Préparation de tranches de cerveau aiguë en utilisant un optimisé N-méthyl-D-glucamine méthode de recouvrement protecteur

L’objectif global de cette procédure est de préparer des tranches de cerveau saines provenant d’animaux adultes matures qui conviennent aux expériences d’électrophysiologie par patch clamp. Ainsi, cette méthode de récupération protectrice NMDG optimisée pour la préparation de coupes de cerveau permet aux chercheurs d’explorer les propriétés intrinsèques et synaptiques des types de cellules cérébrales dans de nombreuses régions cérébrales différentes et pour des animaux de pratiquement tous âges. Le principal avantage de cette technique particulière est qu’elle permet de préparer des coupes de cerveau qui ont un degré de préservation neuronale plus élevé par rapport aux méthodologies précédentes.

Et aussi que ces tranches de cerveau sont plus adaptées à l’enregistrement par patch clamp. Cette méthode a été optimisée pour le tissu cérébral de souris adulte. Il peut être utilisé pour une variété d’autres espèces, y compris le tissu cérébral humain réséqué neurochirurgicalement.

Pour commencer cette procédure, configurez la station de tranchage avec la trancheuse de tissus et les instruments chirurgicaux. Fixez une pale d’injecteur en céramique de zirconium au bras de la lame à l’aide d’une colle adhésive rapide. Insérez ensuite le porte-échantillon et alignez le bord d’attaque de la lame sur le bord du porte-échantillon.

Laisser un petit espace pour s’assurer que la lame ne gratte pas le métal. Remplissez un bécher de 250 millilitres avec 200 millilitres de NMDG HEPES aCSF. Et pré-refroidissez-le sur de la glace avec une carbogénation constante pendant plus de 10 minutes.

Ensuite, installez la chambre de récupération initiale de la tranche de cerveau en la remplissant de 150 millilitres de NMDG HEPES aCSF. Et placez la chambre dans un bain-marie à 32 à 34 degrés Celsius. Pour installer une chambre de rétention de tranches de cerveau, remplissez le réservoir avec 450 millilitres de HEPES aCSF et laissez-le chauffer à température ambiante sous carbogénation constante jusqu’à l’utilisation.

Ensuite, préparez de l’agarose fondue pour l’enrobage tissulaire en découpant un bloc d’agarose à 2 % dans un plat préalablement préparé à l’aide de l’extrémité ouverte d’un flacon conique de 50 millilitres. Fermez sans serrer le flacon conique, puis passez-le au micro-ondes pendant 10 à 30 secondes jusqu’à ce que l’agarose commence à fondre. Ne pas surchauffer.

Versez l’agarose fondu dans des tubes de 1,5 millilitre. Maintenez l’agarose à l’état fondu à l’aide d’un thermomélangeur réglé à 42 degrés Celsius avec une agitation vigoureuse. Et assurez-vous soigneusement que l’agarose fondue ne se solidifie pas prématurément.

Pré-refroidissez le bloc de refroidissement accessoire pour la trancheuse sur de la glace à ce moment-là. Dans cette procédure, faites une incision sur la peau de la tête pour exposer la calotte. Ensuite, utilisez des ciseaux fins super coupés pour couper la peau de la calotte.

Et faites de petites incisions latéralement des deux côtés de la base ventrale caudale du crâne. Faites des coupes peu profondes supplémentaires en commençant par la face dorsale caudale du crâne, en se déplaçant dans la direction rostrale vers le haut de la ligne médiane dorsale. En prenant soin de ne pas endommager le cerveau sous-jacent.

Après cela, faites une coupe finale en T perpendiculaire à la ligne médiane au niveau des bulbes olfactifs. Ensuite, à l’aide de la pince à bout rond, saisissez le crâne en commençant par la face médiale rostrale et décollez vers la direction latérale caudale d’un côté. Répétez cette procédure pour que l’autre côté s’ouvre.

Et retirez les moitiés dorsales de la calotte crânienne pour exposer le cerveau. Prélevez doucement le cerveau intact dans le bécher de NMDG HEPES aCSF pré-réfrigéré. Et laissez le cerveau refroidir uniformément pendant environ une minute.

Maintenant, utilisez une grande spatule pour transférer le cerveau du bécher sur la boîte de Pétri recouverte de papier filtre. Coupez et montez le cerveau en fonction de l’angle de tranchage préféré et de la région cérébrale d’intérêt souhaitée. Travaillez rapidement pour éviter une privation prolongée d’oxygène pendant la manipulation.

Ensuite, fixez le bloc cérébral sur le porte-échantillon à l’aide de colle adhésive. Rétractez la pièce intérieure du porte-échantillon pour retirer complètement le bloc cérébral à l’intérieur. Versez ensuite l’agarose fondue directement dans le support jusqu’à ce que le bloc cérébral soit entièrement recouvert d’agarose.

