Un ELISA à base de liaison et la méthode de la concurrence de déterminer rapidement interactions ligand-récepteur

Les objectifs de cette méthode basée sur l'ELISA sont, premièrement, de déterminer l'affinité de liaison d'une cytokine à son récepteur et, deuxièmement, de mesurer les effets de blocage des peptides inhibiteurs de l'interaction ligand-récepteur. Cette méthode peut aider à répondre aux questions clés dans le domaine des interactions protéine-protéine, telles que la liaison cytokine-récepteur. Les affinités de liaison et leur blocage peuvent augmenter la compréhension générale de la dynamique des interactions.

Le principal avantage de cette technique est qu'elle est facile à réaliser, elle génère des récepteurs marqués et elle est relativement peu coûteuse, en raison de l'accès facile à des équipements facilement disponibles tels que le lecteur ELISA. Bien que cette méthode puisse fournir des informations sur l'interaction cytokine-récepteur, elle peut également être appliquée à d'autres systèmes tels que les interactions protéine-protéine générales et la conception de composés de blocage pour inhiber les interactions spécifiques. Préparez les solutions comme décrit dans le protocole textuel.

Assurez-vous de filtrer le tampon de revêtement de carbonate avec une membrane PES de 0,22 micron. Utilisez un vide. De plus, préparez 10 concentrations différentes de chaque ligand ou peptide.

Deux essais sont décrits dans cette vidéo, le premier est l'interaction directe ligand-récepteur, ELISA. Il peut être utilisé pour mesurer la constante de dissociation ligand-récepteur, qui représente l'affinité de liaison ligand-récepteur. Le deuxième essai est un ELISA d'interaction ligand-récepteur en compétition récemment optimisé.

Cela permet le criblage de peptides et d'autres composés de blocage, qui agissent pour interférer avec l'interaction ligand-récepteur. Pour plus d'efficacité, préparez-vous à utiliser des pipettes multicanaux pour plaques à 96 puits, et lors de la décantation, déversez simplement leur contenu. Commencez cette procédure en enrobant la plaque avec un récepteur recombinant.

Tout d'abord, diluez le récepteur dans un tampon de carbonate à 100 nanogrammes par microlitre. Ensuite, chargez les puits de la plaque avec 100 microlitres de solution de récepteur. Excluez les parois extérieures pour éviter de traiter l'artefact du bord de la plaque.

Couvrez la plaque et incubez-la à 4 degrés Celsius pendant la nuit. Effectuez toutes les incubations de la plaque avec un doux remous. Le lendemain, retirez la solution de revêtement et lavez la plaque trois fois avec la solution de lavage, PBS avec un peu de Tween 20.

Ensuite, bloquez les sites de liaison des récepteurs libres en ajoutant 200 microlitres de 5%PSA. Laissez la plaque incuber pendant deux heures à température ambiante pour compléter le blocage. Plus tard, videz les puits et lavez la plaque comme précédemment.

Maintenant, chargez les puits avec 100 microlitres des différentes dilutions de ligand recombinant his-tag. Chargez chaque concentration en double. Chargez les puits vides avec du PBS seul.

Ensuite, incubez la plaque pendant deux heures à température ambiante. Après l'incubation avec les ligands, lavez la plaque trois fois avec la solution de lavage. Ensuite, pipettez 100 microlitres d'aliquots d'anticorps monoclonaux anti-his de souris primaires dans chaque puits et incubez la plaque à température ambiante pendant deux heures.

Après avoir éliminé l'anticorps, ajoutez à chaque puits 100 microlitres de solution d'anticorps secondaires IGG de chèvre couplés à la HRP, anti-souris. Enveloppez la plaque avec du papier aluminium pour éviter la lumière. Ensuite, incubez la plaque pendant 45 minutes à température ambiante.

Utilisez la technique de lavage standard pour éliminer l'anticorps secondaire. Maintenant, ajoutez à chaque puits 100 microlitres de TMB fraîchement préparé à partir de quantités égales de solutions de substrat stock A et B. Ensuite, maintenez la plaque à température ambiante pendant 15 à 30 minutes. Ensuite, après un développement de couleur suffisant, ajoutez 50 microlitres de solution stock à chaque puits.

Le protocole est basé sur l'hypothèse que le signal mesuré provient d'une liaison spécifique. Il peut être nécessaire d'estimer la contribution de la liaison non spécifique au signal. Ensuite, lisez les valeurs d'absorbance de la plaque à 450 nanomètres et procédez au calcul de la valeur KD.

La procédure LRA en compétition suit les mêmes étapes que la procédure LRA directe, à l'exception de quelques changements importants. Après avoir lavé les ligands de revêtement excédentaires de la plaque, bloquez les puits de la plaque. Ajoutez 200 microlitres de solution de 5%BSA à chaque puits et incubez la plaque pendant deux heures à température ambiante.

Pendant l'incubation, préparez les ligands recombinants his-tag à une concentration fixe de 10 nanogrammes par millilitre dans PBS. Ensuite, préparez le peptide de blocage à différentes concentrations dans PBS, allant de 10 nanomolaire à 100 micromolaire pour garantir une courbe dose-réponse. Ainsi, la valeur IC50 pour le peptide de blocage peut être trouvée.

Dans les puits de contrôle, chargez la concentration fixe de ligand sans peptide pour obtenir la liaison maximale. Dans les puits vides, ajoutez seulement du PBS sans ligand ni peptide. Dans les autres puits, ajoutez 50 microlitres des ligands et 50 microlitres de chaque concentration de peptide.

Ensuite, incubez la plaque pendant deux heures à température ambiante et procédez comme d'habitude. Les constantes de dissociation entre trois peptides ligands interféron différents et le sous-unité récepteur alpha IL28R-a ont été déterminées en utilisant la LRA directe, la fraction de sites de liaison occupés est tracée contre le logarithme de la concentration respective d'interféron. Ces résultats illustrent une courbe de liaison qui peut être analysée pour estimer la valeur KD en ajustant les données à l'équation de Hill.

Un tracé de Scatchard illustre la coopérativité dans la liaison du ligand, en fin de compte, le ligand interféron 1 a la plus grande affinité de liaison, suivi par le ligand interféron 2 et le ligand interféron 3. La valeur du coefficient de Hill supérieure à 1 suggère une affinité accrue pour des ligands supplémentaires après l'interaction initiale ligand-récepteur. Ensuite, la LRA compétitive a été utilisée pour quantifier l'impact d'un peptide de blocage sur l'interaction entre les peptides ligands interféron et la sous-unité récepteur.

La fraction de sites de liaison occupés pour un peptide ligand interféron à 10 nanogrammes par millilitre est tracée contre le logarithme de la concentration du peptide interféron. À partir de ces données, les valeurs IC50 ont été estimées. Selon les valeurs calculées, le peptide de blocage a inhibé l'interaction entre le ligand interféron 3 et IL28R-a dans la plus grande mesure.

Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en huit heures. Si elle est effectuée correctement. Tout en essayant cette procédure, il est important de se rappeler que chaque concentration de saturation de liaison ligand-récepteur, en suivant cette procédure, les autres méthodes comme peuvent être effectuées pour obtenir des valeurs KD plus détaillées.

Après son développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine des interactions ligand-récepteur pour explorer les substances inhibitrices pour bloquer ces interactions.