Name: Multi-exon Sauter Utilisation Oligonucleotides Cocktail antisens dans la dystrophie musculaire Canine liée à lX (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-05-24T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 30 s
Description: Découvrez le saut multi-exons utilisant des cocktails d'oligonucléotides antisens pour la dystrophie musculaire de Duchenne dans un modèle canin. Cette méthode démontre le sauvetage systémique de la dystrophine sans toxicité significative.

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Ce travail a été soutenu par la Faculté de médecine et de dentisterie de l’Université de l’Alberta, le Fonds de la chaire de recherche des Amis de Garrett Cumming, le Fonds de la chaire de recherche en sciences neurologiques HM Toupin, Dystrophie musculaire Canada, la Fondation canadienne pour l’innovation (FCI), l’Alberta Advanced Education and Technology (AET), les Instituts de recherche en santé du Canada (IRSC), Jesse’s Journey - The Foundation for Gene and Cell Therapy, et l’Institut de recherche sur la santé des femmes et des enfants (WCHRI).

Les frais de libre accès pour cet article ont été fournis par Gene Tools, LLC.

Le saut d&#39;exon thérapeutique est une technique prometteuse pour le traitement de la DMD. In vitro et in vivo ont montré que le multi-saut d&#39; exon est réalisable. Ici, l&#39;utilisation du modèle de chien CXMD est discuté. Tout d&#39; abord, AON ont été conçus à l&#39; aide des programmes de sauvetage-ESE et ESEfinder pour cibler les exons de la dystrophine 6 - 8. La composition chimique 2&#39;OMePS AON a été utilisée pour la transfection et CXMD myoblastes le squelette chimique morpholino AON a été choisi pour les expériences in vivo. vPMOs sont plus efficaces que les PMO non modifiés, mais en raison de leur toxicité plus élevée, ils ne sont pas appropriés pour les injections systémiques. extraction de l&#39;ARN, une RT-PCR et séquençage d&#39;ADNc ont été réalisées sur les myoblastes CXMD. Chiens injectés avec le cocktail PMO étaient cliniquement graduée pour évaluer toute amélioration des symptômes cliniques. Après les chiens ont été euthanasiés sans cruauté, des échantillons de muscles ont été prélevés et préparés pour cryo-tronçonnage. La demi-vie de la protéine dystrophine induite par unNRO est censé être environ 1 - 2 mois. chiens jeunes adultes ont été utilisés dans cette étude, bien que ces expériences peuvent être faites avec des chiens néonatales et les chiens âgés (&gt; 5 ans). Sections musculaires préparées ont été utilisés pour évaluer l&#39; histopathologie et évaluer protéine dystrophine sauvetage par Western blot et immunohistochimie 48. Il est important de veiller à ce que le volume de la solution CPM est correcte avant les injections; à défaut de le faire aura des effets significatifs sur les résultats. Pendant les injections intramusculaires, une pression suffisante est nécessaire pour entrer dans les fibres musculaires. Surveillance de la santé et l&#39;inspection du site de la chirurgie chien sont importants pour le dépannage. Pour surveiller la santé des animaux, des tests sanguins hebdomadaires et de pesage doivent être effectués. Après l&#39;euthanasie de l&#39;animal et la préparation des échantillons de muscle, une étape essentielle pour assurer la sensibilité dans la détection de la protéine dystrophine est d&#39;utiliser à la fois le gel Tris-acétate et méthode de transfert semi-seclors de la procédure par Western Blot. Comme on le voit dans les résultats représentatifs myoblastes traités avec Ex6A, Ex6B, Ex8A et le cocktail (contenant Ex6A, Ex6B, Ex8A et Ex8B) réalisé en cadre produits DMD. Depuis Ex8B produit aucun produit exon-sautée, il n&#39;a pas été utilisé dans la suite des expériences in vivo. séquençage d&#39;ADNc a montré que les exons 6-9 saut a eu lieu et immunocytochimie avec DYS-2 coloration a montré restauré l&#39;expression de la dystrophine dans les échantillons traités. AON chiens traités ont montré une augmentation significative des fibres dystrophine positives. Cela indique que les exons 6-8 ont été ignorés et une protéine raccourcie a été produit. La quantité de fibres dystrophine positives augmenté quand un cocktail d&#39;AON a été utilisé et est proportionnelle à la dose AON. Immunotransferts a montré une expression de la dystrophine a augmenté chez les chiens systémiques morpholino traités. Le muscle squelettique a des niveaux variables de fibres dystrophine; Cependant, le tissu cardiaque morpholino traité a montré peul&#39;amélioration de l&#39;expression de la dystrophine. Etant donné que la dystrophine présente un poids moléculaire élevé (427 kDa), la détection de faibles quantités de la dystrophine peut être difficile. Pour les meilleurs résultats, gel Tris-acétate et la méthode de transfert semi-sec ont été utilisés. HE coloration a montré l&#39;amélioration de l&#39;histopathologie chez les chiens morpholino-traités. fibres centre-nucléés (CNFS) sont un signe de muscle malsain et représentent des cycles de dégénérescence musculaire et la régénération. chiens CXMD morpholino-traités ont montré une diminution du pourcentage de CNF par rapport aux chiens CXMD non traités. classement clinique a révélé une amélioration des symptômes, tels que l&#39;augmentation marche et la capacité en cours d&#39;exécution, chez les animaux morpholino traités. La dureté des muscles est censé refléter l&#39; atrophie musculaire, donc, il a été inclus dans le système de classement 59. La dureté de la cuisse (membres postérieurs) muscles a été évaluée; cependant, nous avons exclu les muscles sartorius crâniens parce qu&#39;ils ont tendance à présenter une hypertrophie plutôt que dans l&#39;atrophie CXMD. Les chiens traités montrented scores de classement inférieurs et avait fois plus rapide sur le test de roulage de 15 m. Amélioration fois sur le test de 15 m sont indicatifs de l&#39; amélioration de la fonction musculaire 40. scores de classement globaux plus élevés indiquent une mauvaise santé et une augmentation de l&#39;atrophie musculaire. Bien que ces résultats sont prometteurs, multi-exon skipping présente encore de nombreux défis qui devront être surmontés avant que la technique a une applicabilité clinique. tissu cardiaque affiche toujours l&#39;absorption réduite de AON, probablement en raison de la différence dans le trafic cellulaire entre le tissu cardiaque et squelettique. Aucun