Name: Encapsulation thermogénique préadipocytes pour la transplantation dans dépôts de tissu adipeux (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-06-02T12:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 30 s
Description: Découvrez l'encapsulation de cellules thermogéniques cataboliques pour la recherche sur l'obésité chez la souris. Cette méthode utilise des microbilles d'alginate pour améliorer la dissipation énergétique in vivo.

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Nous tenons à remercier Jennifer Petrosino et David DiSilvestro de l&#39;aide éditoriale. Cette recherche a été soutenue par numéro 20020728 Prix de l&#39;American Egg Board et le numéro 10040042 Prix de Novo Nordisk Pharmaceuticals ainsi que par le Centre Innovation Alimentaire, Bureau des affaires internationales, Centre for Advanced Functional Foods de recherche, et de l&#39;entrepreneuriat à l&#39;OSU ainsi que la National Science Foundation accorde CEE-0914790 (LJL). Le projet décrit a été soutenue par le Prix Nombre R21OD017244 (OZ) et UL1RR025755 (OSUCCC) du National Center for Research Resources, financé par le Bureau du Directeur de la National Institutes of Health (OD) et soutenu par le NIH Roadmap for Medical Research et NCI P30CA16058. Le contenu est de la seule responsabilité des auteurs et ne représentent pas nécessairement les vues officielles de la National Center for Research Resources ou de la National Institutes of Health.

