Utilisation de cellules Caco-2 à étudier Lipid Transport par l'intestin

L’objectif général de cette procédure est d’étudier le transport des molécules liposolubles par l’intestin. Pour ce faire, il suffit de placer d’abord des cellules caco two différenciées dans la membrane perméable. Insérer. Ensuite, les cellules Caco Two sont incubées avec un mélange de lipides et la sécrétion de lipoprotéines est stimulée.

Ensuite, les lipoprotéines sont isolées à l’aide de l’ultracentrifugation à gradient de densité de chlorure de sodium. Enfin, les lipoprotéines isolées sont colorées négativement à l’acide phosphotoïque. En fin de compte, l’analyse granulométrique est utilisée pour montrer l’abondance relative des chylomicrons par rapport aux lipoprotéines de très basse densité.

Bien que cette méthode puisse fournir des informations sur le transport des lipides alimentaires par l’intestin, elle peut également être appliquée à d’autres systèmes tels que la détermination de la biodisponibilité des lipics oraux. Après avoir mis en œuvre la surexpression des gènes et surveillé selon le protocole de texte, maintenez les deux cellules KCO qui soutiennent la surexpression des gènes. À l’aide de cellules qui ont atteint 50 à 70 % de confluence, divisez les cellules de un à six en ajoutant trois millilitres de 0,05 % de trypsine 0,53, un DTA millimolaire A, et en incubant à 37 degrés Celsius jusqu’à ce que les cellules se soient détachées, pipetez doucement les cellules plusieurs fois pour éviter l’agglutination.

Ensuite, après avoir transféré 0,5 millilitres de cellules dans la chambre apicale ou supérieure d’une membrane perméable, insérez contenant 10 millilitres de milieu de croissance préchauffé. Ajouter 10 millilitres de milieu de croissance chaud dans la chambre latérale paso inférieure. Secouez doucement la vaisselle plusieurs fois en avant et en arrière.

Évitez de faire tourner les plats car cela pourrait entraîner une dispersion cellulaire inégale. Placez les plats sur une surface plane dans un incubateur à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone. Un jour plus tard, changez de milieu de culture et continuez à changer de milieu selon le protocole de texte.

Préparez un mélange de 100 x lipides en ajoutant 900 microlitres de PBS à 50 milligrammes de vortex d’acide oléique. Le mélange transfère vigoureusement tout le mélange d’acide oléique dans un tube contenant 40 milligrammes de Han et 48 milligrammes de tarot de sodium. Dissoudre le mélange lipidique par un vortex vigoureux.

Ajoutez les 900 microlitres de mélange lipidique à 89,1 millilitres de milieu de croissance et mélangez la solution filtrée pour les concentrations finales dans le milieu indiqué ici. À l’aide de caco 13 jours après le confluent, deux cellules se sont développées sur des inserts membranaires perméables. Ajoutez 10 millilitres de milieu contenant des lipides à la chambre apicale et 10 millilitres de milieu de croissance à la chambre latérale basale.

Incuber pendant quatre heures à 37 degrés Celsius avant de prélever le milieu contenant des lipoprotéines dans la chambre basolatérale. Pour isoler les lipoprotéines, retirez les débris cellulaires du milieu contenant les lipoprotéines en les centrifugant à 2000 fois G pendant cinq minutes. Décanter le milieu dans un tube de 50 millilitres, puis ajouter 5,95 grammes de chlorure de sodium, et en cas d’analyse par microscopie électronique à transmission ou MET, ajouter un comprimé inhibiteur de protéase.

Utilisez de l’eau pour porter le volume à 23 millilitres et dissoudre complètement les solutés. Ensuite, décantez la solution dans un tube d’ultracentrifugation en polycarbonate. Utilisez 0,5 millilitre d’eau pour superposer doucement la solution de densité de 1,2 gramme par millilitre.

Équilibrez ensuite le tube en fonction du poids. Chargez les tubes dans un rotor T 8 65 et effectuez une ultracentrifugation à 429, 460 fois G et quatre degrés Celsius pendant 24 heures. Ensuite, tout en gardant le tube aussi immobile que possible, isolez immédiatement les 0,5 millilitres supérieurs de solution.

Pour effectuer une analyse TEM, préparez cinq millilitres d’acide phosphotoïque à 2 % et ajustez à pH 6,0. À l’aide d’un filtre à seringue d’une taille de pores de 0,2 micromètre, filtrez la solution. Déposez 20 microlitres de l’échantillon de lipoprotéines sur une boîte stérile.

Déposez ensuite 20 microlitres d’acide phosphotoïque filtré à côté de l’échantillon sur la même parabole, le côté émoussé vers l’échantillon. Déposez doucement une grille EM sur la goutte de lipoprotéines et incubez à température ambiante pendant une minute. Ensuite, tapotez doucement le côté de la grille sur un papier filtre pour retirer l’excès d’échantillon de la grille.

Ensuite, déposez doucement la grille avec le même côté reposant sur la goutte d’acide de langue phospho et incubez pendant une minute avant de tapoter doucement la grille sur du papier filtre pour éliminer l’excès de solution. Enfin, effectuez une MET pour capturer des images de lipoprotéines. On voit ici des cellules normales 13 jours après le confluent de kco deux présentant des structures en forme de dôme et des gouttelettes lipidiques intracellulaires caractéristiques des cellules différenciées de caco deux.

À ce stade, un nouveau milieu doit être ajouté doucement car les cellules sont plus sensibles au détachement. En utilisant la méthode d’ultracentrifugation par gradient de densité de chlorure de sodium, les lipoprotéines sécrétées par les cellules caco two ont été isolées et analysées par TEM. Certains des chylomicrons, qui sont des lipoprotéines de plus de 80 nanomètres de diamètre, sont représentés ici.

Des LDL v plus petits sont également présents. Un pourcentage élevé de particules de chylomicron par rapport au nombre total de particules de lipoprotéines indique un transport efficace des lipides après son développement. Cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine des sciences pharmaceutiques pour explorer plus largement la biodisponibilité des médicaments lipophiles oraux.