effet toxique n&#39;a été observé chez les animaux de moins de posologies en cours; Cependant, plus de travail doit être fait pour évaluer la toxicité à long terme avant l&#39;utilisation de cocktails AON peut se déplacer à des essais cliniques. Il est difficile d&#39;obtenir l&#39;approbation de médicaments AON cocktail parce que les organismes de réglementation définissent chaque séquence AON comme un médicament unique. Cela signifie que chaque séquence dans un cocktail devra être testé individuellement pour safety, ce qui nécessite plus de temps et plus d&#39;argent. Un autre obstacle à l&#39;utilisation de la multi-saut d&#39;exon dans un environnement clinique est une grande quantité de produits protéiques produits intermédiaires avec des fonctions inconnues. Ces protéines peuvent potentiellement conduire à des effets secondaires imprévisibles, en fonction de la mutation individuelle 22. En outre, les profils de mutation disponibles dans les modèles actuels de chien dystrophiques sont limitées. Il existe peu de mutations naturelles, et non pas toutes les mutations sont utiles pour étudier plusieurs saut d&#39;exon. Le modèle dystrophique de porc promet d&#39;être une bonne alternative pour l&#39; avenir DMD saut d&#39; exon études 33, 34. Les modèles de chiens DMD présentent certains avantages par rapport aux autres modèles de DMD. Être un plus grand modèle animal, le classement clinique et l&#39;IRM sont possibles, ce qui permet une analyse plus détaillée. Puisque les chiens sont de grands animaux, ils sont également plus adapté pour les études toxicologiques et représentent plus étroitement la maladie humaine par rapport au modèle de la souris. Chien modèles ont aussi des séquences de gènes DMD qui sont plus semblables aux humains 23, 34, 45. Bien que techniquement difficile, l&#39;approche de saut multi-exon pourrait finalement bénéficier&gt; 90% des patients atteints de DMD 24. Cela en fait une bien meilleure alternative à un seul saut d&#39;exon, comme un seul saut d&#39;exon est applicable uniquement à un petit sous-ensemble de patients. En outre, multi-exon skipping nous permettra de sélectionner les motifs de suppression qui optimisent la fonctionnalité des protéines de la dystrophine raccourcie. Par exemple, la suppression de la DMD exons 45 - 55 est associée à des symptômes exceptionnellement doux ou individus asymptomatiques 14,19,60-63. Le saut multi-exon des exons 45 - 55 a déjà été démontré dans un modèle de souris de la DMD avec un exon 52 délétion (mdx52) en utilisant des injections systémiques de vPMOs 22,26. L&#39;utilisation de cocktails vPMOs a également été démontrée dans d&#39;autres formes de dystrophie musculaire,comme Fukuyama dystrophie musculaire congénitale (FCMD). FCMD est provoquée par le piégeage d&#39;exon, dans lequel l&#39;épissage aberrant est provoquée par l&#39;insertion de rétrotransposon. vPMOs ont été montrés pour délivrer le motif d&#39;épissage dans les deux un modèle de souris FCMD et dans des lignées cellulaires humaines 64. La nouvelle génération AON chimies présentant une efficacité élevée et une toxicité plus faible faciliterait la traduction effective de l&#39;approche de saut multi-exon dans l&#39;application clinique. En outre, multi-saut d&#39; exon pourrait être appliquée à d&#39; autres troubles génétiques, tels que la dysferlinopathies 24, 65.

Dystrophie musculaire de Duchenne (DMD) est une maladie musculaire récessive liée à l&#39; X caractérisée par une faiblesse musculaire progressive, d&#39; abord décrit par le Dr Guillaume-Benjamin-Amand Duchenne (de Boulogne) 1. DMD est une maladie génétique fréquente qui touche environ 1 à 3.500 garçons à travers le monde, avec environ 20 000 enfants touchés nés chaque année 2,3. Le développement moteur est retardée et troubles de la marche sont vus dans la petite enfance 4, suivie par fauteuil roulant dépendance à peu près au début de l&#39; adolescence. La mort survient généralement entre les âges de 20 et 30 en raison d&#39; une insuffisance respiratoire ou cardiaque 5-8. Il n&#39;y a actuellement aucun remède pour DMD. Le traitement par glucocorticoïdes peut ralentir la progression de la dégénérescence musculaire à un certain degré , mais est associé à des effets secondaires importants, y compris l&#39; obésité et le diabète sucré 2,7,8. DMD résulte de mutations dans le dystrophine Duchenne (DMD) , le gène, ce qui conduit à une perte de dystrophine fonctionnelle protein. DMD est un très grand gène avec plus de 2 millions de paires de bases et 79 exons 9,10. Délétion, non-sens, et de duplication des mutations conduisant à des mutations hors-cadre sont la cause la plus commune du phénotype DMD. Les régions des exons 3 - 9 exons et 45 - 55 sont appelés &quot;points chauds de mutation» , comme la plupart des patients présentent des mutations de deletion dans ces parties du gène, ce qui conduit à la dystrophine non fonctionnelle chez les patients souffrant de DMD 3,9,11-16. les fonctions de la dystrophine dans le complexe dystrophine-glycoprotéine (DGC), qui a un rôle important dans la stabilisation de la membrane musculaire. N- et C-terminales sont les domaines les plus importants pour la fonction, alors que le domaine de la tige centrale joue un rôle moins important 3,9,17. Le respect d&#39;un phénotype doux associé à dystrophie musculaire de Becker (BMD), qui résulte principalement de mutations en cadre dans le gène DMD, inspiré de l&#39;application de saut d&#39; exon pour le traitement de la DMD. patients BMD ont un raccourci, mais functional, protéine dystrophine qui maintient deux extrémités 3,6,18. Le saut d&#39; exon, en théorie, peut restaurer le cadre de lecture, ce qui entraîne la dystrophine protéines fonctionnelles raccourcies mais-similaires à ceux observés dans la DMO 3,19. Plusieurs types d&#39;oligonucléotides antisens (AON) ont été testés dans des essais cliniques, y compris phosphorothioates 2&#39;O-méthylés (2&#39;OMePS) et oligomères phosphorodiamidate morpholino (PMO). Exons Sauter 51 et 53 à l&#39; aide de ces AON ont été examinés et alors que les résultats sont prometteurs, un seul saut d&#39; exon a limité l&#39; applicabilité, comme il est de 3, 19, 20,21, 22-26 mutation spécifique. Des questions subsistent également quant à la stabilité des protéines de dystrophine raccourcie résultant produites à partir de simple saut d&#39; exon 22,23. En outre, certains