Mesures de sécurité et procédures d'exploitation dans un (A) de laboratoire BSL-4: 2. Pratiques générales

L'objectif général de cette procédure est de démontrer les pratiques sécuritaires lors d'un travail dans un laboratoire équipé de combinaisons de niveau de biosécurité 4, en utilisant le dosage par plaque comme exemple. Cette procédure illustre les modifications nécessaires pour réaliser un dosage standard par plaque dans un environnement de niveau de biosécurité 4. Tracey Burdette, une technicienne du Integrated Research Facility, m'accompagnera pour la démonstration de cette procédure.

Une fois la liste de vérification interne quotidienne terminée, nettoyer la hotte de sécurité biologique de classe II en pulvérisant l'intérieur, y compris le panneau mobile, avec une solution désinfectante à 5 % d'ammonium quaternaire double. Ensuite, essuyer la hotte avec des essuie-tout, en veillant à laisser à l'intérieur de la hotte la bouteille pulvérisatrice contenant la solution désinfectante afin de pulvériser les mains gantées pendant et après l'exécution du test. Pulvériser une solution d'éthanol à 70 % à l'intérieur de la hotte et sur le panneau mobile pour éliminer la solution désinfectante collante.

Préparez un récipient pour les déchets dans la cabine de sécurité biologique. Veillez à ce que la concentration finale de la solution désinfectante à base d'ammonium quaternaire double dans le récipient de déchets ne soit pas inférieure à 5 %, en tenant compte de tout liquide supplémentaire ajouté. Placez le récipient de déchets contenant une solution désinfectante à 5 % d'ammonium quaternaire double à l'intérieur de la cabine de sécurité biologique de classe II.

Effectuez toutes les manipulations aussi près que possible du centre intérieur de la hotte de sécurité de classe II. Le centre intérieur est conçu pour être l'emplacement le plus efficace afin de s'assurer une protection optimale. Prélevez 50 microlitres d'échantillon viral et de virus témoin, puis ajoutez-les à 450 microlitres de milieu de Dulbecco modifié d’Eagle contenant 2 % de sérum bovin fetal dans des puits de dilution.

Procédez à la réalisation de dilutions sérielles jusqu’au degré de dilution nécessaire. Mélangez les échantillons de virus au moins cinq fois avec une pipette, en changeant systématiquement les embouts après chaque dilution. Mélangez lentement afin de minimiser la formation de bulles d’air dans les échantillons.

Une fois terminé, mettre de côté les puits de dilution. Lors de l'élimination des pointes, rincer chaque pointe avec une solution désinfectante provenant du seau de déchets afin de décontaminer l'intérieur et l'extérieur de la pointe avant de la rejeter dans le seau de déchets. Retirer la majeure partie du milieu des puits des plaques de culture cellulaire à six puits.

Ajouter 100 µL de l'échantillon approprié dans la bonne cavité des plaques préalablement étiquetées, en double. Une fois terminé, vaporiser les mains gantées avec la solution désinfectante. Utiliser une serviette en papier imbibée de solution désinfectante pour essuyer l'extérieur de toutes les plaques avant de placer celles-ci dans l'incubateur à la main.

Agiter les plaques en mouvement en forme de 8 pendant une heure, toutes les 15 minutes, pour assurer une bonne dispersion de l'échantillon sur les cellules. Ajouter deux millilitres du mélange de recouvrement dans chaque puits, puis agiter à nouveau en mouvement en forme de 8 afin d'assurer une répartition uniforme du recouvrement sur toute la surface du puits. Plonger complètement tous les déchets dans une solution désinfectante à 5 % dans le seau de déchets, avec un temps de contact d'au moins 10 minutes.

Vaporisez l’intérieur et l’extérieur du seau à déchets, l’intérieur de la hotte de sécurité de classe II, l’extérieur du matériel et les mains gantées avec une solution désinfectante à 5 %. Laissez la solution agir dans le seau à déchets et sur les autres surfaces pendant un temps de contact de 10 minutes. Ensuite, retirez les éléments de la hotte de sécurité et transportez-les vers l’évier.

Placer la pipette utilisée dans un plateau à pipettes pour la stérilisation par autoclavage. Verser le contenu du seau de déchets dans un tamis placé dans l'évier. Ensuite, apporter un contenant pour déchets biologiques doublé d'un sac rouge pour matières dangereuses jusqu'à l'évier, puis verser le contenu du tamis dans le sac rouge pour matières dangereuses.

