Name: Préparation de tranches de cerveau aiguë en utilisant un optimisé N-méthyl-D-glucamine méthode de recouvrement protecteur (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-02-26T12:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 53 s
Description: Apprenez la préparation de tranches cérébrales aiguës avec la méthode de récupération protectrice NMDG optimisée. Cette technique améliore la préservation neuronale pour l'électrophysiologie patch clamp chez diverses espèces et âges.

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Ce travail a été financé par l’Institut Allen pour la Science du cerveau. Les auteurs tiennent à remercier les fondateurs de Allen Institute, Paul G. Allen et Jody Allen, pour leur vision, encouragement et soutien. Nous remercions également le personnel de soutien technique de Allen Institute pour l’exécution de génotypage, élevage et soins aux animaux.

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Na + Spike pinçage Seal Gigaohm Formation et Patch Clamp, enregistrant des succès La version initiale de la méthode de recouvrement protecteur de NMDG a été spécialement conçue pour les animaux adultes et vieillissement2,5. Certains utilisateurs précoces ont également cherché à appliquer cette méthodologie à cerveau animal juvénile tranchage (c.-à-d., souris < 30 jours). Toutefois, il a été noté que contrairement à l’exceptionnelle confirmée visuellement neuronale préservation avec la méthode de recouvrement protecteur NMDG dans cette tranche d’âge, les gigaohm joint la formation peut se caler fréquemment, menant à échec patch clamp de tentatives d’enregistrement. Une hypothèse est que les cations NMDG sont plus facilement pris au piège dans des tranches de cerveau pour mineurs par rapport à des tranches de cerveau adulte et peuvent gêner la formation de joint ; Cependant, gigaohm joints peuvent se former facilement tandis que les tranches de cerveau juvénile sont entièrement submergés NMDG aCSF (données non présentées), indiquant ainsi que NMDG FSCA en soi pas entrave la formation joint gigaohm.
La transition rapide de la solution de Na+ de faible à élevé à la fin de l’étape de récupération de tranches de cerveau initial provoque des dommages aux membranes neuronales et perturbe le processus de formation du sceau. C’est intuitif, étant donné que la transition de faible à élevé Na+, température froide-au-chaud et une élévation dramatique du Ca2 + Mg2 + ratio collectivement entraîner une réapparition massive de l’activité synaptique spontanée. Cette phase de détente inhibiteur dans le cerveau de tranchage de procédure est susceptible de mettre en miroir la lésion de reperfusion après un accident ischémique. Ainsi, afin d’atténuer les dommages membrane neuronale dans la phase de relèvement initial qu'une progressive Na+ spike procédure a été intégrée dans lequel l’élévation de la concentration de Na+ dans la chambre d’incubation NMDG recouvrement protecteur est lentement et de façon reproductible élevées avec un timing précis. Comme dans la procédure de recouvrement protecteur original, la dissociation temporelle des Na+ élévation de température et Ca2 +/Mg2 + ratio élévation est bénéfique. En outre, la procédure de spike Na+ mène à petites augmentations graduelles des concentrations extracellulaires de Na+ sur les premiers points dans le temps et les fortes augmentations vers les points de temps fin, offrant ainsi le tissu cérébral, mais un occasion de mieux s’adapter à l’élévation du niveau des Na+ . Cette procédure est qu'une alternative à exchange solution progressive contrôlé par une pompe à perfusion