Name: Isolement physique des Endospores partir déchantillons environnementaux par ciblé lyse des cellules végétatives (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-01-21T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 38 s
Description: Découvrez l'isolement physique des endospores bactériennes à partir d'échantillons environnementaux complexes par lyse ciblée des cellules végétatives. Cette méthode non destructive permet des analyses moléculaires et culturales ultérieures.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Les auteurs reconnaissent la National Science Foundation suisse pour Grant No. 31003A-132358/1, 31003A_152972 et n ° 151 948, et Fondation Pierre Mercier Pour la Science.

1. Préparation des produits chimiques et de l&#39;équipement <ol><li> Ajouter 500 ml d&#39;un hexamétaphosphate de sodium à 1% (SHMP) (NaPO 3) n solution et stériliser par autoclavage. </li><li> Stériliser nitrocellulose (NC) filtres (taille de pores de 0,22 um, diamètre 47 mm) par autoclavage en verre fermé des boîtes de Pétri. </li><li> Stériliser les filtres NC (taille de pores 0,22 pm, diamètre 25 mm) à l&#39;autoclave fermé en verre boîtes de Pétri. </li><li> Peser et noter le poids à vide des tubes de 50 ml stériles (avec Cap sur) (un tube par échantillon). </li><li> Préparer Tris-EDTA-tampon (tampon TE) 1x: effectuer solution de Tris 10 mM (tris (hydroxyméthyl) aminométhane de) et le tampon EDTA 1 mM. Ajuster le pH à 8 et stériliser à l&#39;autoclave. </li><li> Préparer la solution de lysozyme (20 mg / ml) en dissolvant 0,02 g de lysozyme dans 1 ml de tampon TE. Idéalement, faire des frais à chaque fois. Conserver à 4 ° C pendant pas plus de 1 semaine. </li><li> Préparer la solution physiologique en dissolvant 8 g / L de chlorure de sodium(NaCl) dans l&#39;eau distillée. Stériliser à l&#39;autoclave. </li></ol> 2. La séparation de la biomasse à partir des sédiments <ol><li> Ajouter 3 g d&#39;échantillon de sédiments pré-pesée stérile tubes de 50 ml à l&#39;aide de boules métalliques éthanol flambé. Effectuez cette dans un endroit propre, stérilisée par UV enceinte de biosécurité pour éviter la contamination. </li><li> Ajouter 15 ml d&#39;une solution stérile (autoclave) solution de SHMP de 1% à l&#39;aide d&#39;un échantillon stérile gradué burette. La solution SHMP peut également être filtré pour éviter la contamination. </li><li> Homogénéiser le sédiment et la solution SHMP avec une dispersion liquide / homogénéisation (par exemple, homogénéisateur Ultra-Turrax). 70% d&#39;éthanol-stériliser à l&#39;autoclave ou le rotor de dispersion avant l&#39;utilisation. Exécutez l&#39;homogénéisation pendant 1 min à 17 500 rpm. Laisser l&#39;échantillon reposer pendant 2 min et répéter l&#39;homogénéisation pendant 1 min à la même vitesse du rotor. </li><li> Laissez l&#39;échantillon reposer pendant 10 min. À cette étape, les particules les plus lourdes (minéraux) se déposent. Les cellules et les composants organiques de l&#39;échantillon cependant wmalades restent en solution. Ensuite, transférer la solution de surnageant (contenant de la biomasse cellulaire) dans un tube de 50 ml propre, tout en prenant soin de ne pas perturber le culot de sédiments. </li><li> Pour le culot de sédiments ajouter encore 15 ml d&#39;une solution stérile (autoclave) solution de SHMP 1% en utilisant une burette graduée stérile. Puis répétez les étapes 2.3 et 2.4. Cette répétition assure la séparation de la quantité maximale des cellules et des particules organiques dans le composant minéral du sédiment. Le surnageant de cette deuxième séparation peut être fusionné avec le surnageant provenant de la première séparation. Remarque: Les étapes suivantes sont toutes effectuées sur le surnageant (contenant la biomasse cellulaire). Le composant minéral (pastille sédiment) peut être mis au rebut. </li><li> Centrifuger l&#39;échantillon à 20 x g pendant 1 min. Cette étape augmente la suffisant pour régler les petites particules minérales force g tandis que le matériau de cellule biologique reste encore en solution. Après centrifugation, transférer la solution de surnageant (contenant de la biomasse cellulaire) dans unpropre tube de 50 ml. Jeter le culot minérale. </li><li> Déterminer le volume final de la solution contenant la biomasse en pesant l&#39;échantillon. La détermination du poids évite d&#39;avoir à transférer l&#39;échantillon dans un cylindre gradué et réduit les risques de contamination. </li></ol> 3. Collection de la biomasse sur le filtre à membrane <ol><li> Préparer unité de filtration (membranes de 47 mm de diamètre) et la pompe à vide. Stériliser l&#39;unité de filtration soit par autoclavage ou (si le verre Pyrex) par pulvérisation avec 70% d&#39;éthanol et enflammé par un bec Bunsen. Laissez-le refroidir avant de continuer avec le protocole. </li><li> Ajouter membrane NC stérile à l&#39;unité de filtration à l&#39;aide de pinces stériles éthanol flambé. </li><li> Ajouter la moitié de l&#39;échantillon de surnageant (de l&#39;étape 2.6) sur l&#39;unité de filtration à membrane et recueillir les cellules sur la membrane en utilisant la pompe à vide. </li><li> Lorsque le liquide est complètement passé à travers le filtre, arrêter la pompe à vide et retirer délicatement la membrane en utilisant Ethanol-flamme pince stérilisée. Placez la membrane dans une boîte de Pétri stérile. <ol><li> Couper la membrane de moitié l&#39;aide de