patients ont besoin de plus d&#39;un seul exon à être ignorées afin de rétablir le cadre de lecture 3. Bien que techniquement plus difficile, multi-saut d&#39;exon est une méthode quipourrait remédier à ces problèmes 3,19. Multi-saut d&#39; exon a déjà été démontrée chez le chien dystrophique et des lignées de cellules humaines in vitro. En outre, mdx52 dystrophie musculaire (CXMD) modèles de chien liées à l&#39;X de la souris et canines ont été utilisées pour les études in vivo 22, 24-27. Canine dystrophie musculaire liée à l&#39; X Japon (CXMD J) beagles ont été utilisés ici, comme le cadre de lecture de CXMD J peut être restauré par le multi-exon skipping des exons 6 et 8, ou exons supplémentaires (par exemple, les exons 3-9) (Figure 1). CXMD à base de Beagle partage le même type de mutation que le modèle Golden Retriever dystrophie musculaire (DRG), mais beagles sont plus petits et moins coûteux à entretenir en raison de la taille de leur corps, fournissant ainsi un modèle utile pour DMD 28,29. Chiens CXMD imitent plus étroitement le phénotype DMD humain que les modèles animaux plus petits, comme les rongeurs, et sont plus fiables pour les évaluations toxicologiques 3,22,30,31 </sup&gt; (figure 2). chiens CXMD afficher la décomposition musculaire progressive, troubles de la marche, et les problèmes cardiaques et respiratoires semblables à ceux observés dans la DMD. Par rapport à un seul saut d&#39;exon, multi-saut d&#39;exon est applicable à une plus grande proportion de patients. Parmi les trois types de mutations les plus courantes (suppressions, non - sens, et duplications), 80-98% des patients pourraient être traités par le biais multi-saut d&#39; exon 14,32,33, alors que 45% de tous les patients atteints de DMD pourrait bénéficier d&#39;exons sauter spécifiquement 45 - 55 3,19,22,34. Avec le développement des morpholinos modifiés, l&#39;efficacité des cocktails AON à faciliter l&#39;exon skipping est améliorée. Riche en arginine peptide conjugué PMO de pénétration cellulaire (PPMOs) et in vivo-morpholinos (vPMOs) sont chimies AON qui ont considérablement amélioré la capacité et la stabilité 3,35-38 pénétrant dans les cellules. Des préoccupations demeurent quant à la toxicité à long terme AON; Cependant, des progrès significatifsa été fait. Les modifications chimiques apportées à morpholinos diminuent grandement les effets hors-cible et des études pré-cliniques ont rapporté aucun effet toxique significatif 3,22,39,40. Un autre défi pour le multi-saut d&#39; exon est l&#39;exigence actuelle pour chaque single AON à tester la toxicité seul, comme un seul médicament, au lieu d&#39;ensemble comme un cocktail 3,19,22,41,42. Dans les études DMD impliquant à la fois simple et multi-saut d&#39;exon ciblé sur le cœur, il y a eu peu d&#39;amélioration dans le tissu cardiaque dystrophique. L&#39;efficacité de morpholinos dans le cœur est considéré comme faible en raison de la capacité de pénétration cellulaire pauvres. PPMOs peptidiques conjugués ont permis d&#39; améliorer la capacité d&#39;AON de pénétrer les cellules cardiaques, augmentant ainsi la quantité de protéine de dystrophine fonctionnelle secourue au coeur 3,19,38. Ici, notre approche cocktail AON est longuement discuté, y compris la conception de séquences AON en utilisant le logiciel ESEfinder 43. Protocols pour des expériences de chien avec multi-saut d&#39;exon sont également décrits. CXMD J beagles ont été utilisés pour les exons 6 et 8 expériences à sauter. Multi-saut d&#39;exon dans le modèle de chien CXMD montre des résultats prometteurs, mais des défis demeurent qui doivent être surmontés avant qu&#39;ils ne soient cliniquement applicables.

<table><tbody><tr><td colspan="4">2'OMePS Transfection de myoblastes de chien"nbsp ; </td></tr><tr><td>3 ml Plaques 6 puits</td><td>IWAKI</td><td>5816-006</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' Eagle modifié' s medium (DMEM)&nbsp ;</td><td>Gibco</td><td>11965-092</td><td></td></tr><tr><td>Sérum fœtal bovin (FBS)&nbsp ;</td><td>HyClone</td><td>SH30071.01</td><td></td></tr><tr><td>Pénicilline&nbsp ;</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp ;</td><td>P4333&nbsp ;</td><td>200 U/ml&nbsp ;</td></tr><tr><td>Lipofectine&nbsp ;</td><td>Invitrogen&nbsp ;</td><td>18292-011</td><td>Volume total de 100 ml dans un milieu opti-MEM dans un rapport de 2:1 pour la lipofectine. 10 ml de lipofectine pour 5 mg d’ARN.</td></tr><tr><td>2' OMePS</td><td>Eurogentec&nbsp ;</td><td></td><td>Ex6A (GUU GAUUGUCGGACCCAGCUCAGG), Ex6B (ACCUAUGA CUGUGGAUGAGAGCGUU), et Ex8A (CUUCCUGG AUGGCUUCAAUGCUCAC).&nbsp ;</td></tr><tr><td>Sérum de Cheval&nbsp ;</td><td>Gibco</td><td>16050-114</td><td>2 %</td></tr> <tr><td>streptomycine&nbsp ;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4333² ;</td><td>200 et #956 ; g/ml</td></tr><tr><td>d’albumine sérique bovine (BSA)&nbsp ;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9418&nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>Insuline</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Transfection morpholino des myoblastes de chien 
Tout le matériel issu de la transfection MePS de myoblastes de chien pour la culture de</td></tr><tr><td>morpholinos antisens.</td><td>Outils géniques</td><td></td><td>Ex6A(GTTGATTGTCGGACCCAGC TCAGG), Ex6B(ACCTATGACTGTGGATGAG AGCGTT),&nbsp ; Ex8A(CTTCCTGGATGGCTTCAAT GCTCAC)&nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; Diluer jusqu’à un volume final de 100 L dans un milieu opti-MEM.&nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; 120&ndash ; 200 mg/kg de morpholinos à 32 mg/ml dans une solution saline</td></tr><tr><td>Endo-Porter</td><td>Gene-tools</td><td></td><td></td></tr><tr><td>guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform</td><td>Invitrogen</td><td>15596-018</td><td>1&nbsp ; ml/plaque</td></tr><tr><td colspan="4"><Extraction de l’ARN fort et réaction en chaîne >par polymérase par transcription inverse (RT-PCR)</td></tr><tr><td>guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform</td><td>Invitrogen</td><td>15596-018</td><td>1&nbsp ; ml/plaque</td></tr><tr><td>Chloroforme</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3803</td><td>200 &#956 ; l&nbsp ;</td></tr><tr><td>Tubes de 1,5 ml&nbsp ;</td>Centrifugeuse <td>22363204</td><td></td> <td>Eppendorf</td></tr><tr><td>&nbsp ;</td><td>Beckman-Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>75 % d’éthanol</td><td>Spectromètre UV Sigma-Aldrich</td><td>34852</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp ;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Amorce avant dans l’exon 5</td><td>Invitrogen</td><td></td><td>CTGACTCTTGGTTTGATTTGGA&nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; 1,5 &#956 ; l 10 &#956 ; Amorce</td></tr><tr><td>M Reverse dans l’exon 10&nbsp ;</td><td>Invitrogen</td><td></td><td>TGCTTCGGTCTCTGTCAATG&nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; 1,5 &#956 ; l 10 &#956 ; M</td></tr><tr><td>dNTPs</td><td>Clontech</td><td>3040</td><td></td></tr><tr><td>Kit RT-PCR en une étape&nbsp ;</td><td>Qiagen&nbsp ;</td><td>210210</td><td></td></tr><tr><td>Thermocycleur</td><td>Scinco</td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4"><fort>Séquençage de l’ADN complémentaire (ADNc)&nbsp ; </td></tr><tr><td>Kit d’extraction de gel&nbsp ;</td><td>Qiagen&nbsp ;</td><td>28704</td><td></td></tr><tr><td>Centrifugeuse&nbsp ;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kit de séquençage de cycle Terminator v3.1&nbsp ;</td><td>Biosystèmes appliqués&nbsp ;</td><td>4337454</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Injections intramusculaires ou biopsie musculaire ouverte</td></tr><tr><td>Surgical Tools</td><td></td><td></td><td>Ciseaux, scalpel, aiguille, fil chirurgical&nbsp ;</td></tr><tr><td>Pommade vétérinaire&nbsp ;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Iodophores&nbsp ;</td><td>webtextiles</td><td>12190-71-5</td><td></td></tr><tr><td>chlorohexidine</td><td>Peridex</td><td>12134</td><td></td></tr><tr><td>Champs chirurgicaux&nbsp ;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gommages</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Masque Facial&nbsp ;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gants chirurgicaux&nbsp ;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Couvre-chef&nbsp ;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Thiopental sodique&nbsp ;</td><td>Mitsubishi Tanabe Pharma</td><td></td><td>20 mg/kg&nbsp ;</td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Laboratoires Abbott&nbsp ;</td><td>05260-05</td><td>2-3 %</td></tr><tr><td>Morpholinoles antisens&nbsp ;</td><td>Outils géniques</td><td></td><td>Ex6A(GTTGATTGTCGGACCCAGC TCAGG), Ex6B(ACCTATGACTGTGGATGAG AGCGTT),&nbsp ; Ex8A(CTTCCTGGATGGCTTCAAT GCTCAC)&nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; Diluer jusqu’à un volume final de 100 L dans un milieu opti-MEM.&nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; 120&ndash ; 200 mg/kg de morpholinos à 32 mg/ml dans une solution saline</td></tr><tr><td>27° ; G Aiguilles</td><td>TERUMO&nbsp ;</td><td>SG3-2325&nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>Seringue de 50 ml</td><td>TERUMO</td><td>SG2-03L2225</td><td></td></tr><tr>chlorhydrate <td></td><td></td><td></td>de<td>buprénorphine</td></tr><tr><td>Abaisse-langue&nbsp ;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>céphalexine</td><td></td><td>15 à 30 mg/kg&nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>céfazoline</td><td></td><td>15 à 30 mg/kg&nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>buprénorphine&nbsp ;</td><td></td><td>0,01 mg/kg</td><td></td></tr><tr><td>de chlorhydrate de buprénorphine&nbsp ;</td><td>0,02 mg/kg</td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4"><fort>injections systémiques</fort></td></tr><tr><td>pompe à perfusion à seringue&nbsp ;</td><td>Muromachi&nbsp ;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>22&nbsp ; G Aiguilles à demeure</td><td>TERUMO</td><td>SG3-2225&nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>27&nbsp ; Aiguilles G&nbsp ;</td><td>TERUMO&nbsp ;</td><td>SG3-2325&nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>Seringue 50 ml</td><td>TERUMO</td><td>SG2-03L2225&nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>Saline</td><td>Ohtsuka-Pharmaceutical</td><td>28372</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Classification clinique des chiens</td></tr><tr><td>Caméra vidéo&nbsp ;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Chronomètre&nbsp ;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4"><fort>Imagerie par résonance magnétique (IRM)&nbsp ; </td></tr><tr><td>3 Tesla MRI l&nbsp ;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bobine</td><td></td><td></td><td></td> d’extrémité humaine de 18 cm de diamètre/18 cm de longueur</tr><td colspan="4">Échantillonnage et préparation musculaire (nécropsie)Thiopental sodium&nbsp ;<tr></td></tr><tr><td></td><td>Mitsubishi Tanabe Pharma</td><td></td><td>20 mg/kg&nbsp ;</td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Laboratoires Abbott&nbsp ;</td><td>05260-05</td><td>2-3 %</td></tr><tr>Gomme <td></td><td></td><td>adragante</td><td>10-20 ml</td></tr><tr><td>Azote liquide&nbsp ;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Disques en liège</td><td>Iwai-kagaku&nbsp ;</td><td>101412-806</td><td></td></tr><tr><td>Pince à épiler</td> pour <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr> glace sèche <tr><td>Poly-L-lysine&ndash ; lames revêtues</td><td>Fisher</td><td>22-037-216</td><td></td></tr><tr><td>Microsystème de cryostat&nbsp ;</td><td>Leica&nbsp ;</td><td></td><td>cm1900&nbsp ;</td></tr><tr><td colspan="4">Immunohistochimie&nbsp ;</td></tr><tr><td>DYS1&nbsp ;</td><td>Novocastra&nbsp ;</td><td>NCL-DYS1&nbsp ;</td><td>Dilutions 1:150</td></tr><tr><td>DYS2</td><td>Novocastra&nbsp ;</td><td>NCL-DYS2&nbsp ;</td><td>Dilutions de 1:150</td></tr><tr><td>Alexa 594 chèvre antisouris IgG1&nbsp ;</td><td>Invitrogen</td><td>A-21125</td><td>dilutions 1:2 500</td></tr><tr><td>Alexa 594 chèvre antisouris IgG2&nbsp ;</td><td>Invitrogen</td><td>A-11005</td><td>1:2 500 dilutions</td></tr><tr><td>DAPI&nbsp ;</td><td>Invitrogen</td><td>D1306</td><td>Contient un agent de montage</td></tr><tr><td>Sérum de chèvre&nbsp ;</td><td>Invitrogen</td><td>10000C</td><td>15 %</td></tr> <tr><td>PBS</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Chambre d’humidité&nbsp ;</td><td>Laboratoire de Devise Scientifique&nbsp ;</td><td>197-BL</td><td></td></tr><tr><td>Glissière de chambre&nbsp ;</td><td>Lab-tek&nbsp ;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>154453 Lunettes de protection&nbsp ;</td><td>Fisher</td><td>12-540A</td><td></td></tr><tr><td>Stylo barrière hydrophobe&nbsp ;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscope fluorescent</td><td></td><td></td><td>594 nm à un grossissement de 20X.