ou la gravité des lignes de goutte à goutte qui conduisent à l’augmentation constante des niveaux de Na+ et nécessitent une attention pour les apports et les retraits pour éviter tout débordement de la chambre de la tranche. Notamment, dans ce Na+ procédure PIC l’osmolarité de la solution dans la chambre de tranche augmente progressivement sur une période de plusieurs minutes avant que les tranches sont retournés à la solution dont l’osmolalité est normale, mais cela n’affecte pas négativement la santé tranche ou enregistrement de patch clamp de la réussite. Une solution de découpe haute osmolalité a déjà été utilisée pour les préparations de tranches mésencéphale afin de mieux préserver les neurones de dopamine pour patch clamp enregistrements57,58, démontrant ainsi que ce temporaire hyperosmolalité peut être salutaire dans certains contextes.
En mettant en place une procédure optimisée combinant la méthode de recouvrement protecteur NMDG et progressive Na+ épi-en étape l’utilité de cette méthode de tranche de cerveau a été étendu pour couvrir les jeunes à travers des âges animaux adultes matures. Ce protocole mis à jour est maintenant adapté pour un large éventail d’animaux âgés en utilisant une seule formulation de FSCA NMDG optimale et une procédure. Si nécessaire, la procédure de spike Na+ peut être appliquée avec un retard progressivement plus longue et/ou plus lente évolution temporelle afin d’améliorer la viabilité des tranches de cerveau d’animaux plus âgés, et nous avons fourni un guide de base de recommandée spike-en annexes selon à animal âge (voir tableau 2). Alors que nous avons fourni un cadre de base pour un large éventail d’applications, des étapes avancées supplémentaires peuvent être explorées pour renforcer encore la viabilité et la longévité des tranches de cerveau d’animaux adultes et vieillissement. Par exemple, les stratégies de restauration de glutathion sont particulièrement efficaces à cet égard et peuvent être implémentées comme décrit ailleurs2,6.
Améliorant le débit pour contester les expériences L’analyse de la connectivité synaptique par enregistrement de patch clamp est une application exigeante nécessitant une excellente conservation de la structure neuronale et la fonction afin d’atteindre une haute fiabilité de succès. Comme le nombre de neurones à enregistrer simultanément augmente linéairement, le niveau de difficulté technique Monte supra-linéairement. Il existe de nombreux modes de défaillance, et une des causes plus fréquentes d’échecs est l’incapacité à joints adéquats gigaohm forme sur une ou plusieurs des cellules ciblées. Cela peut ralentir considérablement des progrès, en particulier lorsque trois ou plusieurs neurones doivent être enregistrés simultanément. Joint de gigaohm conformément à la conclusion de plus rapide temps de formation avec la méthode de recouvrement protecteur NMDG optimisée, il y avait une nette amélioration dans le taux de réussite et le débit d’enregistrement de multiples neurones patch clamp expériences avec les deux adulte transgéniques coupes de cerveau de souris et des tranches de cerveau neurochirurgicaux humain adulte. L’amélioration de l’efficacité est presque certainement attribuable à la fois la formation de joint de gigaohm plus rapide et plus fiable et la préservation neuronale améliorée des tranches avec ce protocole. Bien que ce protocole met l’accent sur les avantages explicitement pour patch clamp de demandes d’enregistrement, des gains similaires sont prévus pour d’autres applications expérimentales difficiles où la viabilité de tranches de cerveau est primordiale.