ciseaux stérilisés éthanol flambé. Ajouter chaque moitié de la membrane dans un tube de 2 ml distinct. La moitié de la membrane sera utilisé pour l&#39;extraction et l&#39;analyse de l&#39;ensemble de la communauté bactérienne ADN. L&#39;autre moitié du filtre est stockée à -80 ° C et sert comme une sauvegarde. </li></ol></li><li> Placez nouvelle membrane NC sur l&#39;unité de filtration et de collecter la biomasse à partir de la seconde moitié du volume de l&#39;échantillon (de l&#39;étape 2.6) en utilisant la pompe à vide. </li><li> Lorsque le liquide est complètement passé à travers le filtre, arrêter la pompe à vide et retirer délicatement la membrane en utilisant des pinces stérilisées éthanol flambé. Placer l&#39;ensemble de membrane dans un tube de 2 ml distinct. Cet exemple sera utilisé pour le traitement de séparer les endospores de cellules végétatives. L&#39;échantillon peut être stocké à -20 ° C jusqu&#39;à utilisation. </li></ol> 4. La lyse des cellules végétatives <ol><li> Effectuer latraitement pour séparer les endospores de cellules végétatives sur la biomasse déjà recueillis sur une membrane NC (étape 3.6). <ol><li> Si la membrane a été gelé, le laisser à température ambiante pendant 10 min à décongeler. Ensuite, placez la membrane dans une boîte de Pétri stérile et couper (environ 4 fois) en petits morceaux avec des ciseaux stérilisés éthanol flambé. Ensuite, placer tous les éléments de filtre à membrane dans un tube stérile de 2 ml. </li></ol></li><li> Ajouter 900 pi de 1x TE (Tris-EDTA) tampon (voir 1.5) dans le tube contenant la membrane de l&#39;échantillon et bien mélanger au vortex. A ce stade, la biomasse est enlevée de la membrane dans la solution tampon TE. </li><li> Placer le tube dans un incubateur à 65 ° C pendant 10 min et 80 tours par minute. Ensuite retirer le tube de l&#39;incubateur et le laisser refroidir pendant 15 min. </li><li> Ajouter 100 ul de lysozyme fraîchement préparé (voir 1.5) pour atteindre une concentration finale de 2 mg / ml. Ne pas ajouter le lysozyme avant que l&#39;échantillon est refroidi à 37 ° C, car cela pourrait degRade l&#39;enzyme. </li><li> Incuber l&#39;échantillon à 37 ° C pendant 60 min et 80 tours par minute, les conditions optimales pour le lysozyme pour lyser des cellules végétatives. </li><li> Après la lyse est complète, ajouter 250 ul de 3 N d&#39;hydroxyde de sodium (NaOH) et 250 pi de dodécylsulfate de sodium (SDS) solution à 6% de l&#39;échantillon. En ajoutant cela, le volume d&#39;échantillon de 1,5 ml et atteint il y a une concentration finale de 0,5 N de NaOH et la concentration finale de 1% de SDS. </li><li> Incuber ce mélange à température ambiante pendant 60 min et 80 tours par minute. Ajout de la base et des détergents aidera en finale de la lyse cellulaire. La concentration de ces détergents a été optimisée pour ne pas endommager les endospores, tandis que la lyse des cellules végétatives. </li><li> Préparer une unité de filtration stérile qui contient 25 membranes mm de diamètre à l&#39;autoclave, ou (si le verre Pyrex) pulvérisation d&#39;éthanol à 70% et enflammé par un bec Bunsen. Laissez refroidir. </li><li> Placer une membrane NC 0,2 um (diamètre 25 mm) sur l&#39;unité de filtration en utilisant une pince-éthanol flamme stérilisés. &lt;/ li&gt; <li> Ajouter l&#39;échantillon provenant de l&#39;étape 4.7 sur la membrane et le liquide au moyen d&#39;un filtrage de la pompe à vide. Lorsque le liquide est passé à travers, éteignez la pompe à vide. A cette étape, le matériau cellulaire lysé végétatif est éliminé, car il ne sont pas retenus sur la membrane. Seulement des endospores resteront sur la membrane. </li><li> Ajouter 2 ml de solution physiologique stérile pour laver détergents résiduels et filtrer le liquide en utilisant la pompe à vide. </li><li> Lorsque le liquide est entièrement filtrée, éteignez la pompe à vide. Laisser la membrane de l&#39;unité de filtration. </li></ol> 5. Traitement DNase Remarque: effectuer le traitement à la DNase directement sur la membrane filtrante. Il est important que l&#39;unité de filtration ne fuit pas et la pompe à vide est éteint. <ol><li> Ajouter 450 ul d&#39;eau stérile, 50 ul de tampon de réaction de DNase (1 x) et 0,5 ul de DNase X enzyme directement sur la membrane filtrante et laisser reposer pendant 15 min. Si possible, faire la digestion dans une chambre qui est légèrement guerreRT mer que la moyenne, étant donné que l&#39;enzyme fonctionne mieux à des températures de 25 ° C et au-dessus. Remarque: En gardant le bec Bunsen de côté de l&#39;unité de filtration augmente également la température et a l&#39;avantage supplémentaire de conserver stérile l&#39;environnement, donc réduit le risque de contamination des échantillons. </li><li> Lorsque la digestion de DNase est terminée, tourner sur la pompe à vide pour éliminer l&#39;enzyme de l&#39;échantillon. </li><li> Laver enzyme résiduelle et à filtrer en ajoutant 1 ml de solution physiologique. </li><li> Si du liquide a pleinement réussi, éteignez la pompe à vide et retirer la membrane de filtration contenant des endospores l&#39;aide de pinces stériles et le placer dans une boîte de Pétri stérile. Remarque: L&#39;échantillon d&#39;endospores séparés est maintenant prêt pour l&#39;analyse en aval. Conserver à -20 ° C si utilisé pour l&#39;extraction de l&#39;ADN ou bien à 4 ° C si elle est utilisée pour la germination et la culture. </li></ol>

