LC-MS Analyse des plaquettes humaines en tant que plate-forme pour l'étude du métabolisme mitochondrial
4 avril 2016
Ici , nous montrons les plaquettes humaines isolées peuvent être utilisées comme accessibles modèle ex vivo pour étudier les adaptations métaboliques en réponse au complexe I inhibiteur de la roténone. Cette approche utilise le traçage isotopique et la quantification relative par spectrométrie de masse Chromatographie en phase liquide, et peut être appliquée à une variété de modèles d'étude.
L’objectif global de cette procédure est de déterminer comment un traitement xénobiotique ou un état pathologique modifie le métabolisme cellulaire. Cette méthode a le potentiel de révéler comment un état pathologique ou une toxine appliquée affecte le métabolisme cellulaire. Et une fois que cela est connu, notre méthode a la capacité de révéler si une sorte d’intervention peut corriger le défaut.
Le principal avantage de cette technique est qu’elle ne repose pas sur des lignées cellulaires transformées, elle est donc plus susceptible de fournir des réponses directement pertinentes pour la santé humaine. Pour commencer cette procédure, préparez une solution mère de 10 millimolaires de roténone dans du sulfoxyde de diméthyle. Effectuez une dilution en série de la solution mère de roténone de 10 millimolaires pour obtenir des solutions avec des concentrations de roténone allant d’une nanomolaire à 100 micromolaires.
Ensuite, ajoutez 50 microlitres de chaque solution mère à cinq millilitres d’une solution tampon enrichie de Tyrode préalablement préparée pour préparer des solutions avec des concentrations de roténone allant de 10 picomolaires à une micromolaire. Ajoutez 50 microlitres de DMSO à l’un des échantillons de solution tampon pour servir de contrôle du véhicule. Pour isoler les plaquettes du sang total, centrifugez des échantillons de sang total à 175 x g pendant 15 minutes sans pause.
Lorsque vous avez terminé, transférez un millilitre de la couche supérieure de plasma riche en plaquettes dans un tube de microcentrifugation de 1,5 millilitre. Lors du transfert du plasma riche en plaquettes, veillez à ne pas déranger la couche leucocytaire afin que la pastille plaquettaire ne soit pas contaminée par les lymphocytes. Centrifugez la couche de plasma riche en plaquettes à 400 x g pendant cinq minutes.
Ensuite, aspirez le surnageant. En utilisant pas moins de trois réplicats biologiques pour chaque condition, remettez en suspension la pastille de plaquettes dans un millilitre de chaque solution de roténone préalablement préparée. Ensuite, incubez les plaquettes remises en suspension dans un incubateur de dioxyde de carbone équipé d’une chemise d’eau réglée à 95 % d’humidité et à 5 % de dioxyde de carbone à 37 degrés Celsius pendant une heure.
À ce stade, granulez les plaquettes en centrifugeant les échantillons à 3000 x g pendant trois minutes. Après avoir aspiré le surnageant, ajouter l’étalon interne approprié marqué par un isotope stable. Ensuite, mettez les plaquettes en suspension dans 750 microlitres d’acide trichloracétique 10 % glacé.
Sonicate chaque échantillon 30 fois avec des impulsions de 0,5 seconde. Après la centrifugation, fixer les colonnes d’extraction en phase solide C18 sur un collecteur à vide. Conditionnez les colonnes avec un millilitre de méthanol.
Ensuite, équilibrez les colonnes avec un millilitre d’eau doublement distillée. Exécutez le surnageant dérivé de l’échantillon à travers les colonnes. Une fois terminé, lavez les colonnes avec un millilitre d’eau.
Ensuite, chargez des tubes à centrifuger en verre de 10 millilitres dans le collecteur à vide pour collecter les fractions d’élution. Éluez les colonnes avec un millilitre d’acétate d’ammonium 25 millimolaires et du méthanol. Après séchage de l’éluat sous azote gazeux, remettre en suspension les résidus séchés dans 50 microlitres d’acide 5%5-sulfosalicylique et transférer les échantillons dans des fichiers HPLC pour analyse.