Le protocole d&#39;étude a été approuvé par l&#39;Université Ohio State comités d&#39;éthique. Les expérimentations animales ont été approuvés par le protocole IACUC. Toutes les procédures ont été effectuées en vertu de la biosécurité au niveau du Cabinet 2 avec flux laminaire. Nous avons suivi toutes les exigences et procédures de sécurité standard. La technique de microencapsulation pour la préparation de microcapsules a été effectuée comme décrit 17, 18. 1. Préparatifs de Matériaux <ol><li> Préparer 10 ml de solution d&#39;alginate de sodium à 2% dans une solution saline physiologique à l&#39;autoclave (0,9% de NaCl dans l&#39;eau). Préparer une solution à 0,05% PLL dans du sérum physiologique. Préparer ces solutions le jour avant et agiter durant la nuit. Filtrer les solutions avec filtre de 0,22 um avant utilisation. </li><li> Préparation du citrate de sodium 50 mM et 100 mM de CaCl 2 dans 0,9% de NaCl et les autoclaver. </li><li> Autoclaver toutes les solutions, les aiguilles, les électrodes, et gobelets. Laver soigneusement les aiguilles propres avec des fils pour éviter le colmatage. </li><li> Déterminer le montant approprié de cellules à utiliser pour les capsules (102 microcapsules sont nécessaires pour chaque cm 2 de bien et il ya environ 500 cellules par capsule 18). Utiliser 1 ml d&#39;alginate de sodium par deux millions de cellules. </li><li> Préparer un «Fibroblast Growth Medium&quot; contenant du sérum de veau à 10%, et 100 U / ml de pénicilline / streptomycine dans une haute teneur en glucose (4500 mg / l de glucose) du milieu de Eagle modifié de Dulbecco (DMEM). <ol><li> Préparer un «milieu de différenciation I &#39;contenant 10% de sérum bovin foetal, 10 ug / ml d&#39;insuline, 1 uM de dexaméthasone, la xanthine mM de 3-isobutyl-1-méthyl 0,5, et 100 U / ml de pénicilline / streptomycine dans du DMEM. </li><li> Préparer contenant 10% de sérum un «milieu de différenciation II &#39;fœtal bovin, 10 pg / ml d&#39;insuline, et 100 U / ml de pénicilline / streptomycine dans DMEM. </li></ol></li><li> Préparer du tampon de lyse contenant une protease comprimé d&#39;inhibiteur par 10 ml de tampon de dosage radio-immunoprécipitation (RITampon PA). </li></ol> 2. Préparation des microbilles d&#39;alginate (figure 1A) <ol><li> Retirer ancien milieu de flacon de culture cellulaire. Rincer les cellules avec 10 ml de PBS. Apportez cellules en suspension avec 0,25% de trypsine-EDTA (2 ml par une confluence flacon T175). </li><li> Compter les cellules en suspension de cellules à l&#39;aide d&#39;un hémocytomètre. Utilisez aliquote de 10 ml de la suspension cellulaire et compter les cellules selon les instructions du fabricant. Centrifuger les cellules restantes dans un milieu de centrifugation à 480 x g à la température ambiante pendant 5 min. </li><li> Suspension du culot cellulaire dans de l&#39;alginate de sodium comme décrit à l&#39;étape 1.4. Transférer la solution d&#39;alginate de sodium-cellule à une seringue de 5 ml. </li><li> Retirer les bulles d&#39;air dans la solution, ajouter une aiguille de calibre 23 et inverser la seringue pour créer un 1 ml poche d&#39;air. </li><li> Placez un petit gobelet (180 ml) contenant 144 ml de solution de CaCl 100 mM 2 sous le bec de l&#39;aiguille de l&#39;encapsulateur. Fixez l&#39;électrode à l&#39;encapsulateur avec la pointe Approximment 2,5 cm au-dessus de la surface de la solution mM CaCl 2 100. </li><li> Passer hermétiquement la seringue contenant la solution d&#39;alginate de sodium-cellule dans la pompe à seringue. Fixer le tube de caoutchouc à l&#39;ouverture de la seringue. Poussez le piston jusqu&#39;à ce que la solution d&#39;alginate de sodium-cellule entre mi-chemin à travers le tube. Régler la tension à 5,4 kV. Régler le diamètre de 12,06 mm sur la pompe à seringue. Réglez la vitesse de 3 ml / h. Démarrer la pompe. Allumez l&#39;encapsulateur et maintenir la tension à 5,4 kV. </li><li> Fermer la fenêtre