Ensuite, fixez le bloc de refroidissement de l’accessoire prérefroidi autour du porte-échantillon pendant dix secondes jusqu’à ce que l’agarose se solidifie. Insérez le porte-échantillon dans le réceptacle de la trancheuse et vérifiez le bon alignement. Ensuite, remplissez le réservoir avec le reste du NMDG HEPES aCSF oxygéné pré-refroidi du bécher de 250 millilitres et placez la pierre à bulles dans le réservoir pendant la durée du tranchage, pour assurer une oxygénation adéquate.

Ensuite, ajustez le micromètre pour commencer à faire avancer l’échantillon de cerveau incrusté d’agarose. Démarrez le slicer et ajustez empiriquement la vitesse d’avancement et la fréquence d’oscillation au niveau souhaité. Continuez à avancer et à trancher le tissu par incréments de 300 micromètres jusqu’à ce que la région cérébrale d’intérêt soit complètement sectionnée.

La durée totale de la procédure de tranchage doit être inférieure à 15 minutes. Pour la récupération initiale de NMDG. Une fois la procédure de sectionnement terminée, prélevez toutes les tranches à l’aide d’une pipette de pâturage en plastique coupée et transférez-les dans une chambre de récupération à 34 degrés Celsius remplie de 150 millilitres de NMDG HEPES aCSF.

Le moment de l’étape de récupération de la tranche cérébrale aiguë est très important pour pouvoir trouver un équilibre entre la préservation morphologique et la récupération fonctionnelle des propriétés électrophysiologiques de chaque neurone. Après avoir déterminé le calendrier optimal de pic de sodium, en fonction de l’âge de la souris, effectuez la procédure de pic de sodium de l’étape Y en ajoutant les volumes indiqués de solution de pic de sodium aux moments indiqués. Ajouter la solution de spizz de sodium directement dans la cheminée du bubbler de la chambre de récupération initiale pour faciliter un mélange rapide.

Le calendrier de pic de sodium qui a été fourni avec une variété de tranches d’âge différentes est un très bon point de départ. Mais il doit être optimisé et utilisé pour votre propre conception expérimentale spécifique. Ensuite, transférez toutes les tranches dans la chambre de conservation à long terme HEPES aCSF maintenue à température ambiante.

Laissez les tranches récupérer pendant une heure supplémentaire dans la chambre de rétention HEPES avant les expériences d’enregistrement par pince de patch. On voit ci-dessous les images représentatives de la CID IR acquises à partir de diverses régions du cerveau et des coupes aiguës d’une souris âgée de trois mois pour l’évaluation de la préservation morphologique des neurones. Les résultats présentés ici proviennent de l’utilisation de la méthode de coupe de protection de contrôle NMDG sans étape de récupération de protection.

Attendu que ces résultats proviennent de la méthode de récupération protectrice NMDG optimisée. Dans l’ensemble, une amélioration de la préservation neuronale est observée avec la méthode de récupération protectrice NMDG optimisée. La méthode de récupération protectrice NMDG optimisée avec une procédure de pic de sodium progressif a été comparée à la méthode originale de récupération protectrice NMDG.

Le temps moyen de formation du joint GigaOhm et d’enregistrement du patch clamp a été considérablement et significativement réduit lorsque la procédure de pic de sodium progressif a été appliquée en même temps que l’étape de récupération protectrice NMDG. L’amélioration de la préservation des neurones obtenue avec cette méthode de tranche de cerveau facilite des applications expérimentales difficiles, y compris, mais sans s’y limiter, l’électrophysiologie à pince de patch multi-électrodes pour sonder la connectivité synaptique locale. Comme démontré ici, en utilisant des tranches de cerveau néocorticales humaines ex vevo adultes dérivées de la neurochirurgie.

En regardant cette vidéo, les scientifiques devraient avoir une bonne compréhension de la mise en œuvre de notre méthode de récupération protectrice NMDG optimisée, y compris la nouvelle procédure de pic de sodium que nous avons décrite, pour préparer des tranches de cerveau qui conviennent aux enregistrements de patch clamp. Ainsi, après avoir maîtrisé ce protocole, il devrait être possible de terminer la procédure de tranche de cerveau en moins d’une heure chaque jour. Et devrait produire des tranches de cerveau reproductibles de haute qualité et fonctionnera pour des animaux de pratiquement tous âges.

Ainsi, cette procédure, cette méthode peut aider à préparer des coupes de cerveau qui conviennent pour répondre à des questions sur le fonctionnement du cerveau à l’aide de techniques telles que l’électrophysiologie, l’imagerie optique en direct et l’optogénétique, les tests de trafic de récepteurs et d’autres types de tests fonctionnels pour explorer la fonction des types de cellules cérébrales. Cette technique est donc également utile car elle aidera les chercheurs à être en mesure de sonder fonctionnellement différentes régions du cerveau, y compris des régions du cerveau qui ne se prêtent pas traditionnellement à l’enregistrement par patch clamp à partir d’animaux adultes dans des tranches de cerveau.