Placer le sac de déchets dangereux sur un plateau d'autoclave posé sur un chariot. Fermer les sacs d'autoclave avec du ruban adhésif de manière lâche afin de permettre à la vapeur de pénétrer dans le sac. Et étiqueter l'un des rubans d'autoclave avec les initiales de la personne et la date.

Retirer la tige métallique perforée de l'autoclave et ouvrir le couvercle. Placer un flacon indicateur biologique contenant des spores de Geobacillus stearothermophilus dans la tige métallique afin de vérifier que le cycle de stérilisation de l'autoclave s'achève correctement. Placer le plateau de l'autoclave rempli de déchets à l'intérieur de l'autoclave.

Démarrer l'autoclave et vérifier que le cycle a commencé. L'écran de fonctionnement de l'autoclave indiquera le temps restant pour ce cycle. Une fois la période d'incubation requise terminée, retirer soigneusement les plaques de dosage des plaques de l'incubateur et les placer à la main dans la hotte de sécurité biologique de classe II propre.

Aspirez le milieu et le matériau de recouvrement à l’aide d’une pipette, puis versez-les dans le récipient contenant la solution désinfectante. Remplacez le milieu par un mélange de formol tamponné neutre à 10 % et de violet de crésyl à 0,8 % afin d’inactiver le virus pendant un temps de contact de 30 minutes. Après l’inactivation, retirez soigneusement le mélange de formol tamponné neutre et de violet de crésyl et placez-le dans un contenant à déchets séparé, destiné à être neutralisé avant élimination.

Au lavabo, rincez les plaques pour éliminer l'excès de colorant, puis placez-les dans un bac pour les faire sécher complètement. Utilisez une boîte lumineuse pour compter les plaques. Enregistrez tous les décomptes et calculez les titres viraux à partir de l'équation standard.

Pour l'élimination des échantillons inactivés depuis le laboratoire de niveau de confinement BSL-4, placer les tubes ou les plaques dans un sac scellable à chaud. Pulvériser l'intérieur du sac avec une solution désinfectante ou fixative à 5 %, afin de désinfecter l'intérieur du sac ainsi que l'extérieur des tubes d'échantillons. Puis sceller le sac thermiquement.

Placer ce sachet dans un autre sachet en suivant la même procédure. Sceller thermiquement le second sachet, puis placer les sachets doublement scellés dans un bac de trempage contenant une solution désinfectante à 5 % pendant au moins 10 minutes, afin de désinfecter l'extérieur des sachets. Remplir un registre du bac de trempage à l'intérieur du laboratoire en indiquant le nombre et la taille des tubes, le volume contenu dans les tubes, l'agent utilisé, la méthode d'inactivation appliquée, ainsi que la pièce vers laquelle les échantillons seront transférés.

Le respect des procédures appropriées dans un laboratoire de niveau de biosécurité 4 est essentiel pour garantir l'exécution sûre et efficace des essais. En se référant à la liste de vérification interne quotidienne complétée, le personnel du laboratoire s'assure que l'équipement est entièrement opérationnel. L'échantillon viral est dilué en série afin d'obtenir des plaques présentant de 30 à 300 plaques par puits et de déterminer la titration du virus.

Un certain nombre de facteurs influencent la formation des plaques, notamment le tropisme viral pour les lignées cellulaires hôtes, la technique d'inoculation, les conditions de croissance du virus, la gamme de dilution appropriée et le choix de la couche de recouvrement. Les déchets générés dans l'enceinte de sécurité biologique pendant la procédure sont désinfectés deux fois. Les déchets sont correctement désinfectés une fois avant leur retrait de l'enceinte de sécurité biologique.

Par la suite, les déchets sont stérilisés en autoclave avant de quitter l'environnement de niveau de biosécurité 4 pour animaux. En suivant ces procédures, aucune infection acquise en laboratoire n'a été enregistrée lors de recherches menées au niveau de biosécurité 4 pour animaux au sein de l'Installation de recherche intégrée de Frederick. Cette technique peut être réalisée en trois à quatre heures selon le nombre d'échantillons, à condition qu'elle soit correctement exécutée.

Lors de la réalisation de cette procédure, veillez à effectuer correctement les dilutions, à compter les plaques de manière appropriée et à respecter toutes les précautions de sécurité afin de garantir une expérience sûre et fructueuse. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre les limitations physiques imposées par les combinaisons à pression positive, ainsi que le temps supplémentaire nécessaire pour réaliser un dosage standard de plaques.