de la hotte et éviter toute vibration inutile jusqu&#39;à la fin de la formation des microbilles d&#39;alginate. Après tout solution passe à travers l&#39;aiguille, les microbilles se solidifier en forme de billes d&#39;alginate dans la solution mM CaCl 2 pour cent supplémentaire de 20 min avant le revêtement avec PLL. </li></ol> 3. microbilles de revêtement avec PLL (figure 1B) <ol><li> Retirer le bécher contenant les microbilles en forme de billes d&#39;alginate de sodium et de cellules transférer ces MicrobEADS dans un tube de centrifugation de 50 ml. Retirer la solution de CaCl2 à partir de la pastille de microbilles. </li><li> Laver les microbilles sphériques d&#39;alginate de cellules par addition de 30 ml de NaCl à 0,9%. Agiter le tube à la main en douceur. Retirer NaCl à 0,9% avec 25 ml pipette après les microbilles ont précipité par la gravitation. Répéter deux fois de plus pour un total de 3 lavages. </li><li> Utiliser 10 ml de solution de PLL à 0,05% pour chaque 1 ml de solution d&#39;alginate de sodium. Ajouter 0,05% PLL et le vortex à 1000 rotations par minute pendant 10 minutes. Remarque: Habituellement, 10 min est suffisante pour le revêtement PLL. </li><li> Une fois la couche PLL est formé, retirez la solution PLL et laver les capsules 3 fois comme décrit au paragraphe 3.2. </li></ol> 4. Suppression de l&#39;alginate de base (figure 1C) <ol><li> Ajouter 30 ml de solution de citrate de sodium à 50 mM. Attendre 5 minutes, ou jusqu&#39;à ce que tout l&#39;alginate de sodium soit dissous. Laver capsules trois fois comme décrit à l&#39;étape 3.1.1. </li><li> Enlever le NaCl à 0,9%, ajouter 20 ml de milieu de culture dans le tube de 50 mlet transférer tous les capsules contenant les cellules dans un ballon de culture de cellules. Poignée cellules encapsulées dans des conditions de culture cellulaire standard 18. </li></ol> 5. In Vitro applications à l&#39;étude de xénogreffes et cellule hôte Interactions ou Cinétique de métabolite Afflux / Efflux entre cellules (Figure 2) <ol><li> La culture de cellules hôtes sur plaque à 24 puits jusqu&#39;à la confluence des co-cultures. Utilisez le &#39;moyen de croissance des fibroblastes »pour préadipocytes de culture. </li><li> microcapsules de transfert 24 dans des cellules hôtes confluentes de plaque contenant aussi. Ajouter microcapsules pour parvenir à une monocouche (102 microcapsules / cm 2 de bien). </li><li> Induire la différenciation pré-adipocytes en milieu de différenciation I. Chaque 48 heures, les médias de changement au milieu de différenciation II pendant six jours. Lyse des cellules dans du tampon RIPA. Utilisez 50 pg de protéine par condition pour analyser l&#39;expression de protéines en Western blot. </li></ol> 6. En Vivo Demande de Traitemeent de l&#39;obésité (Figure 3) <ol><li> Mélanger 4% d&#39;isoflurane avec de l&#39;oxygène pour l&#39;induction de l&#39;anesthésie et 2% d&#39;isoflurane avec de l&#39;oxygène pour l&#39;entretien de l&#39;anesthésie. Confirmer la profondeur de l&#39;anesthésie adéquate par pincement de l&#39;orteil. <ol><li> Appliquer une pommade anti-démangeaison sur les yeux pour protéger les cornées de se dessécher. </li></ol></li><li> Utilisation des cellules encapsulées qui sont marqués de façon permanente avec la protéine de fluorescence artificiel, tels que la protéine de fluorescence verte (GFP). </li><li> Utiliser une seringue de trois ml et une aiguille de calibre 20 pour injecter des cellules encapsulées. <ol><li> Injecter 0,5 x 10 6 cellules en suspension dans 0,2 ml de PBS dans chaque dépôt de graisse IAB qui se trouve dans la zone intrapéritonéale entre une gonade et les reins comme le montre la figure 3. Utilisez ce volume de PBS et le nombre de cellules pour des souris avec un poids moyen de 40 g. Ajuster le nombre de cellules et le volume chez des souris qui ont un poids différent ou pour la détermination des effets dépendants de la dose. </li></ol></li></ol>