<ol><li>Nicholson, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Roles+of+Bacillus+endospores+in+the+environment%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">Roles of Bacillus endospores in the environment.</a> Cell Mol Life Sci. 59 (3), 410-416 (2002).</li>
<li>Lester, E. D., Satomi, M., Ponce, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microflora+of+extreme+arid+Atacama+Desert+soils%5BTitle%5D)+AND+%22Soil+Biol+Biochem%22%5BJournal%5D)">Microflora of extreme arid Atacama Desert soils.</a> Soil Biol Biochem. 39 (2), 704-708 (2007).</li>
<li>Wilson, M. S., Siering, P. L., White, C. L., Hauser, M. E., Bartles, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+archaea+and+bacteria+dominate+stable+microbial+communities+in+North+America%27s+Largest+Hot+Spring%5BTitle%5D)+AND+%22Microb+Ecol%22%5BJournal%5D)">Novel archaea and bacteria dominate stable microbial communities in North America's Largest Hot Spring.</a> Microb Ecol. 56 (2), 292-305 (2008).</li>
<li>Hugenholtz, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploring+prokaryotic+diversity+in+the+genomic+era%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Exploring prokaryotic diversity in the genomic era.</a> Genome Biol. 3 (2), (2002).</li>
<li>Onyenwoke, R. U., Brill, J. A., Farahi, K., Wiegel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sporulation+genes+in+members+of+the+low+G%2BC+Gram-type-positive+phylogenetic+branch+%28Firmicutes%29%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Sporulation genes in members of the low G+C Gram-type-positive phylogenetic branch (Firmicutes).</a> Arch Microbiol. 182 (2-3), 182-192 (2004).</li>
<li>Delmont, T. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accessing+the+soil+metagenome+for+studies+of+microbial+diversity%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Environ+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Accessing the soil metagenome for studies of microbial diversity.</a> Appl Environ Microbiol. 77 (4), 1315-1324 (2011).</li>
<li>Ricca, E., Henriques, A. O., Cutting, S. M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRicca%2C+E+%22Bacterial+spore+formers%3A+probiotics+and+emerging+applications%22">Bacterial spore formers: probiotics and emerging applications</a>. , Horizon Bioscience. (2004).</li>
<li>Kuske, C. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small-Scale+DNA+Sample+Preparation+Method+for+Field+PCR+Detection+of+Microbial+Cells+and+Spores+in+Soil%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Environ+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Small-Scale DNA Sample Preparation Method for Field PCR Detection of Microbial Cells and Spores in Soil.</a> Appl Environ Microbiol. 64 (7), 2463-2472 (1998).</li>
<li>von Mering, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+phylogenetic+assessment+of+microbial+communities+in+diverse+environments%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Quantitative phylogenetic assessment of microbial communities in diverse environments.</a> Science. 315 (8515), 1126-1130 (2007).</li>
<li>Wunderlin, T., Junier, T., Roussel-Delif, L., Jeanneret, N., Junier, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stage+0+sporulation+gene+A+as+a+molecular+marker+to+study+diversity+of+endospore-forming+Firmicutes%5BTitle%5D)+AND+%22Environ+Microbiol+Rep%22%5BJournal%5D)">Stage 0 sporulation gene A as a molecular marker to study diversity of endospore-forming Firmicutes.</a> Environ Microbiol Rep. 5 (6), 911-924 (2013).</li>
<li>Siala, A., Hill, I. R., Gray, T. R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Populations+of+spore-forming+bacteria+in+an+acid+forest+soil%2C+with+special+reference+to+Bacillus+subtilis%5BTitle%5D)+AND+%22J+General+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Populations of spore-forming bacteria in an acid forest soil, with special reference to Bacillus subtilis.</a> J General Microbiol. 81 (1), 183-190 (1974).</li>
<li>Brandes Ammann, A., Kolle, L., Brandl, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+bacterial+endospores+in+soil+by+terbium+fluorescence%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Detection of bacterial endospores in soil by terbium fluorescence.</a> Int J Microbiol. , 435281(2011).</li>
<li>Fichtel, J., Koster, J., Rullkotter, J., Saas, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+variations+in+endospore+numbers+within+tidal+flat+sediments+revealed+by+quantification+of+dipicolinic+acid%5BTitle%5D)+AND+%22Geomicrobiol+J%22%5BJournal%5D)">High variations in endospore numbers within tidal flat sediments revealed by quantification of dipicolinic acid.</a> Geomicrobiol J. 25 (7-8), (2008).</li>
<li>Cronin, U. P., Wilkinson, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+potential+of+flow+cytometry+in+the+study+of+Bacillus+cereus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Appl+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The potential of flow cytometry in the study of Bacillus cereus.</a> J Appl Microbiol. 108 (1), 1-16 (2010).</li>
<li>de Rezende, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dispersal+of+thermophilic+Desulfotomaculum+endospores+into+Baltic+Sea+sediments+over+thousands+of+years%5BTitle%5D)+AND+%22ISME+J%22%5BJournal%5D)">Dispersal of thermophilic Desulfotomaculum endospores into Baltic Sea sediments over thousands of years.</a> ISME J. 7 (1), 72-84 (2013).</li>
<li>Hubert, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thermophilic+anaerobes+in+Arctic+marine+sediments+induced+to+mineralize+complex+organic+matter+at+high+temperature%5BTitle%5D)+AND+%22Environ+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Thermophilic anaerobes in Arctic marine sediments induced to mineralize complex organic matter at high temperature.</a> Environ Microbiol. 12 (4), 1089-1104 (2010).</li>
<li>Garbeva, P., van Veen, J. A., van Elsas, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Predominant+Bacillus+spp.+in+agricultural+soil+under+different+management+regimes+detected+via+PCR-DGGE%5BTitle%5D)+AND+%22Microb+Ecol%22%5BJournal%5D)">Predominant Bacillus spp. in agricultural soil under different management regimes detected via PCR-DGGE.</a> Microb Ecol. 45 (3), 302-316 (2003).</li>
<li>Brill, J. A., Wiegel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+between+spore-forming+and+asporogenic+bacteria+using+a+PCR+and+southern+hybridization+based+method%5BTitle%5D)+AND+%22J+Microbiol+Methods%22%5BJournal%5D)">Differentiation between spore-forming and asporogenic bacteria using a PCR and southern hybridization based method.</a> J Microbiol Methods. 31 (1-2), 29-36 (1997).</li>
<li>Rueckert, A., Ronimus, R. S., Morgan, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+real-time+PCR+assay+targeting+the+sporulation+gene%2C+spo0A.%2C+for+the+enumeration+of+thermophilic+bacilli+in+milk+powder%5BTitle%5D)+AND+%22Food+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Development of a real-time PCR assay targeting the sporulation gene, spo0A., for the enumeration of thermophilic bacilli in milk powder.</a> Food Microbiol. 23 (3), 220-230 (2006).</li>
<li>Bueche, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+endospore-forming+firmicutes+by+quantitative+PCR+with+the+functional+gene+spo0A%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Environ+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Quantification of endospore-forming firmicutes by quantitative PCR with the functional gene spo0A.</a> Appl Environ Microbiol. 79 (17), 5302-5312 (2013).</li>
<li>Wunderlin, T., Junier, T., Roussel-Delif, L., Jeanneret, N., Junier, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endospore-enriched+sequencing+approach+reveals+unprecedented+diversity+of+Firmicutes+in+sediments%5BTitle%5D)+AND+%22Environ+Microbiol+Rep%22%5BJournal%5D)">Endospore-enriched sequencing approach reveals unprecedented diversity of Firmicutes in sediments.</a> Environ Microbiol Rep. 6 (6), 631-639 (2014).</li>
<li>Nicholson, W. L., Law, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Method+for+purification+of+bacterial+endospores+from+soils%3A+UV+resistance+of+natural+Sonoran+desert+soil+populations+of+Bacillus+spp.+with+reference+to+B.+subtilis+strain+168%5BTitle%5D)+AND+%22J+Microbiol+Methods%22%5BJournal%5D)">Method for purification of bacterial endospores from soils: UV resistance of natural Sonoran desert soil populations of Bacillus spp. with reference to B. subtilis strain 168.</a> J Microbiol Methods. 35 (1), 13-21 (1999).</li>
</ol>