&nbsp ;</td></tr><tr><td colspan="4"><fort>Western Blot&nbsp ; </forte></td></tr><tr><td>Eau distillée&nbsp ;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Homogénéisateur manuel&nbsp ;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2&fois ; Laemmli SD-loading buffer&nbsp ;</td><td></td><td></td><td>0,1 M Tris&ndash ; HCl (pH 6,6), 2 % (p/v) SDS, 2 % (0,28 &nbsp ; M) bêta-mercaptoéthanol, 20 % de glycérol, 0,01 % de bleu de bromophénol</td></tr><tr><td>Gels SDS&nbsp ;</td><td>Bio-Rad&nbsp ;</td><td>161-1210</td><td>Gels SDS à résolution à 5 %</td></tr><tr><td></td><td>Invitrogen&nbsp ;</td><td>Invitrogen, WG1601BOX</td><td>membrane PVDF 3-8</td></tr><tr><td> %&nbsp ;</td><td>GE</td><td>10600021</td><td></td></tr><tr><td>Méthanol</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tampon de coulée (10&times ;)&nbsp ;</td><td></td><td></td><td>250 mM de Tris-Base, 1 920 mM de Glycine</td></tr><tr><td>Tampon courant (1&times ;)</td><td></td><td></td><td>10 % 10&times ; tampon, 20 % méthanol&nbsp ;</td></tr><tr><td>0,05 % PBS/Tween 20 (PBST)&nbsp ;</td><td></td><td></td><td>2 000 ml&nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; 3& fois ; 200 ml pour le lavage</td></tr><tr><td>PBST/5 % de lait en poudre&nbsp ;</td><td></td><td></td><td>100 ml</td></tr><tr><td>Kit de dosage des protéines</td><td>BCA</td><td>T9650</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20&nbsp ;</td><td>Sigma&nbsp ;</td><td>P5927</td><td></td></tr><tr><td>Urée</td><td>Sigma&nbsp ;</td><td>U5378</td><td></td></tr><tr><td>Bêta-Mercaptoéthanol&nbsp ;</td><td>Millipore</td><td>ES-007-E</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Sigma</td><td>L3771</td><td></td></tr><tr><td>Tris-Acétate</td><td>Sigma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tris HCl</td><td>Sigma</td><td>T3253</td><td></td></tr><tr><td>Glycérol</td><td>Sigma</td><td>G8773</td><td></td></tr><tr><td>Tampon de chargement/échantillon pour Western blot</td><td>NuPage Invitrogen</td><td>NP007</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S3014</td><td></td></tr><tr><td>PMSF</td><td>Sigma</td><td>P7626</td><td></td></tr><tr><td>Inhibiteur du cocktail de protéase&nbsp ;</td><td>Roche</td><td>11836153001</td><td></td></tr><tr><td>Tampon cathodique</td><td></td><td></td><td>0,025 M Base Tris + 40&nbsp ; Acide 6-aminocaproïque mM + 20 %</td></tr><tr><td>de tampon</td><td></td><td></td> d’anode de méthanol <td>0,03 M Base Tris + 20 %</td>de</tr><tr><td></td><td></td> tampon<td>d’anode concentré de</td> méthanol <td>0,3 M Base Tris + 20 % d’anticorps</td></tr><tr><td>anti-méthanol desmin.</td><td>Abcam</td><td>ab8592</td><td></td></tr><tr><td>DYS1&nbsp ;</td><td>Novocastra&nbsp ;</td><td>NCL-DYS1&nbsp ;</td><td>Dilutions 1:150</td></tr><tr><td>Logiciel</td><td></td><td></td><td></td> ImageJ</tr></tbody></table>

multi-exon sauter utilisation oligonucleotides cocktail antisens dans la dystrophie musculaire canine liée à l&#39;x

Multi-exon Skipping Using Cocktail Antisense Oligonucleotides in the Canine X-linked Muscular Dystrophy

La dystrophie musculaire de Duchenne (DMD) est une des maladies les plus courantes létaux génétiques dans le monde entier, causées par des mutations dans le dystrophine (DMD) gène. Le saut d&#39;exon emploie / molécules d&#39;ARN-like ADN court appelés oligonucléotides antisens (AON) qui restaurent le cadre de lecture et produisent des protéines plus courtes mais fonctionnelles. Cependant, la thérapie de sauter exon se heurte à deux obstacles majeurs: applicabilité limitée (jusqu&#39;à seulement 13% des patients peuvent être traités avec un seul médicament AON), et la fonction incertaine des protéines tronquées. Ces questions ont été abordées avec une approche cocktail AON. Alors qu&#39;environ 70% des patients atteints de DMD peut être traitée par un simple saut d&#39;exon (tous les exons combinés), on pourrait potentiellement traiter plus de 90% des patients atteints de DMD si exon multiples sauter à l&#39;aide cocktail médicaments antisens peut être réalisée. a été utilisé La canine liée à l&#39;X dystrophie musculaire (CXMD) modèle de chien, dont le phénotype est plus semblable aux patients DMD humains, pour tester l&#39;effic systémiquealpha- et de sécurité multi-saut d&#39; exon des exons 6 et 8. Le modèle de chien CXMD héberge une mutation du site d&#39;épissage dans l&#39; intron 6, conduisant à un manque de l&#39; exon 7 dans l&#39; ARNm de la dystrophine. Pour rétablir le cadre de lecture dans CXMD nécessite multi-exon skipping des exons 6 et 8; par conséquent, CXMD est un bon modèle animal de taille moyenne, pour tester l&#39;efficacité et la sécurité des multi-saut d&#39;exon. Dans l&#39;étude actuelle, un cocktail de morpholinos antisens ciblant l&#39;exon 6 et l&#39;exon 8 a été conçu et restauré l&#39;expression de la dystrophine dans les muscles squelettiques du corps entier. Méthodes de transfection / injection d&#39;oligos de cocktail et de l&#39;évaluation de l&#39;efficacité et la sécurité des multi-saut d&#39;exon dans le modèle de chien CXMD sont présentés.

Des expériences in vitro Les myoblastes ont été transfectées avec diverses conditions de traitement des 2&#39;OMePS afin de comparer l&#39;efficacité de chaque AON. traitements AON simples avec 600 nM chacune des Ex6A, Ex6B, Ex8A ou Ex8B ont été réalisées, ainsi qu&#39;un traitement de cocktail avec 600 nM chacune des 4 séquences AON. Des échantillons d&#39;ARN ont été prélevés quatre jours après la transfection. Après la RT-PCR, les échantillons pour chaque traitement ont été effectués sur un gel avec (NT) des échantillons non traités. Les bandes plus élevées sur le gel représentent out-of-frame produits DMD; ces bandes ont été observées chez NT, Ex8A et Ex8B myoblastes traités. Ex6A, Ex6B, Ex8A, et les myoblastes cocktail traités ont montré des produits en cadre. Le cocktail et Ex6A / B ont montré des produits 100% en cadre, tandis que Ex8A a montré que 30% des produits en cadre (figure 7). Pour confirmer le saut d&#39;exon et la restauration desle cadre de lecture, le séquençage d&#39;ADNc a été réalisée; les résultats indiquent que les exons 6-9 avaient en effet été ignorés (figure 7). L&#39; immunohistochimie a montré que les chiens traités par AON avaient augmenté de fibres dystrophine positives par rapport aux échantillons NT (figure 8). Des expériences in vivo Pour comparer l&#39;efficacité des différentes conditions de traitement AON, chiens CXMD (0,5 - 5 ans) ont été injectés une fois avec 1,2 mg Ex6A ou un cocktail de Ex6A, Ex6B et Ex8A à diverses doses. Deux semaines après l&#39;injection, des échantillons de muscles ont été prélevés et colorés avec DYS-1 à comparer le nombre de fibres dystrophine positives. Tous les échantillons de cocktail-traités ont montré une expression accrue de la dystrophine par rapport aux échantillons NT. Fibres dystrophine positives augmentent avec AON dosage (figure 9). système Suiteinjection ic, de type sauvage (WT), NT, et CXMD échantillons de muscle cocktail traités ont été colorés avec DYS-1 (figure 10). chiens CXMD Cocktail traités ont montré une augmentation expression de la dystrophine par rapport aux chiens NT CXMD, tant en CT et des échantillons du muscle cardiaque. Cependant, le muscle squelettique AON-traitée (CT) a montré une expression beaucoup plus élevé de dystrophine par rapport au muscle cardiaque traitée. Un immunoblot comparant WT, NT, et divers muscles cocktail traités morpholino a conduit à la même conclusion. Il y avait aussi une large gamme d&#39;expression de la dystrophine dans les échantillons de muscles squelettiques traités (figure 10). Hématoxyline et éosine (HE) ont révélé que la coloration traité CXMD les chiens ont montré une amélioration histopathologie, avec une diminution significative des fibres au centre nucléés (CNF) par rapport aux chiens NT CXMD (figure 11). Cela indique qu&#39;il ya plus de dégénérescence / régénération survenant chez le chien NT, un signe de pathologie dystrophique musculaire. En outre, les chiens traités ont rapidementles temps et les scores améliorés en cours d&#39;exécution sur l&#39;échelle de notation clinique. Chiens CXMD traités ont montré de meilleurs scores que les chiens NT CXMD dans toutes les catégories (figure 12). <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/53776/53776fig1.jpg" /> Figure 1. Mutation Motif du Chien CXMD et exons 6 -. 8 Stratégies Skipping Utilisation d&#39; un cocktail antisens chiens CXMD ont une mutation ponctuelle dans l&#39; exon 6 conduisant à une perte de l&#39; exon 7 dystrophique chien ARNm. Il en résulte l&#39;ARNm étant hors de trame et la production de protéine dystrophine est perdue. séquences AON courtes sont conçues pour se lier à l&#39;exon 6 et 8, qui se traduit par épissage de l&#39;ARNm sauter efficacement exons 6 - 8. La barre grise dans les chiens de cocktail traités AON représente de courtes séquences AON. Exon 9 code pour un domaine de charnière et est parfois spontanément épissé avec AONs contre exon 6 et 8. Les codes d&#39;ARNm résultant de la dystrophine protéines qui sont plus courtes, mais la fonctional. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53776/53776fig1large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/53776/53776fig2.jpg" /> Figure 2. Les symptômes cliniques majeures d&#39;un 1-year-old Canine X-linked Dystrophie musculaire (CXMD) des animaux. A 1-year-old beagle de type sauvage et un chien de CXMD sont présentés. L&#39;implication des proximal, des membres et des muscles temporaux sont généralement observés à partir de 2 mois d&#39;âge. Contracture commune et un déplacement du bassin sont manifestes à partir de 4 mois. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53776/53776fig2large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <img alt="Figure 3" src="/files/ftp_upload/53776/53776fig3.jpg" /> Figure 3. anesthésie générale pour un chien. A) Intramusculinjections ar et biopsies musculaires sont réalisées sous anesthésie générale avec de l&#39;isoflurane. B) La tenue de l&#39;animal pour des injections systémiques. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53776/53776fig3large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <img alt="Figure 4" src="/files/ftp_upload/53776/53776fig4.jpg" /> Figure 4. Imagerie par résonance magnétique (IRM) de type sauvage, non-traitée CXMD et traitée CXMD. IRM du membre postérieur à 3 mois et 5 mois dans WT et NT CXMD chiens. Deux exemples d&#39;images de traités de derrière CXMD Limb IRM (1 semaine avant la première injection) et post-injection de AON sont présentés. 2703MA a été traité par semaine 7x avec 200 mg / kg morpholinos cocktail. 2001MA a été traité avec 5 fois par semaine par injection intraveineuse de 120 mg / kg de cocktail morpholinos. Contrôle et chiens traités ont été appariés selon l&#39;âge. Les chiens traités montrent une diminution des signaux T2. Les images sont adap<html> ted avec la permission de Yokota et al. (copyright 2009, John Wiley &amp; Sons) 40 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53776/53776fig4large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <img alt="Figure 5" src="/files/ftp_upload/53776/53776fig5.jpg" /> Figure 5. Muscle Biopsie pour un chien. A) Un membre inférieur est fixé pour la biopsie musculaire. B) Avec l&#39;aide de pinces, le membre inférieur est maintenu. C) Le muscle CT est exposé. technique de biopsie ouverte est utilisée pour obtenir des échantillons de muscle de sites injectés. Les fils sont utilisés pour contenir des échantillons de biopsie. Échantillons D) Muscle sur la gomme adragante après dissection. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53776/53776fig5large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> /53776/53776fig6.jpg &quot;/&gt; Figure 6. Méthode de transfert semi-sec. Une représentation de la méthode semi-sèche transfert pour Western blot est présentée. Trois papiers imbibés dans un tampon d&#39;anode concentré sont fixées à la borne négative; 3 papiers imprégnés dans le tampon d&#39;anode sont empilées au-dessus de ce produit. Le papier Mb PVDF est trempée dans un tampon d&#39;anode méthanol, puis avant d&#39;être mis au-dessus des 6 papiers. Le gel, qui a été trempée dans du tampon de cathode, est posé doucement sur le papier de PVDF. Enfin, 3 papiers imprégnés dans le tampon de cathode sont disposées au-dessus du gel. La borne positive est fixée sur le dessus. Pour 1 heure, 400 mA est géré par le système. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53776/53776fig6large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <img alt="Figure 7" src="/files/ftp_upload/53776/53776fig7.jpg" /> Figure 7. Exon Skipping dans CXMD myoblastes. </strong&gt; myoblastes CXMD ont été transfectées avec Ex6A, Ex6B, Ex8A ou Ex8B seul, ou un cocktail de quatre. Un total de 600 nm a été utilisée pour les séquences individuelles et pour le cocktail 600 nM de chaque séquence a été utilisée. A) 2&#39;OMePS traitement dans CXMD myoblastes de chien. Ex6A, Ex6B, et les échantillons de cocktail traités montrent des bandes fortes à la position attendue de transcrits en cadre exon-sautée. Ex8A montre une bande intermédiaire, Ex8B montre une bande faible, et NT ne montre pas une bande à la position dans le cadre. B) le séquençage de l&#39;ADNc à partir Ex6A seul 4 jours après la transfection. Les images sont adaptés avec la permission de Yokota et al. (Copyright 2009, John Wiley &amp; Sons) 40. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53776/53776fig7large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <img alt="Figure 8" src="/files/ftp_upload/53776/53776fig8.jpg" /> Dystrop figure 8. Augmentationhin Expression dans 2&#39;O-méthylés phosphorothioate (2&#39;OMePS) transfectées CXMD myoblastes. myoblastes CXMD ont été transfectées avec Ex6A seul ou avec 2&#39;OMePS cocktails. DYS-2 (rouge) et DAPI (bleu) coloration sont présentés. Les myoblastes traités sont comparés au type sauvage (WT) et (NT) myoblastes non traités. Les images sont adaptés avec la permission de Yokota et al. (Copyright 2009, John Wiley &amp; Sons) 40. Bar = 50 pm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53776/53776fig8large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <img alt="Figure 9" src="/files/ftp_upload/53776/53776fig9.jpg" /> Figure 9. Expression de sauvetage de la dystrophine avec des injections intramusculaires Morpholinos dans CXMD chiens. Soit Ex6A seul ou un cocktail de Ex6A, Ex6B et Ex8A ont été injectés dans les muscles des chiens CT CXMD. Dystrophine (DSY-1) coloration de type sauvage(WT), non-traités (NT), et les chiens CXMD traités sont présentés. Les chiens ont été soit traités avec 1,2 mg Ex6A seul ou 1,2 mg cocktail. Les images sont adaptés avec la permission de Yokota et al. (Copyright 2009, John Wiley &amp; Sons) 40. Bar = 100 um. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53776/53776fig9large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <img alt="Figure 10" src="/files/ftp_upload/53776/53776fig10.jpg" /> Figure 10. Augmentation de la dystrophine Expression Après Cocktail systémique Traitement morpholino dans CXMD Chiens. Dystrophine (DYS-1) coloration a été utilisé pour comparer l&#39; expression de la dystrophine dans le type sauvage (WT) (contrôle positif), non traité (NT) (contrôle négatif), et les chiens CXMD traités avec 120 mg / kg de cocktail morpholino (40 mg / kg de chaque AON). Le cocktail morpholino contenait Ex6A, Ex6B et Ex8A. Les chiens ont été injectés par voie intraveineuse 5 fois nousekly avec ce cocktail. A) Une comparaison de l&#39;expression de la dystrophine dans tibial cranial (CT) muscles du WT, NT, et les chiens traités. B) Une comparaison de l&#39;expression de la dystrophine dans le tissu cardiaque entre NT et morpholino chiens cocktail traité. C) Immunoblot pour dystrophine avec desmine comme un contrôle de chargement est indiqué pour WT, NT, et morpholino chiens cocktail traité. Les muscles suivants sont présentés pour les chiens traités: triceps brachial (TB), biceps brachial (BB), le diaphragme (DIA), de l&#39;œsophage (ESO), CT, adductor (ADD), extensor digitorum longus (EDL), masséter (MAS), et le cœur. Les images sont adaptés avec la permission de Yokota et al. (Copyright 2009, John Wiley &amp; Sons) 40. Bar = 200 um. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53776/53776fig10large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <img alt="Figure 11" src="/files/ftp_upload/53776/53776fig11.jpg" /> Figure11. Amélioration de l&#39; histopathologie en CXMD chiens traités pendant 7 semaines avec 240 mg / kg morpholino Cocktail. Chiens CXMD allant d&#39;une demi - année à l&#39; âge de cinq ans ont été injectés par voie intraveineuse avec 240 mg / kg morpholino cocktail (Ex6A, Ex6B et Ex8A) une fois semaine pendant 7 semaines. Quatorze jours après la dernière injection, les muscles de l&#39;œsophage ont été prises et hématoxyline et l&#39;éosine (HE) coloration a été fait. HE coloration des muscles de l&#39; œsophage de non-traités (NT) et morpholino cocktail traité (traité) chiens CXMD (40X objectif). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53776/53776fig11large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <img alt="Figure 12" src="/files/ftp_upload/53776/53776fig12.jpg" /> Figure 12. Scores amélioré classement clinique et 15 m Temps de marche Après les chiens Traitement morpholino. Morpholino-traités ont été comparés aux non-traités (NT) littermates. Les barres d&#39;erreur dans le graphique indiquent SEM. A) Le score total sur l&#39;examen de classement clinique a été calculé avant et après le traitement et les animaux traités ont été comparés avec les congénères NT. B) Une comparaison de 15 m temps de course de chiens traités et NT. C) similaires à B; Cependant, les jeunes chiens ont été utilisés. Les images sont adaptés avec la permission de Yokota et al. (Copyright 2009, John Wiley &amp; Sons) 40. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53776/53776fig12large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> oligonucléotide antisens </td><td> Nucleotide Sequence </td></tr><tr><td> Ex6A </td><td> GTTGATTGTCGGACCCAGCTCAGG </td></tr><tr><td> Ex6B </td><td> ACCTATGACTGTGGATGAGAGCGTT </td></tr><tr><td> Ex8A </td><td> CTTCCTGGATGGCTTCAATGCTCAC </td></tr></tbody></table> Tableau 1. Conception Oligonucléotide anti - sens.

Le saut d&#39;exon est actuellement une option thérapeutique la plus prometteuse pour la dystrophie musculaire de Duchenne (DMD). Pour étendre l&#39;applicabilité des patients atteints de DMD et d&#39;optimiser la stabilité / fonction des protéines de la dystrophine tronquée résultant, un multi-saut d&#39;exon approche utilisant des oligonucléotides antisens cocktail a été développé et nous avons démontré systémique sauvetage de la dystrophine dans un modèle de chien.

Multi-exon Sauter Utilisation Oligonucleotides Cocktail antisens dans la dystrophie musculaire Canine liée à l&#39;X

Duchenne muscular dystrophy (DMD) is one of the most common lethal genetic diseases worldwide, caused by mutations in the dystrophin (DMD) gene. Exon ...