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Aucun conflit d’intérêts n’a été déclaré.

Diverses méthodes ont été utilisées pour encapsuler des cellules, y compris le séchage, l&#39;extrusion, et 19 l&#39;émulsion. Dans ce procédé, les billes d&#39;alginate sont extrudes à travers une aiguille, puis revêtue d&#39;PLL et le noyau alginate sera dissoute pour terminer l&#39;encapsulation. Bien que cette méthode a été utilisée pendant des années, la formation des perles avec la taille désirée et forme sphérique est toujours difficile. La taille des capsules est fortement dépendante de la viscosité d...

L&#39;incidence croissante des maladies chroniques 1 a stimulé les études sur la transplantation de populations de cellules thérapeutiques 2. Cellules souches syngéniques ou allogéniques sont les types de cellules les plus couramment utilisés pour ces applications 2. Cependant, ces traitements ne permettent pas le contrôle de la différenciation et la migration de cellules souches après l&#39;implantation et ne sont pas économiques efficace. La transplantation de cellules génétiquement modifiées avec les fonctions bénéfiques prévoit améliorer le traitement de nombreuses maladies. Cependant, les modifications génétiques de cellules sont reconnus par le système immunitaire de l&#39;hôte, par conséquent, ces traitements nécessitent trois immunosuppression. L&#39;encapsulation de cellules produisant de l&#39;insuline a été développé par le Dr Chang 4. La technique est basée sur l&#39;encapsulation des cellules dans des gouttelettes d&#39;alginate qui sont immergés dans une solution de chlorure de calcium. Les molécules d&#39;alginate sont constitués d&#39;acide mannuronique (M) et guluronique (G) et peuvent être connectés par Ca 2+. Après la gélification, les billes sont mises en suspension une poly-L-lysine (PLL) solution. Au cours de cette étape, PLL se lie à G et M dans les molécules d&#39;alginate qui établit la membrane de la capsule. La porosité de la membrane de la capsule peut être modulée en faisant varier les concentrations de S PLL, et le temps d&#39;incubation et de la température. La liaison de PLL dépend aussi du type et de la concentration d&#39;alginate. Des matrices d&#39;alginate réticulé par des ions Ca 2+, sont instables dans le milieu physiologique ou dans des solutions tampons à forte concentration communs de phosphate et les ions citrate. Ces tampons peuvent extraire Ca 2+ de l&#39;alginate et liquéfier le noyau. La liquéfaction du noyau alginate offre un espace à l&#39;intérieur des capsules pour le mouvement cellulaire et la croissance. Les cellules encapsulées dans de l&#39;alginate polyanionique avec polycationique poly-L-lysine (APL) sont imperméables pour des immunoglobulines mais ont afflux d&#39;éléments nutritifs et l&#39;efflux de toxines. Les propriétés de ceux-ci APL permettent long terme survival des cellules encapsulées après transplantation dans génétiquement différents hôtes. Elliott et al. A rapporté la survie de fonctionnement des cellules du pancréas de porc encapsulés dans un patient humain neuf ans après l&#39;implantation 5. techniques d&#39;encapsulation peuvent être classés en microencapsulation (3-800 um) et macroencapsulation (supérieure à 1000 um). Microcapsules sont plus durables que macrocapsules 6. Depuis sa découverte par le Dr Chang et ses collègues en 1964, microencapsulation a été largement utilisé pour l&#39;encapsulation de cellules produisant l&#39;insuline anabolisants, hormones et autres molécules bioactives 7. Ces traitements confrontés à plusieurs défis dans le tissu hôte, y compris la fibrose et la réponse immunitaire 8. Dans un premier temps, les effets secondaires liés à la qualité de biopolymères ont été résolus. Cependant, la transplantation de cellules anabolisants déclenche toujours des effets secondaires, tels que la fibrose, à la suite de l&#39;hormone overproduction à l&#39;extérieur d&#39;une glande spécialisé. Au cours des dernières décennies, l&#39;obésité et le diabète de type 2 a atteint des proportions épidémiques 9. Plus de 30% des personnes adultes dans le monde sont en surpoids et obèses 10. Intra-abdominale (IAB) formation accrue de graisse augmente l&#39;incidence de l&#39;inflammation chronique et favorise le diabète de type 2, les maladies cardiovasculaires, de certains cancers et d&#39;autres pathologies 11-13. Plusieurs éléments de preuve suggèrent que la pathogenèse associée avec de la graisse IAB peut être évitée par les adipocytes spécifiques. Des études récentes ont montré que la transplantation d&#39;adipocytes sous-cutanés dans la région IAB peut améliorer le métabolisme et diminuer la résistance de l&#39;obésité et de l&#39;insuline chez les rongeurs in vivo 14. Une réduction efficace de la résistance de l&#39;obésité et de l&#39;insuline a été associé à adipocytes thermogénique capables de dissiper l&#39;énergie sous forme de chaleur de 15,16. Modification thermogénique des adipocytes peut être obtenue par transfection stabledes gènes participant à la désolidarisation de protons mitochondrial, comme la protéine de découplage 1 (Ucp1) ou de gènes régulant l&#39;expression de gènes et d&#39;autres Ucp1 thermogénique 15,16. Nos études récentes ont montré que la déficience en aldéhyde déshydrogénase 1 a1 (aldh1a1) conduit à la rénovation de Iab graisse thermogénique qui réduit l&#39;obésité et la résistance à l&#39;insuline chez ces souris 17,18. Notamment, l&#39;encapsulation des thermogénique aldh1a1 déficient (aldh1a1 - / -) préadipocytes médiatise même effet thérapeutique dans IAB graisse chez les souris de type sauvage obèses, ce qui suggère de nouvelles possibilités thérapeutiques pour le traitement de l&#39;IAB graisses 18. Dans les paramètres expérimentaux, des cellules encapsulées permettent aux chercheurs d&#39;étudier les effets des populations de cellules spécifiques dans une manière rentable 19. Ici, nous discutons du procédé d&#39;encapsulation d&#39;une lignée cellulaire catabolique thermogénique et son laboratoire et l&#39;application thérapeutique dans un modèle de souris de l&#39;obésité. Le protocole décrit tphases ROIS pour la production de microcapsules (figure 1): la formation des microbilles d&#39;alginate (Figure 1A), la formation de la polycationique poly-L-lysine (PLL) de membranes à la surface des microbilles (figure 1B), et l&#39;enlèvement de la alginate noyaux (Figure 1C).