Les auteurs ont rien à révéler.

La résistance des endospores à des facteurs physico-chimiques agressifs externes (par exemple, la température ou détergents) a été utilisé pour mettre au point une méthode pour séparer les endospores bactériennes à partir de cellules végétales dans des échantillons environnementaux. Ceci est la première méthode complète pour isoler à partir d&#39;échantillons environnementaux endospores d&#39;une manière non-destructive. Les procédés antérieurs pour quantifier, détecter ou analyser endospores dans les ...

Le but de ce travail est de fournir un protocole pour la séparation des endospores bactériennes partir de cellules bactériennes végétatives dans les échantillons environnementaux. La formation d&#39;endospores bactériennes est une stratégie de survie, généralement déclenchée par la famine, trouvé dans un certain nombre de groupes de bactéries appartenant à l&#39;embranchement des Firmicutes 1. Bactéries endospores sont bien étudiés, principalement en raison d&#39;un certain nombre de souches sont pathogènes et donc d&#39;une importance médicale (par exemple, Bacillus anthracis ou Clostridium difficile). Souches environnementales de bactéries endospores ont été isolés à partir de pratiquement chaque environnement (sol, eau, sédiments, l&#39;air, la glace, intestin humain, les animaux intestin et plus) 1-3. Par conséquent, Firmicutes sont le deuxième embranchement le plus abondant dans les collections de cultures 4. En raison de leurs protéines du cortex externe et fondamentales de protection robustes, endospores peuvent survivre dans des conditions environnementales extrêmes allant from dessiccation à rayonnement élevé, des températures extrêmes et des produits chimiques nocifs 5. Cette résistance remarquable en fait un défi pour extraire l&#39;ADN des endospores 6-8. Cela explique probablement pourquoi ils ont été négligés dans les études de séquençage de l&#39;environnement 9,10. D&#39;autres méthodes, telles que le ciblage des endospores dans les échantillons environnementaux par des anticorps fluorescents 11, quantification de l&#39;acide dipicolinique (DPA) dans le sol et les sédiments 13 12, la cytométrie de flux 14 ou la pasteurisation et la culture subséquente 15,16 ont été utilisés pour récupérer ou de quantifier dans endospores les échantillons environnementaux. Au cours des dernières années, les méthodes d&#39;extraction d&#39;ADN optimisée, ainsi que des amorces moléculaires spécifiques pour cibler des séquences de gènes spécifiques ont été développés endospores 10,17-20. Cela a contribué à révéler plus de biodiversité au sein de ce groupe de bactéries 21 et a également conduit à des applications dans l&#39;industrie et la médecine pour la détection des endospores, Par exemple dans le lait en poudre 19. Le protocole présenté ici est basé sur la différence de résistance à physico-chimiques nocifs (conditions telles que la chaleur et détergents) de endospores bactériennes par rapport à des cellules végétatives. Pour détruire les cellules végétatives dans un échantillon, nous appliquons consécutivement la chaleur, le lysozyme et de faibles concentrations de détergents. La durée et la force de ces traitements ont été optimisés afin de ne pas détruire les spores, mais pour lyser toutes les cellules végétatives. Certaines cellules dans une piscine de la cellule de l&#39;environnement sont plus résistants que d&#39;autres, afin d&#39;augmenter la probabilité de détruire toutes les cellules végétatives, nous appliquons trois traitements différents. L&#39;avantage de la nouveauté et cette méthode est que les endospores après le traitement sont encore intacts et peuvent être utilisés pour d&#39;autres analyses en aval. Ceux-ci comprennent l&#39;extraction de l&#39;ADN, la PCR quantitative (qPCR) et amplicon ou le séquençage métagénomique (ciblant spécifiquement le groupe des endospores et donc de réduire dIVERSITÉ, tout en augmentant la couverture). Les endospores pourraient également être utilisés pour la culture ou la quantification en aval par microscopie par fluorescence, cytométrie de flux, ou la détection de DPA. Une caractéristique importante de ce procédé est que, en comparant un échantillon non traité avec un échantillon traité, on peut déduire la quantité et la diversité des endospores dans un échantillon environnemental, en plus de la composante correspondant à des cellules végétatives.

<table><tbody><tr><td>Filtres à membrane nitrocellulosique Whatman, 0,2 &#956 ; taille des pores, 47 mm de diamètre</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>WHA7182004 Aldrich&nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>Tris(hydroxyméthyl)aminométhane</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>252859 Sigma-Aldrich</td><td>CAS 77-86-1</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E9884 Sigma-Aldrich</td><td>CAS&nbsp ; 60-00-4&nbsp ;</td></tr><tr><td>Lysozyme à partir de blanc d’oeuf de poule</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>62971 Fluka</td><td>en poudre, CAS 12650-88-3&nbsp ;</td></tr><tr><td>Homogénéisateur Ultra-Turrax T18 basic</td><td>IKA</td><td>3720000</td><td></td></tr><tr><td>Porte-filtres en verre pour 47&nbsp ; mm membranes, verre Pyrex</td><td>EMD Millipore</td><td>XX10 047 00</td><td></td></tr><tr><td>Pompe à vide chimique</td><td>Millipore</td><td>WP6122050</td><td>220 V/50 Hz</td></tr><tr><td>Filtration d’échantillonnage sur collecteur pour 25&nbsp ; mm membranes</td><td>Millipore</td><td>1225 Sampling Manifold</td><td>polypropylène</td></tr><tr><td>Dnase</td><td>New England Biolabs</td><td>M0303S</td><td>Rnase free</td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5881 Sigma-Aldrich</td><td>CAS&nbsp ; 1310-73-2&nbsp ;</td></tr><tr><td>Dodécylsulfate de sodium (FDS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L3771 Sigma&nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>Filtres à membrane nitrocellulosique Whatman, 0,2 &#956 ; taille de pores, 25 mm de diamètre</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>WHA7182002 Aldrich</td><td></td></tr></tbody></table>

isolement physique des endospores partir d&#39;échantillons environnementaux par ciblé lyse des cellules végétatives