La préparation de tranches de cerveau aiguë est un système de modèle expérimental essentiel en neurosciences. Environ la moitié d’un siècle, cette plateforme a permis à dynamiques études fonctionnelles du cerveau vivant dans une grande variété d’espèces animales et des régions anatomiques cérébrales. Que l’application soit biochimie, imagerie fonctionnelle, morphologie ou l’électrophysiologie, c’est de la plus haute importance pour assurer l’intégrité optimale et la viabilité des tissus en tranches. C’est pour cette raison que la préparation de tranches de cerveau de rongeurs juvéniles résilience (c.-à-d., plus jeune que postnatal 30 jours chez les souris) a été le plus préféré à ce jour. Tranches de la difficulté à obtenir suffisamment saines du cerveau de l’adulte et vieillissement des animaux s’est avéré pour être un formidable défi pour la plupart et a imposé des restrictions sévères pour l’étude de l’architecture fonctionnelle du cerveau mature. C’est particulièrement vrai pour les patch clamp d’enregistrement, une technique qui requiert l’excellente conservation morphologique et fonctionnelle et est indispensable pour caractériser les propriétés détaillées d’intrinsèques et synaptiques des neurones individuels identifiés. Pour les dernières décennies, la grande majorité des électrophysiologistes de patch clamp se sont appuyés sur une méthode de « protection coupe » préparation des tranches de cerveau sain de juvéniles et dans une moindre mesure avec saccharose substitués en position basse Na+ aCSF1 dans quelle mesure, les jeunes animaux adultes. Cette méthode repose sur la prémisse que les influx de Na+ passive et entrée ultérieure de l’eau et cellule gonflement pendant l’étape de coupe tranche est l’insulte prédominante qui mène à faible taux de survie des neurones, particulièrement pour ces neurones se trouve dans le couches superficielles qui sont plus susceptibles de soutenir un traumatisme direct du mouvement de la lame. Toutefois, la méthode de protection coupe laisse encore beaucoup à désirer pour la préparation de tranches de cerveau des animaux adultes matures quelle que soit la formulation de l’aCSF particulier mis en place.
Une solution simple mais efficace à ce problème a été décrit2,3,4,5,6 et appelle la méthode de tranche de cerveau « valorisation protectrice ». La version originale de cette méthode utilise un FSCA NMDG substituées, comme NMDG a été identifié comme le plus polyvalent et le plus efficace parmi divers autres candidats sodium ion substituts (y compris le saccharose, glycérol, choline et Tris). La formulation de médias a été renforcée par l’ajout de HEPES à résister à l’oedème du cerveau tranche et fournir plus fort pH tampon7, ainsi que l’ajout de suppléments pour contrecarrer les effets néfastes du stress oxydatif (tableau 1). Il a été déterminé empiriquement qu’une incubation de recouvrement initial dans le bas Na+, faible Ca2 +, et haute Mg2 + NMDG FSCA immédiatement après que découpage de tissu de cerveau adulte était nécessaire et suffisante pour amélioré neuronale conservation sur un large éventail de régions du cerveau, types cellulaires et animaux âgés3,5,6.
Notamment, des incarnations antérieures de ce qui est maintenant surnommé la méthode de recouvrement protecteur se trouve dans la littérature1,8,9,10,11,12, 13, bien que le plein potentiel de maturité adulte et vieillissement cerveau animal tranche et patch clamp enregistrement n’était pas reconnu ou démontrée dans ces premiers travaux. En outre, nuancée de variations procédurales continuent d’émerger à l’appui des applications expérimentales spécifiques4,14,15,16. Le corps collectif de travail de ces nombreux groupes de recherche transmet le degré élevé de confiance dans la robustesse de la méthode de recouvrement protecteur pour la préservation des tissus améliorée. La méthode de recouvrement protecteur NMDG a maintenant largement adoptée et mis en œuvre dans de nombreuses études de recherche publiés utilisant des préparations de tranches de cerveau animal adulte. Ces études tranche aiguë span néocorticales3,17,18, hippocampe15,19,20,21, striatum22 , 23 , 24, mésencéphale25,26,27,28,29et rhombencéphale30,31,32, 33 , 34 régions et une variété de types de neurotransmetteurs et neuromodulateur dont glutamatergique4,30, GABAergiques18,20,31,35 ,36, dopaminergiques24,29,37,38, cholinergiques14,37,38, 39, noradrénergique40et sérotoninergiques27,28 neurotransmission. La méthode consiste aussi bien aux optogenetic contrôle de l’activité neuronale en tranches dérivés d’animaux transgéniques3,39 ou suite in vivo des injections virales17,27, 28,40,41,42,43, comme bien comme Ca2 + imagerie fonctionnelle de l’activité neuronale2,44 ,45,46. Analyses de court terme plasticité4,47,48 et diverses formes de longue durée plasticité16,35,48 ont été a rapporté. Une récente étude a appliqué la méthode de recouvrement protecteur NMDG pour faciliter la complète et structurée de palpage de connectivité synaptique dans le cortex visuel dans des coupes de cerveau de souris adultes matures à l’aide de l’octopatch d’enregistrement de configuration49 — un puissant démonstration de l’utilité et la robustesse de cette méthode. La méthode de recouvrement protecteur a même été appliquée avec succès dans des contextes expérimentaux précédemment imprévues, telles que, meilleure préservation du système vasculaire et péricytes dans cerveau cortical adulte tranches50, patch clamp d’enregistrement de transplanté les populations interneurone 1 – 1,5 ans la maladie d’Alzheimer souris modèles20et un cerveau adulte tranche récepteur trafic dosage51.
Le protocole suivant décrit les procédures pas à pas pour implémenter une méthode de recouvrement protecteur NMDG optimisée de préparation de tranches de cerveau afin d’améliorer la viabilité des tranches de cerveau aiguë. Les principes de conservation neuronale améliorée sont discutés, ainsi que de la démonstration des avantages clairs de cette méthodologie pour complexe multi-neurone patch clamp d’enregistrement des expériences dans les coupes de cerveau de souris transgéniques adulte jeune et adulte tranches de cerveau humain de neurochirurgie. Le protocole suivant a été validé chez la souris de l’âge de 21 jours à plus d’un ans, aussi bien en ce qui concerne les prélèvements humains neurochirurgicaux provenant de patients adultes.