<table><tbody><tr><td>Dispositif d’encapsulation (VAR V1)</td><td>Nisco</td><td>LIN-0042</td><td>Aucun</td></tr><tr><td>KD scientific Pousse-seringue</td><td>KD scientific</td><td>780100Y</td><td>Aucun</td></tr><tr><td>Microscope Olympus&nbsp ;</td><td>Olympus Optical</td><td>IX70-S8F2</td><td>Aucun</td></tr><tr><td>Alginate de sodium</td><td>Sigma</td><td>MKBP8122V</td><td>Aucun Bromhydrate</td></tr><tr><td>de poly-L-lysine (PLL)</td><td>Sigma</td><td>020M5006V</td><td>Aucun</td></tr><tr><td>Chlorure</td><td>de calcium Sigma</td><td>SLBJ2662V</td><td>Aucun</td></tr><tr><td>Citrate de sodium tribasique dihydraté</td><td>Sigma</td><td>030M0200</td><td>Aucun</td></tr><tr><td>Chlorure de sodium</td><td>Sigma</td><td>SLBD2595V</td><td>Aucun</td></tr><tr><td>Mini-PROTEAN TGX Gels</td><td>Bio-Rad</td><td>456-1093</td><td>Aucun</td></tr><tr><td>Anticorps primaire ATGL (de lapin)</td><td>Signalisation cellulaire</td><td>2138S</td><td>Aucun</td></tr><tr><td>Anticorps secondaire (anti lapin)</td><td>LI-COR</td><td>926-68071</td><td>Aucun Tampon</td></tr> de <tr><td>dosage par radio-immunoprécipitation (RIPA)</td><td>Boston BioProducts</td><td>D25Y6Z</td><td>Aucun</td></tr><tr><td>Tampon phosphate solution saline (PBS)</td><td>Sigma</td><td>RNBD2893</td><td>None</td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>Gibco</td><td>25200-056</td><td>Aucun</td></tr><tr><td>Cortizone 10 Pommade anti-démangeaisons</td><td>Cortizone 10</td><td>C4029138</td><td>Aucun</td></tr><tr><td>Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM)</td><td>Gibco</td><td>11965-092</td><td>Aucun</td></tr><tr><td>Sérum de veau nouveau-né (CS)</td><td>Sigma</td><td>N4762</td><td>Aucun</td></tr><tr><td>Sérum de veau fœtal (FBS)</td><td>Sigma</td><td>F4135</td><td>Aucun</td></tr><tr><td>3-Isobutyl-1-méthylxanthine (IBMX)</td><td>Sigma</td><td>I0516</td><td>Aucun</td></tr><tr><td>Dexaméthasone</td><td>Sigma</td><td>D4902</td><td>Aucun</td></tr><tr><td>Insuline (bovine)</td><td>Sigma</td><td>I5879</td><td>Aucun</td></tr><tr><td>Inhibiteur de protéase comprimés</td><td>cocktail Roche</td><td>4693159001</td><td>Aucun</td></tr></tbody></table> Aucun

encapsulation thermogénique préadipocytes pour la transplantation dans dépôts de tissu adipeux

Encapsulation Thermogenic Preadipocytes for Transplantation into Adipose Tissue Depots

Cellule encapsulation est développé pour piéger des cellules viables dans des membranes semi-perméables. Les cellules encapsulées greffées peuvent échanger des metabolites de faible poids moléculaire dans les tissus de l&#39;hôte traité pour obtenir une survie à long terme. La membrane semi-perméable permet greffé cellules encapsulées pour éviter le rejet par le système immunitaire. Le procédé d&#39;encapsulation a été conçu pour permettre une libération contrôlée de composés bioactifs, tels que l&#39;insuline, des hormones et d&#39;autres cytokines. Nous décrivons ici un procédé pour l&#39;encapsulation de cellules cataboliques, qui consomment des lipides pour la production de chaleur et de dissipation d&#39;énergie (thermogenèse) dans le tissu adipeux intra-abdominale de souris obèses. Encapsulation de cellules cataboliques thermogénique peut être potentiellement applicable à la prévention et au traitement de l&#39;obésité et le diabète de type 2. Une autre application potentielle de cellules cataboliques peut inclure la désintoxication d&#39;alcools ou d&#39;autres métabolites toxiques et des polluants environnementaux.

La figure 1 montre que chaque étape de la production de microbilles peut être contrôlé au microscope. La figure 2A montre comment la co-culture des adipocytes avec une monocouche de cellules encapsulées. La figure 2B est un exemple représentatif d&#39;une étude quantitative utilisant des adipocytes / microcapsules co-cultures que ont été décrits dans la section 5. lysats des adipocytes ont été analysés en Western blot. Des cellules encapsulées sont analysés dans cette e...

Ici, nous présentons un protocole d’encapsulation des cellules cataboliques, qui consomment des lipides pour la production de chaleur dans le tissu adipeux intra-abdominal et augmentent la dissipation d’énergie chez les souris obèses.

