Multi-exon Sauter Utilisation Oligonucleotides Cocktail antisens dans la dystrophie musculaire Canine liée à l'X

L’objectif général de cette expérience est d’examiner l’efficacité et la toxicité du saut d’exons multiples à l’aide d’oligonucléotides antisens ou AON dans un modèle de dystrophie musculaire de Duchenne ou DMD. Cette méthode peut aider à répondre à une question clé dans la recherche translationnelle sur la thérapie de saut d’exon antisens, par exemple si les oligonucléotides antisens peuvent induire plusieurs sauts d’exon et détruire l’expression de la dystrophie dans un grand modèle animal. Le principal avantage de l’utilisation du modèle canin dans une étude est que les résultats thérapeutiques chez les animaux plus grands peuvent être extrapolés de manière plus fiable aux patients atteints de DMD.

Bien que le saut d’exon soit un traitement très prometteur pour la DMD, il peut également être appliqué à d’autres maladies génétiques, telles que la dystrophie musculaire congénitale et la dystrophie musculaire des ceintures. La démonstration des expériences in vitro sera faite par le Dr Yoshitsugu Aoki, notre chef de laboratoire, et la démonstration des expériences in vivo sera faite par le Dr Mutsuki Kuraoka, un boursier postdoctoral de mon département. Après avoir conçu les AON selon le protocole de texte, utilisez des plaques à 6 puits pour ensemencer un à cinq fois 10 à 10 au tiers par centimètre carré de myoblastes CXMD dans trois millilitres de DMEM avec 10 % de FBS et 1 % de pen-streptocoque.

Incuber les cellules à 37 degrés Celsius jusqu’à ce qu’elles soient confluentes à 60 à 80 %. Lorsque les cellules atteignent la confluence souhaitée, utilisez un milieu sérique réduit pour diluer un réactif de transfection de liposomes cationiques à un volume total de 100 microlitres, et laissez le mélange reposer à température ambiante pendant 30 à 45 minutes. Ensuite, avec un milieu sérique réduit, diluez les AON jusqu’à un volume final de 100 microlitres.

Combinez le réactif de transfection dilué avec les AON dilués et incubez à température ambiante pendant 10 à 15 minutes. Pendant ce temps, retirez le milieu des cellules et utilisez un milieu frais pour laver les cellules trois fois. Ensuite, ajoutez 0,8 millilitre de milieu au mélange de transfection, puis ajoutez la solution entière aux cellules fraîchement lavées.

Incuber à 37 degrés Celsius pendant trois heures. Ensuite, ajoutez un milieu de différenciation, ou DM, aux cellules et incubez jusqu’à 10 jours pour que la différenciation se produise. À partir du troisième jour, vérifiez la différenciation.

Pour effectuer la transfection morpholino des myoblastes de chien, cultivez des myoblastes CXMD comme démontré précédemment dans cette vidéo. Faites chauffer le cocktail morpholinos à 65 degrés Celsius pendant 10 minutes. Ajoutez ensuite un réactif de livraison de peptides et ajustez le morpholino à une concentration finale de trois à six micromolaires.

Ensuite, utilisez du DM pour remplacer le milieu dans les myoblastes et ajoutez le morpholino dans chaque puits à une concentration finale d’une micromolaire. Incuber pendant 16 à 18 heures. Ensuite, pour collecter les cellules pour l’extraction de l’ARN, ajoutez un millilitre de thiocyanate-phénol-chloroforme de guanidinium aux cellules pour les détacher de la plaque.

Après avoir incubé les cellules à température ambiante pendant 10 minutes, transférez les cellules dans des tubes de 1,5 millilitre. Ajoutez 200 microlitres de chloroforme dans chaque tube et incubez à température ambiante pendant deux minutes jusqu’à ce que trois couches distinctes soient visibles, la couche d’ARN, la couche de protéines et la couche d’ADN. Centrifuger dans les tubes à 12 000 fois g et quatre degrés Celsius pendant 15 minutes.

Ensuite, retirez la couche supérieure de surnageant et transférez-la dans un tube contenant 500 microlitres d’isopropanol. Faites tourner les tubes du surnageant avant de retirer le surnageant et de conserver la pastille d’ARN. Utilisez de l’éthanol pour laver la pastille et centrifugez-la à 8 000 fois g et quatre degrés Celsius pendant cinq minutes.

Retournez le tube pendant 15 minutes pour évaporer l’éthanol résiduel avant d’ajouter 15 à 30 microlitres d’eau sans RNase. Ensuite, utilisez la spectroscopie UV-Vis à 260 nanomètres pour quantifier l’ARN. Pour effectuer une RT-PCR, mélangez les réactifs suivants et ajoutez de l’eau jusqu’à un volume final de 25 microlitres.