Physical Isolation of Endospores from Environmental Samples by Targeted Lysis of Vegetative Cells

La formation d’endospores est une stratégie de survie que l’on retrouve chez certaines bactéries de l’embranchement des Firmicutes. Au cours de la formation des endospores, ces bactéries entrent dans un état de repos morpho-physiologique qui améliore la survie dans des conditions environnementales défavorables. Même si les firmicutes endosporulés sont l’un des groupes bactériens les plus fréquemment enrichis et isolés dans les études de culture, ils sont souvent absents des études de diversité basées sur des méthodes moléculaires. La résistance du noyau des spores est considérée comme l’un des facteurs limitant la récupération de l’ADN des endospores. Nous avons mis au point une méthode qui tire parti de la résistance plus élevée des endospores pour les séparer des autres cellules d’une communauté microbienne complexe en utilisant des méthodes de lyse physique, enzymatique et chimique. La préparation d’endospores uniquement obtenue peut être utilisée pour la re-culture ou pour effectuer des analyses en aval telles que l’extraction d’ADN sur mesure optimisée pour les endospores et le séquençage ultérieur de l’ADN. Cette méthode, appliquée à des échantillons de sédiments, a permis l’enrichissement des endospores et, après séquençage, a révélé une grande diversité de formateurs d’endospores dans les sédiments lacustres d’eau douce. Nous nous attendons à ce que l’application de cette méthode à d’autres échantillons donne un résultat similaire.

Les résultats présentés ici ont été publiés plus tôt 10,21. S&#39;il vous plaît se référer à ces articles pour l&#39;interprétation de l&#39;environnement et la discussion des données. La procédure générale est résumée sur la figure 1 et correspond à trois étapes principales: d&#39;abord, la séparation de la biomasse à partir de sédiments ou de toute autre matrice de l&#39;environnement; d&#39;autre part, la destruction de cellules végétatives; et...

Une méthode permettant de distinguer les endospores bactériennes des communautés microbiennes complexes a été développée pour effectuer des études de culture ou moléculaires sur mesure de ce groupe de bactéries.

Isolement physique des Endospores partir d&#39;échantillons environnementaux par ciblé lyse des cellules végétatives

Endospore formation is a survival strategy found among some bacteria from the phylum Firmicutes. During endospore formation, these bacteria enter a ...

