Isolement physique des Endospores partir d'échantillons environnementaux par ciblé lyse des cellules végétatives

L’objectif global de cette procédure est de séparer les endospores bactériennes des échantillons complexes de communautés microbiennes, tels que les sédiments. Cette méthode permet de répondre à des questions clés dans le domaine de la microbiologie sur la présence et l’abondance d’endospores dans les échantillons naturels. Il est basé sur une différence de résistance entre les endospores et les cellules végétatives vis-à-vis des produits chimiques et de la chaleur. Le principal avantage de cette technique est qu’elle n’est pas destructive pour les endospores, ce qui permet de les utiliser pour des expériences en aval telles que la culture, la quantification et les tests métaboliques.

Bien que nous ayons conçu cette méthode pour travailler avec l’écologie des bactéries formant des endospores, elle peut également être utilisée dans des domaines tels que l’exobiologie ou l’industrie alimentaire, dans lesquels les spores peuvent être bénéfiques ou nuisibles. Après avoir préparé les solutions et l’équipement conformément au protocole textuel, sous une enceinte de biosécurité stérilisée aux UV, utilisez des cuillères en métal flammé à l’éthanol pour ajouter trois grammes d’échantillon de sédiments dans des tubes stériles de 50 millilitres pré-pesés. À l’aide d’une burette stérile et graduée, ajoutez 15 millilitres d’une solution stérile d’hexamétaphosphate de sodium à 1 % ou SHMP filtrée à l’échantillon.

À l’aide d’un disperseur ou d’un homogénéisateur de liquide et d’un rotor de dispersion stérile, homogénéisez l’échantillon à 17 500 tr/min pendant une minute. Laissez reposer l’échantillon pendant deux minutes et répétez l’homogénéisation. Laissez reposer l’échantillon pendant 10 minutes pour que les particules les plus lourdes se déposent.

Transférez le surnageant contenant la biomasse cellulaire dans un tube propre de 50 millilitres, en prenant soin de ne pas déranger la pastille. Ajouter une autre aliquote de 15 millilitres de SHMP à la pastille sédimentée et répéter l’homogénéisation avant de recueillir le surnageant et de le combiner avec la première aliquote. Centrifugez l’échantillon à 20 fois G pendant une minute et transférez le surnageant dans un tube frais de 50 millilitres avant de jeter la pastille.

Une fois que l’unité de filtration et la pompe à vide ont été préparées conformément au protocole textuel, utilisez une flamme d’éthanol pour stériliser la pince afin d’ajouter une membrane de nitrocellulose stérile à l’unité de filtration. Ajoutez la moitié de l’échantillon surnageant qui vient d’être préparé dans l’unité de filtration membranaire et utilisez la pompe à vide pour collecter les cellules sur la membrane. Lorsque le liquide a complètement traversé le filtre, arrêtez la pompe à vide.

À l’aide d’une pince stérilisée, retirez soigneusement la membrane et placez-la dans une boîte de Pétri stérile. Avec un nouveau morceau de membrane stérile, répétez la filtration avec la moitié restante de la solution. Pour séparer les endospores des cellules végétatives dans la biomasse qui vient d’être collectée, décongelez la membrane si elle a été congelée et utilisez des ciseaux stérilisés flammés à l’éthanol pour la couper en petits morceaux.

Transférez les morceaux de membrane dans un tube stérile de deux millilitres et ajoutez 900 microlitres de tampon 1X TE. Mélangez soigneusement par vortex pour libérer la biomasse de la membrane. Incuber le tube à 65 degrés Celsius et 80 tr/min pendant 10 minutes.

Ensuite, retirez le tube de l’incubateur et laissez-le refroidir pendant 15 minutes. Ajoutez 100 microlitres de lysozyme fraîchement préparé à une concentration finale de deux milligrammes par millilitre et incubez l’échantillon à 37 degrés Celsius et 80 RPM pendant 60 minutes pour lyser les cellules végétatives. Une fois la lyse terminée, ajoutez 250 microlitres de 3 hydroxyde de sodium normal et 250 microlitres de solution SDS à 6 % à l’échantillon.