Encapsulation thermogénique préadipocytes pour la transplantation dans dépôts de tissu adipeux

Cell encapsulation was developed to entrap viable cells within semi-permeable membranes. The engrafted encapsulated cells can exchange low molecular ...

L'objectif général de cette procédure est de démontrer l'encapsulation d'une lignée cellulaire catabolique thermogénique et ses applications in vitro, et potentiellement in vivo. Pour commencer cette procédure, préparez une suspension cellulaire d'alginate de sodium et transférez-la dans une seringue de cinq millilitres. L'étape suivante consiste à utiliser un dispositif d'encapsulation pour produire les microbilles d'alginate.Les microbilles sont ensuite recouvertes d'une solution de poly-L-lysine polycationique, puis le cœur d'alginate est éliminé afin de former une membrane semi-perméable autour d'une suspension cellulaire. La dernière étape consiste à co-cultiver les cellules encapsulées avec d'autres lignées cellulaires ou à les injecter dans les tissus adipeux de souris. En fin de compte, une analyse sanguine immunitaire révèle une activité lipolytique plus élevée dans les adipocytes co-cultivés avec une microcapsule contenant un adipocyte déficient en aldehyde déshydrogénase.Bien qu'une immunohistochimie montre un succès du greffage de cellules encapsulées dans les tissus adipeux de souris, cette méthode peut fournir des informations sur la thermogenèse et le tissu apus. Elle peut également être appliquée à d'autres modèles animaux existants afin de proposer un système modèle expérimental peu coûteux pour tester in vivo des sous-ensembles cellulaires. Pour les découvertes biomédicales, toutes les procédures doivent être réalisées dans une hotte de sécurité biologique de niveau deux à flux laminaire.Pour commencer, retirez le milieu ancien du flacon de culture cellulaire et rincez les préadipocytes avec 10 millilitres de PBS. Éliminez le PBS et remettez les cellules en suspension dans deux millilitres de trypsine 0,25 % EDTA. Prélevez un aliquot de 10 microlitres à partir de la suspension cellulaire et comptez les cellules à l’aide d’un hémocytomètre.Suivant les instructions du fabricant, ajouter du DMEM aux cellules restantes afin d'obtenir la quantité idéale de cellules, puis centrifuger à 480 ×g à température ambiante pendant cinq minutes. Après avoir déterminé la quantité de cellules nécessaire conformément aux indications du protocole, suspendre le culot cellulaire dans un volume approprié d'une solution de réseau d'alginate de sodium à 2 %. Transférer la solution cellulaire d'alginate de sodium dans une seringue de cinq millilitres.Retirez toutes les bulles d'air présentes dans la solution et retournez la seringue afin de créer une poche d'air d'un millilitre. Pour préparer l'encapsulation, placez un petit bécher contenant 144 millilitres d'une solution de chlorure de calcium à 100 millimolaire. Sous le bec verseur de l'aiguille du dispositif d'encapsulation, fixez l'électrode à l'élément à encapsuler, avec la pointe située à environ 2,5 centimètres au-dessus de la surface de la solution de chlorure de calcium.Placer la seringue contenant la solution cellulaire d'alginate de sodium fermement dans la pompe à seringue. Fixer le tube en caoutchouc à l'orifice de la seringue. Pousser le piston jusqu'à ce que la solution cellulaire d'alginate de sodium pénètre à mi-chemin dans le tube.Réglez la tension à 5,4 kilovolts et le diamètre à 12,06 millimètres sur la pompe à seringue. Ajustez la vitesse à trois millilitres par heure. Démarrez la pompe, activez l'encapsulation et maintenez la tension à 5,4 kilovolts.Fermez la fenêtre de la hotte et évitez tout mouvement inutile jusqu'à ce que la formation des microbilles d'alginate soit terminée. Une fois que toute la solution a traversé l'aiguille, laissez durcir les microbilles sphériques d'alginate dans la solution de chlorure de calcium pendant 20 minutes supplémentaires avant de les enrober de polylysine polyanionique ou PLL. Lorsque les microbilles sphériques de cellules à base d'alginate de sodium sont complètement solidifiées, retirez le bécher contenant les microbilles de l'appareil d'encapsulation.Transférez les microbilles dans un tube de centrifugation de 50 millilitres. Retirez la solution de chlorure de calcium du culot de microbilles. Lavez les microbilles en