L'objectif général de cette procédure est de séparer les endospores bactériens à partir d'échantillons complexes de communautés microbiennes, tels que les sédiments. Cette méthode permet de répondre à des questions essentielles dans le domaine de la microbiologie concernant la présence et l'abondance des endospores dans des échantillons naturels. Elle repose sur une différence de résistance entre les endospores et les cellules végétatives face aux produits chimiques et à la chaleur. Le principal avantage de cette technique est qu'elle est non destructive pour les endospores, ce qui permet de les utiliser dans des expériences ultérieures telles que la culture, la quantification et les tests métaboliques.Bien que nous ayons conçu cette méthode pour fonctionner avec l'écologie des bactéries formant des endospores, elle peut également être utilisée dans des domaines tels que l'exobiologie ou l'industrie alimentaire, dans lesquels les spores peuvent être soit bénéfiques, soit néfastes. Après avoir préparé les solutions et l'équipement conformément au protocole décrit, ajoutez, sous une hotte de sécurité biologique stérilisée aux UV, trois grammes d'échantillon de sédiment à l’aide de cuillères métalliques stérilisées à l’éthanol dans des tubes stériles de 50 millilitres préalablement pesés. À l’aide d’une burette graduée stérile, ajoutez 15 millilitres d’une solution stérile filtrée de 1 % de sodium hexamétaphosphate, ou SHMP, à l’échantillon.À l’aide d’un dispersoir liquide ou d’un homogénéisateur et d’un rotor de dispersion stérile, homogénéisez l’échantillon à 17 500 tr/min pendant une minute. Laissez reposer l’échantillon pendant deux minutes, puis répétez l’homogénéisation. Laissez reposer l’échantillon pendant 10 minutes afin que les particules les plus lourdes sédimentent.Transférez le surnageant contenant la biomasse cellulaire dans un tube propre de 50 millilitres, en prenant soin de ne pas perturber le culot. Ajoutez un autre aliquot de 15 millilitres de SHMP au culot sédimenté et répétez l'homogénéisation avant de recueillir le surnageant et de le combiner avec le premier aliquot. Centrifugez l'échantillon à 20 × g pendant une minute et transférez le surnageant dans un tube de 50 millilitres frais avant de jeter le culot.Une fois l'unité de filtration et la pompe à vide préparées conformément au protocole décrit, stérilisez une paire de forceps à l'aide d'une flamme d'éthanol afin d'ajouter un membrane stérile en nitrocellulose à l'unité de filtration. Ajoutez la moitié de l'échantillon de surnageant fraîchement préparé sur l'unité de filtration à membrane et utilisez la pompe à vide pour recueillir les cellules sur la membrane. Lorsque le liquide est entièrement passé à travers le filtre, arrêtez la pompe à vide.Utilisez des pinces stérilisées pour retirer soigneusement la membrane et placez-la dans une boîte de Pétri stérile. Avec un nouveau morceau de membrane stérile, répétez la filtration avec l'autre moitié de la solution. Pour séparer les endospores des cellules végétatives dans la biomasse fraîchement collectée, décongelez la membrane si elle était congelée et utilisez des ciseaux stérilisés à la flamme d'éthanol pour la découper en morceaux plus petits.Transférez les morceaux de membrane dans un tube stérile de deux millilitres et ajoutez 900 microlitres de tampon TE 1X. Mélangez soigneusement par vortexage pour libérer la biomasse de la membrane. Incubez le tube à 65 degrés Celsius et 80 tr/min pendant 10 minutes.Ensuite, retirez le tube de l’incubateur et laissez-le refroidir pendant 15 minutes. Ajoutez 100 microlitres de lysozyme fraîchement préparé pour obtenir une concentration finale de deux milligrammes par millilitre, puis incubez l’échantillon à 37 degrés Celsius et 80 tr/min pendant 60 minutes afin de lyser les cellules végétatives. Une fois la lyse terminée, ajoutez 250 microlitres de soude à 3 normale et 250 microlitres de solution de SDS à 6 % à l’échantillon.Incuber à température ambiante et à 80 tr/min pendant 60 minutes. Ensuite, préparer une unité de filtration stérile pouvant accueillir des membranes de 25 millimètres de diamètre par autoclavage. Une fois l'unité de filtration refroidie, placer sur celle-ci une membrane en nitrocellulose de 25 millimètres de diamètre et de 0,2 micromètre.Ajoutez l'échantillon sur la membrane et utilisez