Incuber à température ambiante et à 80 tr/min pendant 60 minutes. Ensuite, préparez une unité de filtration stérile qui contient des membranes de 25 millimètres de diamètre par autoclavage. Une fois l’unité de filtration refroidie, placez une membrane de nitrocellulose de 25 millimètres de diamètre et de 0,2 micromètre dessus.

Ajoutez l’échantillon sur la membrane et utilisez la pompe à vide pour filtrer le liquide, en capturant les endospores sur la membrane, tandis que la matière cellulaire végétative passe à travers. Pour éliminer les détergents résiduels, ajoutez deux millilitres de solution physiologique stérile à la membrane et appliquez la pompe à vide. Lorsque le liquide est complètement filtré, éteignez la pompe et laissez la membrane sur l’unité de filtration.

Pour effectuer le traitement DNase directement sur la membrane, ajoutez 450 microlitres d’eau stérile, 50 microlitres de tampon de réaction 1X DNase et 0,5 microlitre d’enzyme DNase sur la membrane et laissez-la reposer à environ 25 degrés Celsius pendant 15 minutes. L’ADN extracellulaire précédemment libéré des cellules lysées est digéré par voie enzymatique puis lavé. Cela garantit que la préparation finale de l’endospore est exempte d’ADN externe, ce qui est essentiel pour l’analyse en aval telle que l’analyse moléculaire.

Il est important de se rappeler qu’il ne doit pas y avoir de fuite sur l’appareil de filtration et que l’échantillon ne se dessèche pas. Après l’incubation, ajoutez un millilitre de solution physiologique et allumez la pompe pour éliminer l’enzyme résiduelle de l’échantillon. À l’aide d’une pince stérile, transférez la membrane contenant les endospores dans une boîte de Pétri stérile.

Analysez l’échantillon selon le protocole de texte. Le protocole démontré dans cette vidéo de lyse ciblée des cellules végétatives permet d’obtenir un échantillon d’endospores purifié et une augmentation significative de la fraction de firmicutes formant des endospores. Dans le séquençage ampliconique du gène de l’ARN ribosomique 16S, les firmicutes dans les échantillons non traités ne correspondent qu’à 8 à 19 % des séquences.

En revanche, les firmicutes après traitement représentaient 90,6 % et 83,9 % de l’échantillon riche en endosporine. Les deux principaux ordres de firmicutes formant des endospores, les bacillales et les clostridiales, étaient enrichis tandis que les firmicutes non formant des endospores comme les lactobacillales étaient absents. L’efficacité du traitement a également été démontrée à l’aide de cultures pures.

Une préparation d’endospores et une culture de cellules végétatives ont été traitées, toutes les cellules ont été incubées et la croissance a été mesurée à une densité optique de 600 nanomètres. Comme le montre le présent document, une croissance a été observée pour les cultures d’endospores, tandis qu’aucune croissance n’a été observée dans la culture d’E. Coli traitée, ce qui indique que les cellules végétatives sont irréversiblement endommagées. Une fois maîtrisée, et si des solutions et des équipements ont été préparés au préalable, cette technique devrait être réalisée en cinq heures environ.

Il est important de se rappeler d’éviter toute contamination en travaillant dans des conditions stériles et en assurant la stérilité des solutions et de tous les équipements. Après cette procédure, d’autres méthodes telles que la culture, l’isolement et les tests métaboliques peuvent être effectuées afin de répondre à des questions supplémentaires sur l’identification de la souche et le potentiel métabolique des endospores. De plus, l’extraction d’ADN en aval et le séquençage métagénomique peuvent être effectués pour analyser la diversité des espèces et la présence des gènes.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de séparer les endospores des échantillons environnementaux. N’oubliez pas que travailler avec des détergents tels que les SDS peut être extrêmement dangereux. N’oubliez pas de porter un équipement de protection individuelle.