Comme indiqué précédemment dans les cellules SH-SY5Y, on suppose que les changements dans les niveaux relatifs de thioesters d’acéyl CoA en réponse à la roténone résultent de l’inhibition du complexe. Plus précisément, il y a une diminution dose-dépendante de la succinylCoA avec une augmentation simultanée de la bêta-hydroxybutyryl-CoA, tandis que les niveaux d’acétylCoA sont restés inchangés. L’analyse des plaquettes humaines traitées à la roténone révèle des résultats très cohérents et fournit un ensemble unique de données expérimentales.
Il est important de noter que cette observation souligne la dépendance mitochondriale de la réponse à la roténone car les plaquettes sont dépourvues de noyaux. Après cette procédure, d’autres méthodes telles que le traçage métabolique peuvent être effectuées afin de répondre à des questions supplémentaires, telles que : Comment ce traitement ou cet état pathologique affecte-t-il l’utilisation du substrat ? Si nous identifions des changements dans les niveaux d’un métabolite, pourquoi change-t-il ?
Quelles étapes du parcours sont affectées et de quelle manière ? Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’isoler les plaquettes du sang total, d’effectuer le défi ex-vivo contrôlé et d’extraire les thioesters d’acéyle CoA pour l’analyse LCMS.
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Aperçu
Cette étude démontre l'utilisation de plaquettes humaines isolées comme modèle ex vivo pour étudier les adaptations métaboliques en réponse à l'inhibiteur de la chaîne respiratoire rotenone. La méthode utilise le traçage isotopique et la chromatographie liquide-spectrométrie de masse pour la quantification relative, ce qui la rend applicable à divers plans expérimentaux.
Composantes clés de l'étude
Domaine scientifique
- Métabolisme cellulaire
- Pharmacologie
- Pertinence pour la santé humaine
Contexte
- Comprendre comment les xénobiotiques affectent le métabolisme cellulaire est essentiel.
- Les plaquettes humaines isolées constituent un modèle pertinent par rapport aux lignées cellulaires transformées.
- Cette approche peut aider à identifier des interventions potentielles contre les défauts métaboliques.
- La roténone est utilisée comme inhibiteur du complexe I pour étudier les modifications métaboliques.
Objectif de l'étude
- Déterminer les effets du traitement par des xénobiotiques sur le métabolisme cellulaire.
- Explorer comment les états pathologiques modifient les processus métaboliques.
- Évaluer le potentiel des interventions pour corriger les défauts métaboliques.
Méthodes utilisées
- Préparation d'une solution mère de rotenone à 10 millimolaire dans le diméthylsulfoxyde.
- Dilution en série de la solution mère de rotenone pour obtenir différentes concentrations.
- Marquage isotopique pour l'analyse métabolique.
- Chromatographie liquide-spectrométrie de masse pour la quantification.
Résultats principaux
- Les plaquettes isolées modélisent efficacement les réponses métaboliques à la roténone.
- Le traçage isotopique révèle des adaptations métaboliques importantes.
- La chromatographie liquide-spectrométrie de masse assure une quantification précise.
- La méthode s'applique à divers plans expérimentaux.
Conclusions
- Les plaquettes humaines isolées constituent un modèle précieux pour l'étude du métabolisme.
- Cette approche peut permettre de mieux comprendre les mécanismes des maladies et les thérapies potentielles.
- De futures études pourront s'appuyer sur cette méthode pour explorer d'autres voies métaboliques.
Questions fréquemment posées
Pertinence professionnelle pour l'industrie
Les plaquettes humaines offrent un modèle cliniquement pertinent et non transformé pour l'étude du métabolisme mitochondrial et des effets des xénobiotiques, palliant ainsi les limites des lignées cellulaires cancéreuses en recherche métabolique. Cette plateforme permet une analyse reproductible et spécifique au donneur des altérations des voies métaboliques, soutenant la validation de cibles et la réduction des risques mécanistiques en phase précoce de découverte. La possibilité de production à grande échelle grâce à l'approvisionnement auprès de banques de sang facilite la continuité translationnelle, depuis la découverte fondamentale jusqu'aux études précliniques et cliniques.
Applications stratégiques en recherche et développement biopharmaceutique
Début de la découverte et validation de la cible
- Valeur scientifique : Permet d'interroger des hypothèses thérapeutiques en analysant les réponses mitochondriales aux inhibiteurs du complexe I comme la roténone.