la pompe à vide pour filtrer le liquide, piégeant ainsi les endospores sur la membrane, tandis que les éléments cellulaires végétatifs passent à travers. Pour éliminer les détergents résiduels, ajoutez deux millilitres de solution physiologique stérile sur la membrane et appliquez la pompe à vide. Une fois que le liquide est complètement filtré, éteignez la pompe et laissez la membrane en place sur l'unité de filtration.Pour effectuer un traitement à la DNase directement sur la membrane, ajouter 450 microlitres d'eau stérile, 50 microlitres de tampon réactionnel 1X pour DNase et 0,5 microlitre d'enzyme DNase sur la membrane, puis laisser agir environ 15 minutes à 25 degrés Celsius. L'ADN extracellulaire précédemment libéré des cellules lysées est digéré enzymatiquement, puis éliminé par lavage. Cela garantit que la préparation finale de spores bactériennes est exempte d'ADN externe, ce qui est essentiel pour les analyses ultérieures telles que les analyses moléculaires.Il est important de se rappeler qu'il ne doit y avoir aucune fuite au niveau de l'appareil de filtration et que l'échantillon ne doit pas s'assécher. Après l'incubation, ajoutez un millilitre de solution physiologique et mettez en marche la pompe pour éliminer l'enzyme résiduelle de l'échantillon. Utilisez une pince stérile pour transférer la membrane contenant les endospores dans une boîte de Pétri stérile.Analyser l'échantillon selon le protocole décrit dans le texte. Le protocole présenté dans cette vidéo, qui consiste en une lyse ciblée des cellules végétatives, permet d'obtenir un échantillon d'endospores purifié et une augmentation significative de la fraction de firmicutes formant des endospores. Dans le séquençage d'amplicons du gène de l'ARN ribosomique 16S, les firmicutes présents dans les échantillons non traités correspondent uniquement à 8 % à 19 % des séquences.En revanche, après le traitement, les Firmicutes représentaient 90,6 % et 83,9 % de l'échantillon riche en endospores. Les deux principaux ordres de Firmicutes formant des endospores, les Bacillales et les Clostridiales, ont été enrichis, tandis que les Firmicutes ne formant pas d'endospores, comme les Lactobacillales, étaient absents. L'efficacité du traitement a également été démontrée à l'aide de cultures pures.Une préparation d'endospores et une culture de cellules végétatives ont été traitées, toutes les cellules ont été incubées et la croissance a été mesurée par densité optique à 600 nanomètres. Comme indiqué ici, une croissance a été observée pour les cultures d'endospores, tandis qu'aucune croissance n'a été observée dans la culture d'E. coli traitée, indiquant que les cellules végétatives sont irréversiblement endommagées. Une fois maîtrisée, et si les solutions et l'équipement ont été préparés au préalable, cette technique doit être réalisée en environ cinq heures.Il est important de se rappeler d'éviter toute contamination en travaillant dans des conditions stériles et en assurant la stérilité des solutions et de tout l'équipement. Après cette procédure, d'autres méthodes telles que la culture, l'isolement et les tests métaboliques peuvent être réalisées afin de répondre à des questions supplémentaires concernant l'identification de la souche et le potentiel métabolique des endospores. De plus, une extraction de l'ADN en aval et un séquençage métagénomique peuvent être effectués pour analyser la diversité des espèces et la présence de gènes.Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière de séparer les endospores d'échantillons environnementaux. N'oubliez pas que manipuler des détergents comme le SDS peut être extrêmement dangereux. Pensez à toujours porter des équipements de protection individuelle.

physical-isolation-endospores-from-environmental-samples-targeted

Research

Recherche

JoVE Journal

Environment

Environnement

Source : Schlimpert, S., et al. Imagerie par fluorescence du cycle de vie complet de S. venezuelae à l’aide d’un dispositif microfluidique. J. Vis. Exp. (2016)Cette vidéo montre la culture et l’isolement des spores de Streptomyces venezuelae. Les spores, cellules dormantes qui aident les bactéries à survivre au stress, sont produites lors de la limitation des nutriments et collectées par centrifugation. La méthode garantit une suspension de spores pures et stockées au froid pour les...

