Encapsulation thermogénique préadipocytes pour la transplantation dans dépôts de tissu adipeux

L'objectif général de cette procédure est de démontrer l'encapsulation d'une lignée cellulaire catabolique thermogénique et ses applications in vitro, et potentiellement in vivo. Pour commencer cette procédure, préparez une suspension cellulaire d'alginate de sodium et transférez-la dans une seringue de cinq millilitres. L'étape suivante consiste à utiliser un dispositif d'encapsulation pour produire les microbilles d'alginate.

Les microbilles sont ensuite recouvertes d'une solution de poly-L-lysine polycationique, puis le cœur d'alginate est éliminé afin de former une membrane semi-perméable autour d'une suspension cellulaire. La dernière étape consiste à co-cultiver les cellules encapsulées avec d'autres lignées cellulaires ou à les injecter dans les tissus adipeux de souris. En fin de compte, une analyse sanguine immunitaire révèle une activité lipolytique plus élevée dans les adipocytes co-cultivés avec une microcapsule contenant un adipocyte déficient en aldehyde déshydrogénase.

Bien qu'une immunohistochimie montre un succès du greffage de cellules encapsulées dans les tissus adipeux de souris, cette méthode peut fournir des informations sur la thermogenèse et le tissu apus. Elle peut également être appliquée à d'autres modèles animaux existants afin de proposer un système modèle expérimental peu coûteux pour tester in vivo des sous-ensembles cellulaires. Pour les découvertes biomédicales, toutes les procédures doivent être réalisées dans une hotte de sécurité biologique de niveau deux à flux laminaire.

Pour commencer, retirez le milieu ancien du flacon de culture cellulaire et rincez les préadipocytes avec 10 millilitres de PBS. Éliminez le PBS et remettez les cellules en suspension dans deux millilitres de trypsine 0,25 % EDTA. Prélevez un aliquot de 10 microlitres à partir de la suspension cellulaire et comptez les cellules à l’aide d’un hémocytomètre.

Suivant les instructions du fabricant, ajouter du DMEM aux cellules restantes afin d'obtenir la quantité idéale de cellules, puis centrifuger à 480 ×g à température ambiante pendant cinq minutes. Après avoir déterminé la quantité de cellules nécessaire conformément aux indications du protocole, suspendre le culot cellulaire dans un volume approprié d'une solution de réseau d'alginate de sodium à 2 %. Transférer la solution cellulaire d'alginate de sodium dans une seringue de cinq millilitres.

Retirez toutes les bulles d'air présentes dans la solution et retournez la seringue afin de créer une poche d'air d'un millilitre. Pour préparer l'encapsulation, placez un petit bécher contenant 144 millilitres d'une solution de chlorure de calcium à 100 millimolaire. Sous le bec verseur de l'aiguille du dispositif d'encapsulation, fixez l'électrode à l'élément à encapsuler, avec la pointe située à environ 2,5 centimètres au-dessus de la surface de la solution de chlorure de calcium.

Placer la seringue contenant la solution cellulaire d'alginate de sodium fermement dans la pompe à seringue. Fixer le tube en caoutchouc à l'orifice de la seringue. Pousser le piston jusqu'à ce que la solution cellulaire d'alginate de sodium pénètre à mi-chemin dans le tube.

Réglez la tension à 5,4 kilovolts et le diamètre à 12,06 millimètres sur la pompe à seringue. Ajustez la vitesse à trois millilitres par heure. Démarrez la pompe, activez l'encapsulation et maintenez la tension à 5,4 kilovolts.

Fermez la fenêtre de la hotte et évitez tout mouvement inutile jusqu'à ce que la formation des microbilles d'alginate soit terminée. Une fois que toute la solution a traversé l'aiguille, laissez durcir les microbilles sphériques d'alginate dans la solution de chlorure de calcium pendant 20 minutes supplémentaires avant de les enrober de polylysine polyanionique ou PLL. Lorsque les microbilles sphériques de cellules à base d'alginate de sodium sont complètement solidifiées, retirez le bécher contenant les microbilles de l'appareil d'encapsulation.