- Valeur opérationnelle : Fournit un système pertinent pour l'humain qui réduit les variables de confusion dues à la reprogrammation métabolique observée dans les lignées cellulaires transformées.
- Valeur prédictive : Facilite la détection biologique des risques grâce à la mise en évidence cohérente de modifications métaboliques compensatoires, telles qu'une oxydation accrue des acides gras lors de l'inhibition de la glycolyse.
Tests et développement de dosages
- Valeur scientifique : Génère des lectures quantitatives par LC-MS des thioesters d'acyl-CoA, permettant une quantification relative et un marquage isotopique pour l'évaluation de l'activité spécifique aux voies métaboliques.
- Valeur opérationnelle : Fournit des profils de métabolites reproductibles entre réplicats biologiques, soutenant la standardisation des tests pour les campagnes de criblage de xénobiotiques.
- Extensibilité : L'isolement de plaquettes à partir de donneurs individuels ou de banques de sang permet une production échelonnée d'échantillons métaboliquement actifs pour le criblage à haut contenu.
Recherche translationnelle et préclinique
- Continuité translationnelle : Relie les réponses plaquettaires ex vivo aux adaptations métaboliques in vivo, soutenant une validation préclinique alignée sur les biomarqueurs.
- Dérisquage mécanistique : Précise si les modifications métaboliques observées dépendent des mitochondries, comme en témoignent les réponses des plaquettes anucléées.
- Avancement ajusté au risque : Permet d'évaluer l'efficacité d'une intervention pour inverser les défauts métaboliques, éclairant ainsi les décisions d'orientation en optimisation du composé candidat.
Intégration du pipeline et du flux de travail
La méthode s'inscrit dans le continuum de découverte allant de la validation de la cible à l'identification de composés précurseurs, puis à l'évaluation préclinique, en particulier pour les composés ciblant les mitochondries et les modulateurs du métabolisme.
- Biologie de la découverte : Permet de tester des hypothèses sur les effets des xénobiotiques sur le métabolisme cellulaire en isolant la réponse des plaquettes à un traitement par la roténone dépendant de la dose.
- Criblage : Permet de préparer des plaquettes prêtes à être analysées par LC-MS, produisant des résultats quantitatifs reproductibles pour le criblage de bibliothèques de composés.
- Analytique : Fournit une quantification relative des thioesters d'acétyl-CoA, de succinyl-CoA et de bêta-hydroxybutyryl-CoA, permettant la comparaison des flux métaboliques entre différentes conditions.
- Recherche translationnelle : S'inscrit dans une continuité préclinique en modélisant des adaptations métaboliques pertinentes pour les états pathologiques et les interventions thérapeutiques.
- Réutilisation en entreprise : Établit un protocole standardisé d'isolement des plaquettes et d'extraction des métabolites, applicable à plusieurs projets et domaines thérapeutiques.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Accroît la confiance prédictive dans la validation des cibles en utilisant un modèle humain physiologiquement pertinent qui évite les artefacts liés aux lignées cellulaires cancéreuses.
- Valeur opérationnelle : Garantit la reproductibilité grâce à des protocoles standardisés d'isolement des plaquettes, de stimulation ex vivo et d'extraction des métabolites.
- Valeur stratégique : Améliore l'efficacité du capital en permettant la détection précoce de défauts métaboliques, réduisant ainsi l'abandon en phase tardive dû à une toxicité mitochondriale imprévue.
- Impact sur le portefeuille : Favorise la priorisation des composés ajustée au risque en fonction de leurs effets sur les voies métaboliques fondamentales dans un système pertinent pour l'humain.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Nécessite une expertise en isolement des plaquettes, manipulation stérile des cellules et métabolomique par LC-MS/MS.
- Dépend de l'accès à du matériel de centrifugation, à des systèmes sous vide pour l'extraction en phase solide et à des systèmes HPLC-MS.
- Exige une standardisation de la préparation du plasma riche en plaquettes et de la dose de roténone entre les laboratoires et les donneurs.
- Implique des adaptations selon les différents xénobiotiques et les schémas de marquage isotopique.
- Est limité par la viabilité des plaquettes ex vivo et par la nécessité d'un traitement immédiat après l'isolement afin de préserver l'intégrité métabolique.