<table><tbody><tr><td>Compresstome VF-200</td><td>Precisionary Instruments</td><td>VF-200</td><td>Trancheuse de tissus vibrante (recommandée)</td></tr><tr><td>N-méthyl-D-glucamine</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M2004</td><td>Constituant aCSF</td></tr><tr><td>Chlorure de sodium</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S3014</td><td>Constituant aCSF</td></tr><tr><td>Chlorure de potassium</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P5405</td><td>Constituant aCSF</td></tr><tr><td>Phosphate de sodium monobasique dihydraté</td><td>Sigma Aldrich</td><td>71505</td><td>Constituant aCSF</td></tr><tr><td>Bicarbonate de sodium</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S5761</td><td>Constituant aCSF</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H4034</td><td>Constituant aCSF</td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G7021</td><td>Constituant aCSF</td></tr><tr><td>Ascorbate de sodium</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A4034</td><td>Constituant</td></tr> <tr><td>aCSFThiourée</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T8656</td><td>Constituant aCSF</td></tr><tr><td>Pyruvate de sodium</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P5280</td><td>Constituant aCSF</td></tr><tr><td>Chlorure de calcium dihydraté</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C7902</td><td>Constituant aCSF</td></tr><tr><td>Sulfate de magnésium heptahydraté</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M1880</td><td>Constituant aCSF</td></tr><tr><td>2,2,2-Tribromoéthanol&nbsp ;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T48402</td><td>Composant anesthésique 1</td></tr><tr><td>2-méthyl-2-butanol&nbsp ;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>240486</td><td>Composant anesthésique 2</td></tr><tr><td>Pince émoussée incurvée</td><td>Outils de science fine</td><td>11065-07</td><td>Outils</td></tr><tr><td>de dissection cérébrale Ciseaux de dissection fine (supercut)</td><td>Outils de science fine</td><td>14058-09</td><td>Outils de dissection</td></tr><tr><td>cérébrale Grands ciseaux robustes 7''</td> <td>Outils de science fine</td><td>14000-18</td><td>Outils de dissection de cerveau</td></tr><tr><td>Spatule en métal</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Z511455-1PAK</td><td>Outils de dissection cérébrale</td></tr><tr><td>Lames de rasoir</td><td>VWR</td><td>89031-954</td><td>Outils de dissection cérébrale</td></tr><tr><td>Brain Slice Keeper-4</td><td>Automate Scientific</td><td>S-BSK4</td><td>chambre de maintien</td></tr> en <tr><td>nylon de tranche de cerveau&nbsp ;</td><td>Warner Instruments</td><td>64-0198</td><td>Pour la construction de chambres de récupération de petites tranches Béchers</td></tr> en <tr><td>verre Pyrex (250 mL)</td><td>VWR</td><td>89090-434</td><td>Pour la construction de chambres de récupération de petites tranches</td></tr><tr><td>Plat en plastique de 35 mm, rond</td><td>VWR</td><td>100488-376</td><td>Pour la construction de chambres de récupération de petites tranches</td></tr><tr><td>Pierres diffusrices de gaz (10 & micro ; m)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>59277</td><td>Pour la carbogénation constante (bulles fines)</td></tr><tr><td>Agarose Type I-B</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A0576</td><td>Pour l’enrobage d’échantillons de cerveau</td></tr><tr><td>Embouts de micro-chargeur</td><td>Eppendorf</td><td>22491229</td><td>Pour le remplissage d’électrodes de patch clamp</td></tr><tr><td>Sylgard</td><td>VWR</td><td>102092-312</td><td>Pour la fabrication d’une plate-forme de dissection sur mesure</td></tr><tr><td>Acide chlorhydrique&nbsp ;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H1758-100ML</td><td>Pour l’ajustement du pH des fluides</td></tr><tr><td>Hydroxyde de sodium&nbsp ;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>221465-25G</td><td>Pour l’ajustement du pH des supports</td></tr><tr><td>Hydroxyde de potassium</td><td>Sigma Aldrich</td><td>221473</td><td>Pour l’ajustement du pH des supports</td></tr><tr><td>Pipettes de transfert en plastique 3 mL graduées</td><td>VWR</td><td>89497-676</td><td>Pour le transfert de tranches</td></tr><tr><td>Lames d’injecteur en céramique de zirconium</td><td>Cadence Specialty</td><td>Blades EF-INZ10</td><td>http://cadenceinc.com/</td></tr> <tr><td>KG-33 verre borosilicaté capillaire avec filament</td><td>King Glass Company</td><td>devis personnalisé</td><td>ID : 0,87 mm, OD 1,50 mm</td></tr><tr><td>Biocytine</td><td>Sigma Aldrich</td><td>B4261</td><td>Solution de pipette interne</td></tr><tr><td>Phosphocréatine disodique</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P7936</td><td>Solution de pipette interne</td></tr><tr><td>Gluconate de potassium</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G4500-100G</td><td>Solution de pipette interne</td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E3889</td><td>Solution de pipette interne</td></tr><tr><td>Mg-ATP</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A9187</td><td>Solution de pipette interne</td></tr><tr><td>Na2-GTP</td><td>Sigma Aldrich</td><td>51120</td><td>Solution de pipette interne</td></tr><tr><td>saccharose</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S0389</td><td>Solution de pipette interne</td></tr><tr><td>Bain-marie chauffé (2.5L)</td><td>VWR</td><td>13491-060</td><td></td></tr><tr><td>Divers Papier filtre ronds</td><td>VWR</td><td>28456-022</td><td>Divers</td></tr><tr><td>Colle cyanoacrylate</td><td>Amazon</td><td>B000BQRBO6</td><td>Divers</td></tr><tr><td>Boîte de Pétri en verre</td><td>VWR</td><td>89000-326</td><td>Divers</td></tr><tr><td>10X Saline tamponnée au phosphate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P5493</td><td>Divers</td></tr><tr><td>seringues de 30 mL</td><td>VWR</td><td>BD302832</td><td>Divers</td></tr><tr><td>seringues de 1 mL</td><td>VWR</td><td>BD-309628</td><td>Aiguilles diverses</td></tr><tr><td>de calibre 25 5/8</td><td>VWR</td><td>89219-292</td><td>Thermomélangeur divers</td></tr><tr><td>(avec bloc de tubes de 1,5 ml)</td><td>VWR</td><td>89232-908</td><td>Pour maintenir l’agarose fondue&nbsp ;</td></tr></tbody></table>

