Un ELISA à base de liaison et la méthode de la concurrence de déterminer rapidement interactions ligand-récepteur

Les objectifs de cette méthode basée sur ELISA sont d’une part de déterminer l’affinité de liaison d’une cytokine à son récepteur et d’autre part, de mesurer les effets bloquants des peptides inhibiteurs de l’interaction ligand-récepteur. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine des interactions protéine-protéine, telles que la liaison cytokine-récepteur. Les affinités de liaison et le blocage de celles-ci peuvent augmenter la compréhension générale de la dynamique d’interaction.

Le principal avantage de cette technique est qu’elle est facile à réaliser, qu’elle génère des récepteurs de marquage et qu’elle est relativement bon marché, en raison de l’accès facile à des lecteurs ELISA facilement disponibles. Bien que cette méthode puisse fournir des informations sur l’interaction des récepteurs de cytokines, elle peut également être appliquée à d’autres systèmes tels que les interactions générales protéine-protéine et la conception de composés bloquants pour inhiber les interactions spécifiques. Préparez les solutions comme décrit dans le protocole texte.

Assurez-vous de filtrer le tampon d’enrobage carbonaté avec une membrane PES de 0,22 micron. Utilisez un aspirateur. De plus, faites 10 concentrations différentes de chaque ligand ou peptide.

Deux tests sont décrits dans cette vidéo, le premier est l’interaction directe ligand-récepteur, ELISA. Il peut être utilisé pour mesurer la constante de dissociation récepteur-ligand, qui représente l’affinité de liaison récepteur-ligand. Le deuxième test est un ELISA d’interaction ligand-récepteur de compétition récemment optimisé.

Cela permet de cribler les peptides et autres composés bloquants, qui interfèrent avec l’interaction récepteur-ligand. Pour plus d’efficacité, préparez-vous à utiliser des pipettes multicanaux pour les plaques à 96 puits et, lors de la décantation, il suffit de vider leur contenu. Commencez cette procédure en recouvrant la plaque d’un récepteur recombinant.

Tout d’abord, diluez le récepteur dans un tampon carbonaté à 100 nanogrammes par microlitre. Ensuite, chargez les puits de la plaque avec 100 microlitres de solution réceptrice. Excluez les murs extérieurs pour éviter de traiter avec l’artefact de bord de la plaque.

Couvrez l’assiette et incubez-la à 4 degrés Celsius pendant la nuit. Effectuez toutes les incubations de la plaque en tourbillonnant doucement. Le lendemain, retirez la solution de revêtement et lavez la plaque trois fois avec la solution de lavage, PBS avec une touche de Tween 20.

Ensuite, bloquez les sites de liaison des récepteurs libres en ajoutant 200 microlitres de PSA à 5 %. Laissez incuber la plaque pendant deux heures à température ambiante pour compléter le bloc. Plus tard, videz les puits et lavez l’assiette comme avant.

Maintenant, chargez les puits avec 100 microlitres des différentes dilutions du ligand recombinant his-mark. Chargez chaque concentration en double. Chargez les puits vides avec PBS seul.

Ensuite, incubez la plaque pendant deux heures à température ambiante. Après l’incubation avec les ligands, laver la plaque trois fois avec une solution de lavage. Ensuite, pipetez 100 aliquotes d’aliquotes primaires d’anticorps monoclonaux anti-his de souris dans chaque puits et incubez la plaque à température ambiante pendant deux heures.

Après avoir lavé l’anticorps, dans chaque puits, ajoutez 100 microlitres de solution d’anticorps secondaires IGG de chèvre couplée à la HRP. Enveloppez la plaque avec du papier d’aluminium pour éviter la lumière. Ensuite, incubez la plaque pendant 45 minutes à température ambiante.

Utilisez la technique de lavage standard pour éliminer l’anticorps secondaire. Maintenant, dans chaque puits, ajoutez 100 microlitres de TMB fraîchement préparé à partir de quantités égales de solutions de substrat mères A et B.Ensuite, conservez la plaque à température ambiante pendant 15 à 30 minutes. Ensuite, après un développement suffisant de la couleur, ajoutez 50 microlitres de solution mère dans chaque puits.

Le protocole est basé sur l’hypothèse que le signal envoyé provient d’une liaison spécifique. Il peut être nécessaire d’estimer la contribution de la liaison non spécifique au signal. Ensuite, lisez les valeurs d’absorbance de la plaque à 450 nanomètres et procédez au calcul de la valeur KD.

La procédure de concours LRA suit les mêmes étapes que la procédure LRA directe, à l’exception de quelques modifications importantes. Après avoir lavé les ligands de revêtement en excès de la plaque, bloquez les puits de la plaque. Ajoutez 200 microlitres de solution BSA à 5 % dans chaque puits et incubez la plaque pendant deux heures à température ambiante.

Pendant l’incubation, préparez les ligands recombinants his-tag à une concentration fixe de 10 nanogrammes par millilitre dans du PBS. Ensuite, préparez le peptide bloquant à différentes concentrations dans le PBS, allant de 10 nanomolaires à 100 micromolaires pour garantir une courbe dose-réponse. Ainsi, la valeur IC50 du peptide bloquant peut être trouvée.

Dans les puits de contrôle, chargez la concentration de ligand fixe sans peptide pour obtenir la liaison maximale. Dans les puits vides, ajoutez uniquement du PBS sans ligand ni peptide. Dans les autres puits, ajoutez 50 microlitres de ligands et 50 microlitres de chaque concentration peptidique.

Ensuite, incubez la plaque pendant deux heures à température ambiante et procédez comme d’habitude. Les constantes de dissociation entre trois peptides différents de ligands d’interféron et la sous-unité du récepteur alpha IL28R-a ont été déterminées à l’aide de la LRA directe, la fraction des sites de liaison occupés étant tracée par rapport au logarithme de la concentration d’interféron respective. Ces résultats illustrent une courbe de liaison qui peut être analysée pour estimer la valeur de KD en ajustant les données à l’équation de Hill.

Un graphique de Scatchard illustre la coopérativité dans la liaison des ligands, finalement le ligand d’interféron 1 a l’affinité de liaison la plus élevée, suivi du ligand d’interféron 2 et du ligand d’interféron 3. La valeur du coefficient de Hill supérieure à 1 suggère une affinité accrue pour les ligands supplémentaires après l’interaction initiale du ligand récepteur. Ensuite, une LRA compétitive a été utilisée pour quantifier l’impact d’un peptide bloquant sur l’interaction entre les peptides du ligand de l’interféron et la sous-unité du récepteur.

La fraction des sites de liaison occupés pour un peptide de ligand d’interféron à 10 nanogrammes par millilitre est tracée par rapport au log de la concentration du peptide d’interféron. À partir de ces données, les valeurs de la CI50 ont été estimées. Selon les valeurs calculées, le peptide bloquant a inhibé dans la plus grande mesure l’interaction entre le ligand 3 de l’interféron et l’IL28R-a.

Une fois maîtrisée, cette technique, elle peut être réalisée en huit heures. S’il est effectué correctement. En essayant cette procédure, il est important de se rappeler que chaque concentration de saturation de liaison au récepteur de ligand, à la suite de cette procédure, les autres méthodes peuvent être effectuées pour obtenir des valeurs KD plus détaillées.

Après son développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine des interactions ligand-récepteur pour explorer des substances inhibitrices permettant de bloquer ces interactions.