ajoutant 30 millilitres d'une solution de chlorure de sodium à 0,9 % et en agitant doucement le tube à la main.Laisser les microbilles précipiter par gravité. Ensuite, utiliser une pipette de 25 millilitres pour éliminer la solution de chlorure de sodium de cette manière. Laver les microbilles un total de trois fois.Ensuite, ajoutez la solution de PLL à 0,05 % aux microbilles. Utilisez 10 millilitres de solution de PLL pour chaque millilitre de solution d'alginate de sodium. Agitez au vortex à 1 000 tours par minute pendant 10 minutes, ce qui est généralement suffisant pour le revêtement par le PLL.Après avoir confirmé la formation du revêtement de PLL, retirez la solution de PLL et lavez les capsules trois fois avec une solution de chlorure de sodium à 0,9 %, comme indiqué précédemment. Pour éliminer d'abord le noyau alternatif des microbilles revêtues de PLL, ajoutez 30 millilitres d'une solution de citrate de sodium à 50 millimolaire dans le tube de 50 millilitres. Attendez cinq minutes ou jusqu'à ce que tout l'alginate de sodium soit dissous. Lavez ensuite les capsules trois fois avec une solution de chlorure de sodium à 0,9 %, comme indiqué précédemment.Après le troisième lavage avec 20 millilitres de milieu de culture transférés dans le tube, transférez toutes les capsules contenant les cellules dans un flacon de culture cellulaire et manipulez les cellules encapsulées dans des conditions standard de culture cellulaire. Les cellules hôtes pour cette procédure doivent être cultivées dans des plaques de 24 puits jusqu’à confluence. Utilisez un milieu de culture contenant des facteurs de croissance pour fibroblastes préparé comme décrit dans le protocole associé.Texte pour la culture de préadipocytes. Transférez les microcapsules dans la plaque 24 puits contenant les cellules hôtes confluentes, ajoutez les microcapsules afin d’obtenir une monocouche dans chaque puits, puis induisez la différenciation des préadipocytes à l’aide du milieu de différenciation. Incubez pendant 48 heures.Après 48 heures, changer le milieu en milieu de différenciation.Milieu. Deux, remplacer le milieu par du milieu de différenciation.Milieu.Deux frais. Toutes les 48 heures, les protéines provenant des cellules seront analysées par immunotransfert western.Chaque étape de la production de microbilles peut être observée au microscope. Une microbille d'alginate est présentée à un grossissement de 20 x. Avant le revêtement au PLL, après marquage au PLL et après dissolution du cœur de gélatine, dans une étude quantitative, l'expression de la lipase triglycéride adipeuse, ou A TGL, a été comparée entre trois T trois L un adipocytes cultivés en co-culture avec des microcapsules acellulaires de type sauvage ou contenant des adipocytes déficients en aldehyde déshydrogénase une A un.L'expression plus élevée d'une A TGL dans les adipocytes co-cultivés avec un L DH un A un adipocyte déficient contenant des microcapsules indique une activité lipolytique plus importante. Dans une étude in vivo, des cellules encapsulées marquées par la GFP ont été injectées dans le dépôt de graisse intra-abdominale de souris. Quatre-vingts jours plus tard, le bourrelet graisseux injecté présentait des agrégats décolorés de cellules encapsulées.Une coupe incluse dans la paraffine du dépôt de graisse intra-abdominale, colorée à l'hématoxyline et à l'éosine, montre des agrégats de microcapsules implantées contenant des cellules encapsulées ainsi que des adipocytes de l'hôte. La même section analysée en lumière fluorescente révèle des cellules transplantées marquées au GFP à l'intérieur de microcapsules sphériques intactes. L'expression du GFP constitue également un indicateur de la viabilité cellulaire après son développement.Cette technique d'encapsulation a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine des maladies métaboliques pour explorer d'éventuels traitements contre l'obésité, la résistance à l'insuline dans le diabète de type deux, l'inflammation, le cancer et les organismes modèles.

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Préadipocytes primaires blanches isolées à partir de tissus adipeux blancs chez la souris peuvent être différenciées en cellules beige / brite. Présenté ici est un système modèle cellulaire fiable pour étudier la régulation moléculaire de "brunissement" de graisse blanche.