préparation de tranches de cerveau aiguë en utilisant un optimisé n-méthyl-d-glucamine méthode de recouvrement protecteur

Preparation of Acute Brain Slices Using an Optimized N-Methyl-D-glucamine Protective Recovery Method

Ce protocole est un guide pratique pour la N-méthyl-D-glucamine (NMDG) méthode de recouvrement protecteur de préparation de tranches de cerveau. De nombreuses études récentes ont clairement démontré l’utilité de cette méthode pour améliorer la préservation neuronale et viabilité de tranches de cerveau ensemble. La mise en œuvre de cette technique par les adopteurs précoces a facilité des enquêtes détaillées sur le fonctionnement du cerveau à l’aide de diverses applications expérimentales et couvrant un large éventail d’animaux âges, régions cérébrales et types de cellules. Étapes sont décrites pour mener à bien la technique de tranche de cerveau de recouvrement protecteur utilisant un optimisé NMDG artificiel liquide céphalo-rachidien (FSCA) médias formulation et procédure renforcée pour sûrement obtenir des tranches de cerveau sain pour l’électrophysiologie de patch clamp. Avec cette nouvelle approche, on observe une amélioration substantielle dans la vitesse et fiabilité de gigaohm joint la formation durant ciblée patch clamp d’enregistrement des expériences tout en conservant l’excellente conservation neuronale, facilitant ainsi la difficile applications expérimentales. Résultats représentatifs sont pourvu de multiples neurones patch clamp d’enregistrement des expériences pour doser la connectivité synaptique dans des tranches de cerveau néocorticales préparés à partir de souris transgéniques adultes jeunes et matures spécimens adultes de neurochirurgie humaines. En outre, la méthode de recouvrement protecteur NMDG optimisée de tranchage de cerveau est compatible avec les animaux juvéniles et adultes, ainsi résoudre une limitation de la méthodologie originale. En résumé, une formulation unique média et le cerveau tranchage de procédure peuvent être implémentées à travers les différentes espèces et les âges pour atteindre l’excellente conservation de tissus et de viabilité.

Ce protocole illustre l’implémentation d’un optimisé N-méthyl-D-glucamine (NMDG) méthode de recouvrement protecteur de préparation de tranches de cerveau. Une formulation unique de médias est utilisée pour obtenir fiable des tranches de cerveau sain provenant d’animaux de tout âge et pour diverses applications expérimentales.

Préparation de tranches de cerveau aiguë en utilisant un optimisé N-méthyl-D-glucamine méthode de recouvrement protecteur

This protocol is a practical guide to the N-methyl-D-glucamine (NMDG) protective recovery method of brain slice preparation. Numerous recent studies have ...