L'objectif général de cette expérience est d'évaluer l'efficacité et la toxicité du saut multiple d'exons à l'aide d'un cocktail d'oligonucléotides antisens ou AONs dans un modèle canin de la dystrophie musculaire de Duchenne, ou DMD. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés de la recherche translationnelle sur la thérapie par saut d'exons antisens, notamment si les oligonucléotides antisens sont capables d'induire un saut multiple d'exons et de supprimer l'expression de la dystrophine dans un modèle animal de grande taille. Le principal avantage de l'utilisation du modèle canin dans une étude réside dans le fait que les résultats thérapeutiques observés chez les animaux de grande taille peuvent être extrapolés de manière plus fiable aux patients atteints de DMD.Bien que le saut d'exon soit une thérapie très prometteuse pour la DMD, elle peut également être appliquée à d'autres maladies génétiques, telles que la dystrophie musculaire congénitale et la dystrophie musculaire des ceintures. La démonstration des expériences in vitro sera effectuée par le Dr Yoshitsugu Aoki, chef de notre laboratoire, et la démonstration des expériences in vivo sera effectuée par le Dr Mutsuki Kuraoka, chercheur postdoctoral de mon département. Après avoir conçu les AON conformément au protocole décrit, utilisez des plaques de 6 puits pour ensemencer de un à cinq fois 10 à la puissance trois myoblastes CXMD par centimètre carré dans trois millilitres de DMEM contenant 10 % de FBS et 1 % de pénicilline-streptomycine.Incuber les cellules à 37 degrés Celsius jusqu'à ce qu'elles atteignent une confluence de 60 à 80 %. Lorsque les cellules atteignent la confluence souhaitée, utiliser un milieu à sérum réduit pour diluer un réactif de transfection à base de liposomes cationiques jusqu'à un volume total de 100 microlitres, puis laisser le mélange se reposer à température ambiante pendant 30 à 45 minutes. Ensuite, à l'aide du milieu à sérum réduit, diluer les AON jusqu'à un volume final de 100 microlitres.Combinez le réactif de transfection dilué avec les AON dilués et incubez à température ambiante pendant 10 à 15 minutes. Pendant ce temps, retirez le milieu des cellules et lavez les cellules trois fois avec du milieu frais. Ensuite, ajoutez 0,8 millilitre de milieu au mélange de transfection, puis ajoutez l'ensemble de la solution aux cellules récemment lavées.Incuber à 37 degrés Celsius pendant trois heures. Ensuite, ajouter le milieu de différenciation, ou DM, aux cellules et incuber jusqu'à 10 jours pour permettre la différenciation. À partir du troisième jour environ, vérifier l'apparition de la différenciation.Pour réaliser la transfection par morpholinos de myoblastes canins, cultiver les myoblastes CXMD comme indiqué précédemment dans cette vidéo. Chauffer les morpholinos du cocktail à 65 degrés Celsius pendant 10 minutes. Puis ajouter un réactif de livraison peptidique et ajuster la concentration en morpholino à une concentration finale de trois à six micromolaire.Ensuite, utilisez le DM pour remplacer le milieu des myoblastes, puis ajoutez l'oligomère morpholino dans chaque puits à une concentration finale de un micromolaire. Incubez pendant 16 à 18 heures. Puis, afin de recueillir les cellules pour l'extraction d'ARN, ajoutez un millilitre de thiocyanate de guanidinium-phénol-chloroforme aux cellules pour les détacher de la plaque. Après avoir incubé les cellules à température ambiante pendant 10 minutes, transférez les cellules dans des tubes de 1,5 millilitre. Ajoutez 200 microlitres de chloroforme dans chaque tube, puis incubez à température ambiante pendant deux minutes jusqu'à l'apparition de trois couches distinctes : la couche d'ARN, la couche de protéines et la couche d'ADN. Faites centrifuger les tubes à 12 000 ×g et à 4 degrés Celsius pendant 15 minutes.Ensuite, retirez la couche supérieure du surnageant et transférez-le dans un tube contenant 500 microlitres d'isopropanol. Faites centrifuger les tubes de surnageant avant de retirer le surnageant et de conserver le culot d'ARN. Lavez le culot avec de l'éthanol et centrifugez à 8 000 ×g et à quatre degrés Celsius pendant cinq minutes.Retourner le tube pendant 15 minutes afin d'évaporer l'éthanol résiduel avant d'ajouter de 15 à 30 microlitres d'eau exempte de RNase. Ensuite, utiliser la spectroscopie UV-Vis à 260 nanomètres pour quantifier l'ARN. Pour réaliser la RT-PCR, mélanger les réactifs suivants et ajouter de l'eau jusqu'à un volume final de 25 microlitres.Placer les échantillons dans un thermocycleur et exécuter le programme suivant. Une fois l'analyse terminée, conserver le produit à quatre degrés Celsius ou à 20 degrés Celsius. Pour réaliser une injection intramusculaire, après avoir préparé l'animal pour la chirurgie et l'avoir anesthésié conformément au protocole décrit, utiliser un scalpel pour inciser la peau sur environ cinq centimètres de manière longitudinale au-dessus du tibia crânien, ou CT. Pour marquer les sites d'injection, utiliser une aiguille chirurgicale et du fil chirurgical afin de suturer la fascia profonde en réalisant deux points de repère espacés de deux centimètres.Il est très important de marquer le site d'injection avec du fil, car cela permet une biopsie plus précise. Ensuite, à l’aide d’une aiguille de 27 gauge, injectez la concentration souhaitée d’AON dans le muscle, puis laissez l’aiguille en place pendant une minute. Puis, pour réaliser une biopsie musculaire ouverte, utilisez un scalpel chirurgical pour prélever un fragment de tissu musculaire d’environ deux centimètres de longueur sur le muscle CT.Replacer le fascia musculaire par-dessus le muscle et utiliser un fil résorbable 000 pour fermer le tissu. Ensuite, utiliser un fil de nylon 000 pour fermer la peau. À l’aide d’une aiguille, administrer une injection intramusculaire de 0,02 milligrammes par kilogramme de chlorure de buprénorphine.Pour injecter un cocktail contenant des quantités égales de chaque OAN dans une veine d’un membre, tout en tenant l’animal conformément au protocole décrit, insérez une aiguille intraveineuse dans une veine du membre. À l’aide d’une pompe à perfusion ou d’un dispositif d’injection, injectez un volume total de 50 millilitres à raison de 2,5 millilitres par minute pendant 20 minutes, en suivant les instructions du fabricant. Répétez les injections chaque semaine ou toutes les deux semaines, car l’expression de la dystrophine s’accumulera avec des injections répétées.Effectuer des analyses sanguines hebdomadaires pour examiner la toxicité : utiliser une aiguille afin de prélever trois millilitres de sang à partir d'une des veines sous-cutanées d'un membre antérieur ou postérieur. Suivre les instructions du fabricant et inclure les évaluations suivantes. Réaliser des analyses supplémentaires conformément au protocole décrit.Les myoblastes ont été transfectés avec diverses conditions de traitement par 2'OMePS afin de comparer l'efficacité de chaque OAN. Le gel présenté ici représente des échantillons de RT-PCR provenant d'ARN recueilli quatre jours après le traitement. Les bandes situées en haut du gel représentent des produits DMD hors cadre, observés chez les myoblastes non traités Ex8A et Ex8B traités.Les myoblastes traités avec Ex6A, Ex6B, Ex8A et le cocktail présentaient des produits en phase de lecture. Le séquençage de l'ADNc a confirmé que les exons 6 à 9 avaient été sautés. Comme le montre cette figure, l'immunocytochimie a révélé que les cellules canines traitées aux AON présentaient un nombre accru de fibres positives pour la dystrophine par rapport aux échantillons non traités.Pour comparer l'efficacité de diverses conditions de traitement par AON, des chiens CXMD ont été injectés avec l'Ex6A, ou un cocktail d'Ex6A, d'Ex6B et d'Ex8A à différentes doses. Les échantillons musculaires colorés pour DYS1 montrent une augmentation de l'expression de la dystrophine dans les échantillons traités au cocktail, et le nombre de fibres positives pour la dystrophine a augmenté avec la dose de dystrophine. Après des injections systémiques, les chiens CXMD traités au cocktail ont montré une expression accrue de la dystrophine par rapport aux chiens CXMD non traités, tant dans les échantillons de muscle CT que cardiaque.Cependant, les muscles squelettiques traités par oligonucléotides antisens présentaient une expression de la dystrophine nettement plus élevée par rapport au muscle cardiaque traité. De plus, les chiens CXMD traités présentaient une histopathologie améliorée, avec une diminution significative des fibres à noyau central comparés aux chiens CXMD non traités. Une fois maîtrisées, les expériences in vitro et in vivo peuvent être réalisées en quelques heures si elles sont effectuées correctement.Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de surveiller attentivement l'état de santé du chien. Après son développement, le saut d'exon systémique a ouvert la voie aux chercheurs dans ce domaine pour commencer des essais cliniques chez des patients atteints de DMD. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière de traiter les chiens avec des oligonucléotides antisens.

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