L&#39;isolement et la différenciation des cellules stromales vasculaires de cellules Beige / Brite

La différenciation des adipocytes blancs et beiges de tissu adipeux progéniteurs vasculaire porte le potentiel d’amélioration métabolique dans l’obésité. Les auteurs décrivent des protocoles pour un CD34 + CD31 + isolation de cellules endothéliales de la graisse humaine ainsi qu’un subséquent in vitro de l’expansion et la différenciation en adipocytes blancs et beiges. Plusieurs applications en aval sont discutées.

Isolement, Expansion et adipocytaire Induction de CD34 + CD31 + des cellules endothéliales du tissu adipeux humain épiploïques et sous-cutanée

Ici, nous présentons la micro-fragmentation sans enzyme s'adipeux humain à l'aide d'un dispositif système fermé. Cette nouvelle méthode permet l'obtention de grappes de tissus adipeux sous-millimétriques adaptées à la transplantation in vivo, à la culture in vitro et à l'isolement et à la caractérisation des cellules.

Micro-fragmentation humaine des tissus adipeux pour le phénotypage cellulaire et la caractérisation du secretome

Nous présentons une méthode simple pour isoler les cellules progénitrices adipeuses hautement viables des tampons graisseux épididymaux de souris utilisant le tri cellulaire activé par fluorescence.

Préparation des cellules progénitrices adipeuses à partir de tissus adipeux épididymaux de souris

Ce rapport décrit un protocole pour l’isolement simultané des preadipocytes bruns et blancs primaires des souris nouveau-nées. Les cellules isolées peuvent être cultivées en culture et induites pour se différencier en adipocytes blancs et bruns complètement matures. La méthode permet la caractérisation génétique, moléculaire et fonctionnelle des cellules graisseuses primaires en culture.

Isolement et différenciation des préadipocytes primaires blancs et bruns de souris nouveau-nées

Cette méthode de transplantation d’îlots couverts de graisse convient à la détection des îlots greffés dans la cavité intrapéritonéale. Notamment, il ne nécessite pas l’utilisation d’agents bioliants ou de suture.

Transplantation d’îlots pancréatiques couverts de graisse à l’aide de tissu adipeux blanc épididymaire

Les préadipocytes sont isolés de la fraction vasculaire stromale du tissu adipeux brun interscapulaire de souris nouveau-nées et différenciés en cellules qui accumulent des gouttelettes lipidiques, expriment des marqueurs moléculaires et montrent la morphologie mitochondriale des adipocytes bruns matures. Ces cellules sont analysées par immunofluorescence et microscopie électronique à transmission.

Différenciation et imagerie des adipocytes bruns de la fraction vasculaire stromale du tissu adipeux interscapulaire de souris nouveau-nées

Ce protocole décrit l’isolement semi-automatisé de la fraction vasculaire stromale (SVF) du tissu adipeux murin pour obtenir des préadipocytes et obtenir une différenciation adipocytaire in vitro. L’utilisation d’un dissociateur tissulaire pour la digestion de la collagénase réduit la variation expérimentale et augmente la reproductibilité.

Isolement semi-automatisé de la fraction vasculaire stromale à partir de tissu adipeux blanc murin à l’aide d’un dissociateur tissulaire

Ici, nous décrivons un protocole pour isoler, cultiver et phénotyper des cellules endothéliales microvasculaires à partir de tissu adipeux sous-cutané humain (hSATMVECs). De plus, nous décrivons un modèle expérimental de diaphonie hSATMVEC-adipocyte.

Étude de la diaphonie entre les cellules endothéliales adipeuses adipeuses et les adipocytes dans le tissu adipeux sous-cutané humain

La taille et la fragilité des adipocytes matures ont limité les techniques et les outils disponibles pour leur étude et leur isolement. Ici, un protocole est décrit pour l’isolement des adipocytes murins matures, qui peuvent être facilement adaptés à différents dépôts adipeux et régimes alimentaires de souris.

Isolement et culture d’adipocytes murins primaires à partir de souris maigres et obèses

Découvrez l'encapsulation de cellules thermogéniques cataboliques pour la recherche sur l'obésité chez la souris. Cette méthode utilise des microbilles d'alginate pour améliorer la dissipation énergétique in vivo.

Encapsulation thermogénique préadipocytes pour la transplantation dans dépôts de tissu adipeux

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