Transférez la suspension tissulaire dans un tube conique stérile et ajoutez du PBS jusqu'à un volume final de cinq millilitres. Ensuite, homogénéisez mécaniquement l'échantillon à l'aide d'une centrifugeuse de dissociation et digérez le tissu homogénéisé avec de la collagénase à 37 degrés Celsius.Après une heure de centrifugation, resuspendre les cellules, en redispersant le culot dans 10 millilitres de milieu complet. Filtrer la suspension cellulaire à travers un tamis de 40 micromètres et centrifuger à nouveau les cellules. Cette fois-ci, resuspendre le culot dans cinq millilitres de CK. Après cinq minutes à température ambiante, éliminer le tampon de lyse des globules rouges par centrifugation et resuspendre le culot dans le milieu de cellules souches cancéreuses.Ensuite, incuber les cellules dans une boîte de Pétri revêtue de gélatine à 37 degrés Celsius afin d'éliminer la majorité des cellules fibroblastes qui s'attachent rapidement. Après une heure, récupérer le surnageant et quantifier le nombre de cellules cancéreuses pancréatiques viables afin de faciliter la formation de sphéroïdes tumoraux pour le cancer. Pour enrichir les cellules souches, diluer les cellules dans un volume approprié de milieu pour cellules souches cancéreuses jusqu'à une concentration finale de 2 × 10³ cellules par millilitre, puis les refroidir sur de la glace pendant quelques minutes.Ensuite, après avoir ajouté 500 microlitres de PBS dans les premières et dernières rangées d'une plaque cellulaire 24 puits à attachement ultra faible, re-suspendre les cellules à l'aide d'une pipette et ensemencer un millilitre de cellules par puits dans les puits vides de la plaque. Traiter quatre puits de cellules avec le médicament d'intérêt et au moins quatre puits témoins négatifs avec le véhicule. Puis incuber les cellules à 37 °C avec 5 % CO₂ pendant une semaine.Tous les deux jours, ajoutez un traitement frais à notre véhicule dans chacun des puits. Au jour cinq ou sept, évaluez le nombre de sphères tumorales formées à l’aide d’un compteur cellulaire automatisé permettant l’identification de structures plus grandes pour l’emballage en série des sphères tumorales. Au jour sept, utilisez un tamis cellulaire de 40 micromètres pour récolter les sphères.Ensuite, centrifuger les sphéroïdes et les incuber dans un millilitre de trypsine pendant 20 minutes à 37 degrés Celsius afin de dissocier le culot en une suspension monocellulaire. Puis, étendre les cellules pendant sept jours supplémentaires comme vient de l'être démontré pour préparer les sphéroïdes à la mesure de leur production d'espèces réactives de l'oxygène ou ERO. Après la dissociation comme vient de l'être démontré, centrifuger les sphéroïdes et resuspendre le culot dans du HBSS contenant la sonde appropriée. Après une incubation de 20 minutes à l'abri de la lumière à 37 degrés Celsius, placer les cellules sur de la glace jusqu'à leur analyse par cytométrie en flux pour préparer les sphéroïdes à la mesure de leur consommation d'oxygène.Commencez par recouvrir une plaque de culture cellulaire de 96 puits avec un adhésif pour cellules et tissus pendant au moins 20 minutes à température ambiante. Ensuite, dissociez les sphéroïdes à l’aide de trypsine, comme illustré. Puis lavez la plaque deux à trois fois à l’eau pour éliminer l’excès d’adhésif, et semez les cellules individuelles à raison de trois fois 10 à la puissance 5 cellules par puits.Dans 150 microlitres de milieu de dosage de la consommation d'oxygène contenant du glucose et du pyruvate de sodium, adhérer les cellules au fond des puits par centrifugation jusqu'à ce que 100 fois G soit atteint. Laisser la centrifugeuse s'arrêter sans frein. Ensuite, inverser l'orientation de la plaque et répéter la centrifugation.Incubez maintenant les cellules pendant 30 minutes à 37 degrés Celsius sans dioxyde de carbone. Pendant ce temps, chargez les cartouches de dosage A, B et C. Injectez 25 microlitres d'une concentration de trois, six et neuf millimolaire du médicament d'intérêt respectivement, et la cartouche D avec 25 microlitres d'une concentration d'un micromolaire de l'inhibiteur mitochondrial rone.Lorsque les cellules sont prêtes, étalonnez la cartouche et chargez la plaque de culture cellulaire. Enfin, exécutez le test selon le protocole standard de mélange et de mesure. Dans ces expériences représentatives, le traitement des cellules souches cancéreuses du pancréas avec la métformine a fortement réduit la taille et le nombre de sphères tumorales. De plus, ces réductions ont été observées dans les cultures de sphères secondaires et tertiaires. Même lorsque seule la culture de la sphère primaire avait été traitée avec de la métformine, la métformine agit apparemment comme un inhibiteur mitochondrial. En effet, dans cette expérience, on a observé que le médicament induisait une diminution rapide et dépendante de la dose de la consommation d'oxygène dans les cellules tumorales, ce qui corréle avec sa capacité à induire la production de ROS. Importamment, les souris traitées à la métformine présentent une réduction à court terme mais significative de la progression du carcinome pancréatique par rapport aux animaux témoins. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière de dissocier des tumeurs humaines fraîches, d'isoler des cellules cancéreuses primaires, de mettre en place une culture de formation de sphéroïdes et d'évaluer l'activité métabolique des cellules souches du cancer du pancréas.

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Médecine

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