L’objectif global de cette procédure est de préparer des tranches de cerveau saines provenant d’animaux adultes matures qui conviennent aux expériences d’électrophysiologie par patch clamp. Ainsi, cette méthode de récupération protectrice NMDG optimisée pour la préparation de coupes de cerveau permet aux chercheurs d’explorer les propriétés intrinsèques et synaptiques des types de cellules cérébrales dans de nombreuses régions cérébrales différentes et pour des animaux de pratiquement tous âges. Le principal avantage de cette technique particulière est qu’elle permet de préparer des coupes de cerveau qui ont un degré de préservation neuronale plus élevé par rapport aux méthodologies précédentes.Et aussi que ces tranches de cerveau sont plus adaptées à l’enregistrement par patch clamp. Cette méthode a été optimisée pour le tissu cérébral de souris adulte. Il peut être utilisé pour une variété d’autres espèces, y compris le tissu cérébral humain réséqué neurochirurgicalement.Pour commencer cette procédure, configurez la station de tranchage avec la trancheuse de tissus et les instruments chirurgicaux. Fixez une pale d’injecteur en céramique de zirconium au bras de la lame à l’aide d’une colle adhésive rapide. Insérez ensuite le porte-échantillon et alignez le bord d’attaque de la lame sur le bord du porte-échantillon.Laisser un petit espace pour s’assurer que la lame ne gratte pas le métal. Remplissez un bécher de 250 millilitres avec 200 millilitres de NMDG HEPES aCSF. Et pré-refroidissez-le sur de la glace avec une carbogénation constante pendant plus de 10 minutes.Ensuite, installez la chambre de récupération initiale de la tranche de cerveau en la remplissant de 150 millilitres de NMDG HEPES aCSF. Et placez la chambre dans un bain-marie à 32 à 34 degrés Celsius. Pour installer une chambre de rétention de tranches de cerveau, remplissez le réservoir avec 450 millilitres de HEPES aCSF et laissez-le chauffer à température ambiante sous carbogénation constante jusqu’à l’utilisation.Ensuite, préparez de l’agarose fondue pour l’enrobage tissulaire en découpant un bloc d’agarose à 2 % dans un plat préalablement préparé à l’aide de l’extrémité ouverte d’un flacon conique de 50 millilitres. Fermez sans serrer le flacon conique, puis passez-le au micro-ondes pendant 10 à 30 secondes jusqu’à ce que l’agarose commence à fondre. Ne pas surchauffer.Versez l’agarose fondu dans des tubes de 1,5 millilitre. Maintenez l’agarose à l’état fondu à l’aide d’un thermomélangeur réglé à 42 degrés Celsius avec une agitation vigoureuse. Et assurez-vous soigneusement que l’agarose fondue ne se solidifie pas prématurément.Pré-refroidissez le bloc de refroidissement accessoire pour la trancheuse sur de la glace à ce moment-là. Dans cette procédure, faites une incision sur la peau de la tête pour exposer la calotte. Ensuite, utilisez des ciseaux fins super coupés pour couper la peau de la calotte.Et faites de petites incisions latéralement des deux côtés de la base ventrale caudale du crâne. Faites des coupes peu profondes supplémentaires en commençant par la face dorsale caudale du crâne, en se déplaçant dans la direction rostrale vers le haut de la ligne médiane dorsale. En prenant soin de ne pas endommager le cerveau sous-jacent.Après cela, faites une coupe finale en T perpendiculaire à la ligne médiane au niveau des bulbes olfactifs. Ensuite, à l’aide de la pince à bout rond, saisissez le crâne en commençant par la face médiale rostrale et décollez vers la direction latérale caudale d’un côté. Répétez cette procédure pour que l’autre côté s’ouvre.Et retirez les moitiés dorsales de la calotte crânienne pour exposer le cerveau. Prélevez doucement le cerveau intact dans le bécher de NMDG HEPES aCSF pré-réfrigéré. Et laissez le cerveau refroidir uniformément pendant environ une minute.Maintenant, utilisez une grande spatule pour transférer le cerveau du bécher sur la boîte de Pétri recouverte de papier filtre. Coupez et montez le cerveau en fonction de l’angle de tranchage préféré et de la région cérébrale d’intérêt souhaitée. Travaillez rapidement pour éviter une privation prolongée d’oxygène pendant la manipulation.Ensuite, fixez le bloc cérébral sur le porte-échantillon à l’aide de colle adhésive. Rétractez la pièce intérieure du porte-échantillon pour retirer complètement le bloc cérébral à l’intérieur. Versez ensuite l’agarose fondue directement dans le support jusqu’à ce que le bloc cérébral soit entièrement recouvert d’agarose.Ensuite, fixez le bloc de refroidissement de l’accessoire prérefroidi autour du porte-échantillon pendant dix secondes jusqu’à ce que l’agarose se solidifie. Insérez le porte-échantillon dans le réceptacle de la trancheuse et vérifiez le bon alignement. Ensuite, remplissez le réservoir avec le reste du NMDG HEPES aCSF oxygéné