 Préparation et isolement de spores de Streptomyces venezuelae à partir d’une culture liquide 

Source : Wunderlin, T., et al. Isolement physique des endospores à partir d’échantillons environnementaux par lyse ciblée des cellules végétatives. J. Vis. Exp. (2016)Cette vidéo démontre une méthode pour isoler des endospores à partir d’un échantillon environnemental contenant à la fois des cellules végétatives et diverses bactéries. La procédure implique la filtration, la perturbation mécanique et un traitement chimique sélectif pour affaiblir et lyser les cellules végétatives tout en...

Isolement des endospores à partir d’un échantillon environnemental par lyse ciblée de cellules végétatives 

Ici, nous décrivons un dosage colorimétrique pour détecter la présence de sucres réducteurs lors de la germination des spores bactériennes.

Détecter Cortex Fragments Pendant bactérienne Spore Germination

Ce protocole illustre les étapes consécutives importantes nécessaires pour évaluer la pertinence de la surveillance des paramètres de vitalité et des processus de réparation de l’ADN dans la relance des spores de Bacillus subtilis après traitement par plasma basse pression par suivi réparation de l’ADN marquées fluorescence protéines par microscopie confocale résolue dans le temps et la microscopie électronique à balayage.

Enquête sur les néfastes effets de basse pression Plasma stérilisation sur la survie de Bacillus subtilis Spores en utilisant Live microscopie des cellules

Champignons du charbon causent de nombreuses maladies agricoles dévastateurs. Ils sont dispersés sous forme de téleutospores dormants qui germent en réponse à des stimuli environnementaux. Nous décrivons deux méthodes pour étudier les changements moléculaires au cours de la germination : augmentation de la respiration pour détecter l’activation métabolique de mesure et l’évaluation changeant des événements moléculaires en isolant les téleutospores aux stades morphologiques distincts.

Germination des téliospores chargée de l’enquête à l’aide de l’analyse Microrespiration et Microdissection

Amas de protéines récepteurs germinant dans « germinosomes » dans la membrane interne de spores de Bacillus subtilis . Les auteurs décrivent un protocole utilisant des protéines de super-résolution microscopie et fluorescentes de journaliste pour visualiser germinosomes. Le protocole précise également domaines de membrane interne de spores qui sont préférentiellement souillées avec le colorant de membrane FM4-64.

Visualisation de Germinosomes et de la Membrane interne dans les Spores de Bacillus subtilis

Nous présentons ici un protocole basé sur le système d’appât du ver de farine (Tenebrio molitor) qui a été utilisé pour isoler et sélectionner les champignons entomopathogènes (EPF) à partir d’échantillons de sol. Une formule de nombre de conidies efficaces (ECN) est utilisée pour sélectionner un EPF à haute tolérance au stress en fonction des caractéristiques physiologiques de la lutte microbienne des ravageurs sur le terrain.

Isolement et sélection de champignons entomopathogènes à partir d’échantillons de sol et évaluation de la virulence fongique contre les insectes nuisibles

L’isolement des microbes résistants aux métaux lourds des sources géothermiques est un sujet brûlant pour le développement de biosystèmes de bioremédiation et de surveillance de l’environnement. Cette étude fournit une approche méthodologique pour isoler et identifier les bactéries tolérantes aux métaux lourds des sources chaudes.

Bioprospection de micro-organismes extrêmophiles pour lutter contre la pollution de l’environnement

Le présent article vise à fournir des protocoles détaillés et adéquats pour l’isolement des champignons endophytes associés aux plantes, la conservation à long terme des isolats, la caractérisation morphologique et l’extraction totale de l’ADN pour l’identification moléculaire ultérieure et les analyses métagénomiques.

Isolement, caractérisation et extraction totale de l’ADN pour identifier les champignons endophytes chez les plantes mycohétérotrophes

La méthode EPA 1615 utilise un filtre électropositif pour concentrer les entérovirus et les norovirus dans l’environnement et les eaux potables. Ce manuscrit décrit la procédure de collecte d’échantillons pour les analyses de la méthode 1615.

Méthode EPA 1615. Mesure de entérovirus et Norovirus présence dans l&#39;eau par Culture et RT-qPCR. I. Prélèvement des échantillons de virus

Découvrez l'isolement physique des endospores bactériennes à partir d'échantillons environnementaux complexes par lyse ciblée des cellules végétatives. Cette méthode non destructive permet des analyses moléculaires et culturales ultérieures.

Isolement physique des Endospores partir d'échantillons environnementaux par ciblé lyse des cellules végétatives

Explorer plus de vidéos