Placez les échantillons dans un thermocycleur et exécutez le programme suivant. Une fois le tirage terminé, conservez le produit à quatre degrés Celsius ou 20 degrés Celsius. Pour effectuer une injection intramusculaire, après avoir préparé l’animal à la chirurgie et l’avoir anesthésié conformément au protocole textuel, utilisez un scalpel pour couper la peau d’environ cinq centimètres longitudinalement sur le tibial crânien, ou CT.To marquer les sites d’injection, utilisez une aiguille chirurgicale et un fil chirurgical pour coudre le fascia profond en faisant deux marqueurs de points à deux centimètres d’intervalle.

Il est très important de marquer le site d’injection avec du fil car cela permet une biopsie plus précise. Ensuite, à l’aide d’une aiguille de calibre 27, injectez la concentration souhaitée d’AON dans le muscle et laissez l’aiguille pendant une minute. Ensuite, pour effectuer une biopsie musculaire ouverte, utilisez un scalpel chirurgical pour prélever un morceau de tissu musculaire d’environ deux centimètres de long du muscle CT

Reposez le fascia musculaire sur le muscle et utilisez un fil résorbable 000 pour fermer le tissu. Ensuite, utilisez du fil de nylon 000 pour fermer la peau. À l’aide d’une aiguille, administrer une injection intramusculaire de 0,02 milligramme par kilogramme de chlorhydrate de buprénorphine.

Pour injecter un cocktail contenant des quantités égales de chaque AON dans une veine d’un membre, tout en tenant l’animal conformément au protocole de texte, insérez une aiguille veineuse à demeure dans une veine d’un membre. À l’aide d’une pompe à perfusion ou d’un tourne-seringue, injectez 50 millilitres au total à 2,5 millilitres par minute pendant 20 minutes, en suivant les instructions du fabricant. Répétez les injections toutes les semaines ou toutes les deux semaines, car l’expression de la dystrophine s’accumulera avec des injections répétées.

Pour effectuer des tests sanguins hebdomadaires afin d’examiner la toxicité, utilisez une aiguille pour prélever trois millilitres de sang dans l’une des veines sous-cutanées du membre antérieur ou postérieur. En suivant les instructions du fabricant, incluez les évaluations suivantes. Effectuer d’autres analyses selon le protocole de texte.

Les myoblastes ont été transfectés avec différentes conditions de traitement 2'OMePS afin de comparer l’efficacité de chaque AON. Le gel présenté ici représente des échantillons RT-PCR d’ARN prélevés quatre jours après le traitement. Les bandes plus hautes sur le gel représentent des produits DMD hors cadre, et ont été observées dans les myoblastes non traités Ex8A et Ex8B traités.

Ex6A, Ex6B, Ex8A et les myoblastes traités en cocktail ont montré des produits dans le cadre. Le séquençage de l’ADNc a permis de vérifier que les exons 6 à 9 avaient été ignorés. Comme le montre cette figure, l’immunocytochimie a révélé que les cellules de chien traitées à l’AON avaient une augmentation des fibres positives à la dystrophine par rapport aux échantillons non traités.

Pour comparer l’efficacité de diverses conditions de traitement à l’ANO, des chiens CXMD ont reçu une injection d’Ex6A, ou d’un cocktail d’Ex6A, d’Ex6B et d’Ex8A à différentes doses. Les échantillons musculaires colorés pour DYS1 montrent une augmentation de l’expression de la dystrophine dans les échantillons traités en cocktail, et les fibres positives à la dystrophine augmentent avec la dose de dystrophine. Après des injections systémiques, les chiens CXMD traités en cocktail ont montré une expression accrue de la dystrophine par rapport aux chiens NT CXMD, à la fois dans les échantillons de TDM et de muscle cardiaque.

Cependant, les muscles squelettiques traités par AON ont montré une expression beaucoup plus élevée de la dystrophine par rapport au muscle cardiaque traité. De plus, les chiens traités ont montré une amélioration de l’histopathologie avec une diminution significative des fibres nucléées centrales par rapport aux chiens NT CXMD. Une fois maîtrisées, les expériences in vitro et in vivo peuvent être réalisées en quelques heures si elles sont effectuées correctement.

Lors de la tentative de cette procédure, il est important de surveiller attentivement l’état de santé du chien. Après son développement, le saut d’exon systémique a ouvert la voie aux chercheurs dans ce domaine pour commencer des essais cliniques sur l’homme chez des patients atteints de DMD. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de traiter les chiens avec des oligonucléotides antisens.