pré-refroidi du bécher de 250 millilitres et placez la pierre à bulles dans le réservoir pendant la durée du tranchage, pour assurer une oxygénation adéquate.Ensuite, ajustez le micromètre pour commencer à faire avancer l’échantillon de cerveau incrusté d’agarose. Démarrez le slicer et ajustez empiriquement la vitesse d’avancement et la fréquence d’oscillation au niveau souhaité. Continuez à avancer et à trancher le tissu par incréments de 300 micromètres jusqu’à ce que la région cérébrale d’intérêt soit complètement sectionnée.La durée totale de la procédure de tranchage doit être inférieure à 15 minutes. Pour la récupération initiale de NMDG. Une fois la procédure de sectionnement terminée, prélevez toutes les tranches à l’aide d’une pipette de pâturage en plastique coupée et transférez-les dans une chambre de récupération à 34 degrés Celsius remplie de 150 millilitres de NMDG HEPES aCSF.Le moment de l’étape de récupération de la tranche cérébrale aiguë est très important pour pouvoir trouver un équilibre entre la préservation morphologique et la récupération fonctionnelle des propriétés électrophysiologiques de chaque neurone. Après avoir déterminé le calendrier optimal de pic de sodium, en fonction de l’âge de la souris, effectuez la procédure de pic de sodium de l’étape Y en ajoutant les volumes indiqués de solution de pic de sodium aux moments indiqués. Ajouter la solution de spizz de sodium directement dans la cheminée du bubbler de la chambre de récupération initiale pour faciliter un mélange rapide.Le calendrier de pic de sodium qui a été fourni avec une variété de tranches d’âge différentes est un très bon point de départ. Mais il doit être optimisé et utilisé pour votre propre conception expérimentale spécifique. Ensuite, transférez toutes les tranches dans la chambre de conservation à long terme HEPES aCSF maintenue à température ambiante.Laissez les tranches récupérer pendant une heure supplémentaire dans la chambre de rétention HEPES avant les expériences d’enregistrement par pince de patch. On voit ci-dessous les images représentatives de la CID IR acquises à partir de diverses régions du cerveau et des coupes aiguës d’une souris âgée de trois mois pour l’évaluation de la préservation morphologique des neurones. Les résultats présentés ici proviennent de l’utilisation de la méthode de coupe de protection de contrôle NMDG sans étape de récupération de protection.Attendu que ces résultats proviennent de la méthode de récupération protectrice NMDG optimisée. Dans l’ensemble, une amélioration de la préservation neuronale est observée avec la méthode de récupération protectrice NMDG optimisée. La méthode de récupération protectrice NMDG optimisée avec une procédure de pic de sodium progressif a été comparée à la méthode originale de récupération protectrice NMDG.Le temps moyen de formation du joint GigaOhm et d’enregistrement du patch clamp a été considérablement et significativement réduit lorsque la procédure de pic de sodium progressif a été appliquée en même temps que l’étape de récupération protectrice NMDG. L’amélioration de la préservation des neurones obtenue avec cette méthode de tranche de cerveau facilite des applications expérimentales difficiles, y compris, mais sans s’y limiter, l’électrophysiologie à pince de patch multi-électrodes pour sonder la connectivité synaptique locale. Comme démontré ici, en utilisant des tranches de cerveau néocorticales humaines ex vevo adultes dérivées de la neurochirurgie.En regardant cette vidéo, les scientifiques devraient avoir une bonne compréhension de la mise en œuvre de notre méthode de récupération protectrice NMDG optimisée, y compris la nouvelle procédure de pic de sodium que nous avons décrite, pour préparer des tranches de cerveau qui conviennent aux enregistrements de patch clamp. Ainsi, après avoir maîtrisé ce protocole, il devrait être possible de terminer la procédure de tranche de cerveau en moins d’une heure chaque jour. Et devrait produire des tranches de cerveau reproductibles de haute qualité et fonctionnera pour des animaux de pratiquement tous âges.Ainsi, cette procédure, cette méthode peut aider à préparer des coupes de cerveau qui conviennent pour répondre à des questions sur le fonctionnement du cerveau à l’aide de techniques telles que l’électrophysiologie, l’imagerie optique en direct et l’optogénétique, les tests de trafic de récepteurs et d’autres types de tests fonctionnels pour explorer la fonction des types de cellules cérébrales. Cette technique est donc également utile car elle aidera les chercheurs à être en mesure de sonder fonctionnellement différentes régions du cerveau, y compris des régions du cerveau qui ne se prêtent pas traditionnellement à l’enregistrement par patch clamp à partir d’animaux adultes dans des tranches de cerveau.