Transférez les microbilles dans un tube de centrifugation de 50 millilitres. Retirez la solution de chlorure de calcium du culot de microbilles. Lavez les microbilles en ajoutant 30 millilitres d'une solution de chlorure de sodium à 0,9 % et en agitant doucement le tube à la main.

Laisser les microbilles précipiter par gravité. Ensuite, utiliser une pipette de 25 millilitres pour éliminer la solution de chlorure de sodium de cette manière. Laver les microbilles un total de trois fois.

Ensuite, ajoutez la solution de PLL à 0,05 % aux microbilles. Utilisez 10 millilitres de solution de PLL pour chaque millilitre de solution d'alginate de sodium. Agitez au vortex à 1 000 tours par minute pendant 10 minutes, ce qui est généralement suffisant pour le revêtement par le PLL.

Après avoir confirmé la formation du revêtement de PLL, retirez la solution de PLL et lavez les capsules trois fois avec une solution de chlorure de sodium à 0,9 %, comme indiqué précédemment. Pour éliminer d'abord le noyau alternatif des microbilles revêtues de PLL, ajoutez 30 millilitres d'une solution de citrate de sodium à 50 millimolaire dans le tube de 50 millilitres. Attendez cinq minutes ou jusqu'à ce que tout l'alginate de sodium soit dissous. Lavez ensuite les capsules trois fois avec une solution de chlorure de sodium à 0,9 %, comme indiqué précédemment.

Après le troisième lavage avec 20 millilitres de milieu de culture transférés dans le tube, transférez toutes les capsules contenant les cellules dans un flacon de culture cellulaire et manipulez les cellules encapsulées dans des conditions standard de culture cellulaire. Les cellules hôtes pour cette procédure doivent être cultivées dans des plaques de 24 puits jusqu’à confluence. Utilisez un milieu de culture contenant des facteurs de croissance pour fibroblastes préparé comme décrit dans le protocole associé.

Texte pour la culture de préadipocytes. Transférez les microcapsules dans la plaque 24 puits contenant les cellules hôtes confluentes, ajoutez les microcapsules afin d’obtenir une monocouche dans chaque puits, puis induisez la différenciation des préadipocytes à l’aide du milieu de différenciation. Incubez pendant 48 heures.

Après 48 heures, changer le milieu en milieu de différenciation.Milieu. Deux, remplacer le milieu par du milieu de différenciation.Milieu.Deux frais. Toutes les 48 heures, les protéines provenant des cellules seront analysées par immunotransfert western.

Chaque étape de la production de microbilles peut être observée au microscope. Une microbille d'alginate est présentée à un grossissement de 20 x. Avant le revêtement au PLL, après marquage au PLL et après dissolution du cœur de gélatine, dans une étude quantitative, l'expression de la lipase triglycéride adipeuse, ou A TGL, a été comparée entre trois T trois L un adipocytes cultivés en co-culture avec des microcapsules acellulaires de type sauvage ou contenant des adipocytes déficients en aldehyde déshydrogénase une A un.

L'expression plus élevée d'une A TGL dans les adipocytes co-cultivés avec un L DH un A un adipocyte déficient contenant des microcapsules indique une activité lipolytique plus importante. Dans une étude in vivo, des cellules encapsulées marquées par la GFP ont été injectées dans le dépôt de graisse intra-abdominale de souris. Quatre-vingts jours plus tard, le bourrelet graisseux injecté présentait des agrégats décolorés de cellules encapsulées.

Une coupe incluse dans la paraffine du dépôt de graisse intra-abdominale, colorée à l'hématoxyline et à l'éosine, montre des agrégats de microcapsules implantées contenant des cellules encapsulées ainsi que des adipocytes de l'hôte. La même section analysée en lumière fluorescente révèle des cellules transplantées marquées au GFP à l'intérieur de microcapsules sphériques intactes. L'expression du GFP constitue également un indicateur de la viabilité cellulaire après son développement.

Cette technique d'encapsulation a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine des maladies métaboliques pour explorer d'éventuels traitements contre l'obésité, la résistance à l'insuline dans le diabète de type deux, l'inflammation, le cancer et les organismes modèles.