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Cette vidéo décrit un protocole permettant d’obtenir des tranches de cerveau à l’aide d’une méthode de récupération protectrice basée sur la N-méthyl-D-glucamine (NMDG). Un cerveau disséqué est incubé dans un aCSF avec NMDG et HEPES pour minimiser la mort et les dommages aux cellules neuronales pendant la section. La section est autorisée à récupérer dans l’aCSF pour restaurer les activités...

Préparation de coupes cérébrales à l’aide d’une méthode de récupération protectrice basée sur le NMDG

Nous décrivons deux méthodes de visualisation et de quantification de l’arborisation dendritique dans l’hippocampe de modèles murins : l’imagerie en temps réel et l’imagerie en profondeur de champ étendue. Alors que la première méthode permet un traçage topographique sophistiqué et une quantification de l’étendue de la ramification, la seconde permet une visualisation rapide de l’arbre dendritique.

Évaluation de l&#39;arborisation dendritique dans le gyrus denté de la région de l&#39;hippocampe chez la souris

Ce protocole décrit la stabilisation du niveau d’oxygène dans un petit volume de tampon recyclé et aspects méthodologiques de la plasticité synaptique activité dépendante d’enregistrement dans des tranches d’hippocampe aiguës immergés.

Enregistrement de la plasticité synaptique dans des tranches d’hippocampe aiguës maintenues dans un petit volume recyclage - Perfusion- et système de chambre de Submersion-type

La microglie, les résidents cellules immunitaires du cerveau, répondre rapidement avec des changements morphologiques aux modifications de leur environnement. Ce protocole décrit comment utiliser la microscopie biphotonique à étudier l’attraction des microglies processus vers la sérotonine ou l’ATP en tranches cérébrale aiguë des souris.

Two-photon Imaging d’Attraction des microglies processus vers l’ATP ou la sérotonine cérébrale aiguë tranches

Il s’agit d’un protocole pour la préparation des tranches aiguës de l’adulte et le vieillissement hippocampi souris qui tire parti de la perfusion transcardique et la coupe de tranches avec la glace-froid NMDG-aCSF pour réduire les dommages hypoxiques au tissu. Les tranches qui en résultent restent en bonne santé pendant de nombreuses heures et conviennent aux corrections à long terme et aux enregistrements sur le terrain.

Minimiser l’hypoxie dans les tranches hippocampales des souris adultes et vieillissantes

Cet article vise à décrire un protocole systématique pour obtenir des tranches horizontales de cerveau hippocampal chez la souris. L’objectif de cette méthodologie est de préserver l’intégrité des voies de fibre hippocampal, telles que le chemin perforant et le tractus de fibre moussée pour évaluer les processus neurologiques liés au gyrus dentate.

Tranches hippocampiques horizontales du cerveau de souris

Nous présentons un protocole pour préparer des tranches aiguës de l’hippocampe dorsale-intermédiaire des souris. Nous comparons cette préparation transversale avec le tranchage coronal en termes de qualité des enregistrements et de préservation des caractéristiques morphologiques des neurones enregistrés.

Préparation de tranches aiguës de l’hippocampe dorsal pour l’enregistrement des cellules entières et la reconstruction neuronale dans le gyrus bosselé de souris adultes

La microscopie électronique à balayage en bloc en série (SBEM) est appliquée pour imager et analyser les épines dendritiques de l’hippocampe murin.

Microscopie électronique à balayage en bloc en série (SBEM) pour l’étude des épines dendritiques

Ici, il est démontré comment un modèle de traumatisme crânien fermé éveillé peut être utilisé pour examiner les effets des lésions cérébrales traumatiques légères répétées (r-mTBI) sur la plasticité synaptique dans l’hippocampe. Le modèle reproduit des caractéristiques importantes du r-mTBI chez les patients et est utilisé conjointement avec l’électrophysiologie in vitro .

Évaluation des changements dans la plasticité synaptique à l’aide d’un modèle éveillé de traumatisme crânien traumatique léger

Cette étude présente un protocole pour l’établissement d’un modèle animal hautement reproductible de transformation hémorragique (HT) utilisant l’occlusion/reperfusion de l’artère cérébrale moyenne (MCAO/R) chez des souris C57BL/6 atteintes d’hyperglycémie aiguë.

Un modèle murin de transformation hémorragique induite par une hyperglycémie aiguë combinée à une ischémie focale transitoire

Apprenez la préparation de tranches cérébrales aiguës avec la méthode de récupération protectrice NMDG optimisée. Cette technique améliore la préservation neuronale pour l'électrophysiologie patch clamp chez diverses espèces et âges.

Préparation de tranches de cerveau aiguë en utilisant un optimisé N-méthyl-D-glucamine méthode de recouvrement protecteur

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