Flux de travail complet pour l'analyse des histones modifications post-traductionnelles utilisant la spectrométrie de masse Bottom-up: De Histone Extraction à l'analyse des données

L’objectif général de ce protocole est de fournir une procédure simple pour évaluer l’abondance relative des modifications post-traductionnelles des histones, qui jouent des rôles essentiels dans la biologie de la chromatine, tels que la régulation de l’expression génique et la condensation des chromosomes. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la biologie de la chromatine. Par exemple, quelles modifications des histones modifient leur abondance relative lors de la stimulation ou du traitement de cellules ou de tissus donnés.

Le principal avantage de cette technique est qu’en utilisant la protéomique basée sur la spectrométrie de masse, nous pouvons quantifier simultanément la plupart des PTM connus sur des protéines connues en une seule analyse. L’analyse de la modification des histones a de nombreuses applications, notamment l’estimation des changements épigénétiques et du fonctionnement de la chromatine chez les individus ou le système modèle lors d’un traitement médicamenteux ou d’un stress. En plus de Simone, deux autres membres de mon laboratoire feront la démonstration des procédures de ce protocole.

Natarajan Bhanu, spécialiste de la recherche, et Kelly Karch, étudiante diplômée. Comme le montre ce flux de travail, il s’agit d’un protocole en 10 étapes qui comprend la purification des histones à partir de cultures cellulaires ou de tissus, la dérivation des histones, la digestion et le dessalage, ainsi que l’analyse par spectrométrie de masse à l’aide de la chromatographie liquide en nanoflux. Seules les procédures sélectionnées seront présentées dans cette vidéo.

Pour commencer la procédure d’isolement des noyaux des cellules intactes, décongelez sur de la glace les cellules qui ont été précédemment récoltées et stockées à moins 80 degrés Celsius. Et préparer le tampon d’isolement nucléaire, ou NIB, comme décrit dans le texte du protocole. Retirer un cinquième du volume de NIB et ajouter NP-40 Alternative à une concentration finale de 0,2 %. Les quatre cinquièmes restants seront utilisés pour les lavages.

Lavez la pastille cellulaire avec NIB sans alternative NP-40, en utilisant un rapport de 1:10 entre le volume de la pastille cellulaire et le volume tampon. Centrifugez à 700 RCF pendant cinq minutes et retirez le surnageant. Lyser la pastille cellulaire en la plaçant sur de la glace et en ajoutant de la NIB avec 0,2 % de NP-40 Alternative à un rapport de 1:10 entre le volume de la pastille cellulaire et le volume tampon

Homogénéiser les cellules par pipetage doux. Incuber les cellules homogénéisées sur de la glace pendant cinq à 10 minutes pour que les cellules se lysent et libèrent les noyaux. Centrifugeuse à 1000 RCF pendant cinq à 10 minutes à quatre degrés Celsius.

La pastille contiendra principalement des noyaux cellulaires, tandis que le surnageant contiendra principalement des composants cytoplasmiques. Conservez la fraction cytoplasmique si vous le souhaitez. Lavez la pastille de noyaux en la remettant doucement en suspension sans NP-40 Alternative, en utilisant un rapport de 1:10 entre le volume de la pastille et le volume tampon

Centrifugez à 1000 RCF pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius et retirez le surnageant. Une fois que NP-40 Alternative a été complètement retiré de la pastille de noyaux, ajoutez de l’acide sulfurique 0,2 molaire glacé à un rapport de 1:5 entre le volume des noyaux et le volume d’acide sulfurique. Remettre les noyaux en suspension dans l’acide sulfurique par pipetage doux.

Incuber l’échantillon en rotation constante ou en secouant doucement pendant deux à quatre heures à quatre degrés Celsius. Ensuite, centrifugez l’échantillon à 3400 RCF à quatre degrés Celsius pendant cinq minutes et transférez le surnageant dans un nouveau tube. Centrifugez à nouveau et transférez le surnageant dans un nouveau tube pour éliminer tout matériau insoluble.

Pour précipiter les histones, ajoutez de l’acide trichloracétique (TCA) 100 % réfrigéré au surnageant recueilli dans un rapport de volume de 1:3. La présence d’histones est indiquée par le fait que l’échantillon devient trouble. Mélangez en inversant le tube plusieurs fois.

Incuber le mélange sur de la glace pendant au moins une heure. Centrifugeuse à 3400 RCF pendant cinq minutes. Après centrifugation, les histones vont recouvrir les côtés du tube et se déposer également au fond.

Une pastille blanche et insoluble se formera également tout au fond du tube, qui contient principalement des protéines non histones et d’autres biomolécules. Retirez soigneusement le surnageant par aspiration, sans gratter les côtés du tube, ni la pastille au fond du tube. À l’aide d’une pipette Pasteur en verre, rincez le tube avec de l’acétone 100 % glacée et 0,1 % d’acide chlorhydrique, de manière à couvrir les protéines précipitées qui recouvrent les côtés et le fond.

Centrifuger à 3400 RCF pendant deux minutes. Aspirez le surnageant avec précaution, sans racler les parois ni la pastille. Rincez le tube avec de l’acétone glacée à 100 %, centrifugez-le à nouveau et retirez le surnageant sans gratter les côtés ou la pastille.

Par la suite, la quantification des histones et l’analyse de la pureté sont effectuées comme décrit dans le texte du protocole. Un fractionnement facultatif des variants d’histones par HPLC en phase inverse peut également être effectué avant la dérivation des histones. Commencez cette procédure en dissolvant les échantillons d’histones dans 40 microlitres de bicarbonate d’ammonium de 50 millimolaires, pH 8,0.

Vérifiez le pH en insérant une pointe de pipette P10 dans l’échantillon sans aspiration et en touchant la pointe de la pipette à une bandelette indicatrice de pH. Utilisez de l’hydroxyde d’ammonium et de l’acide formique pour ajuster le pH à 8,0. À partir de là, toutes les étapes impliquant l’utilisation d’anhydride propionique doivent être effectuées dans une hotte.

Traitez un maximum de trois à quatre échantillons à la fois, afin de maintenir la réactivité de l’anhydride propionique. Préparez le réactif de propionisation frais en mélangeant de l’anhydride propionique avec de l’acétonitrile dans un rapport volumique de 1:3. Ajouter le réactif de propionylation à chaque échantillon dans un rapport de volume de 1:4.

Ajoutez rapidement de l’hydroxyde d’ammonium pour rétablir le pH de 8,0 dans la solution. Habituellement, l’ajout d’hydroxyde d’ammonium à l’échantillon avec un rapport volumique de 1:5 est approprié pour rétablir le pH 8,0. Mélanger immédiatement par vortex.

Vérifiez le pH. Incuber les échantillons à température ambiante pendant 15 minutes. Une fois que tous les échantillons ont subi une propionylation, séchez-les à 10 à 20 microlitres dans un concentrateur sous vide.

Remettre en suspension ou diluer les échantillons avec du ddH20 jusqu’à ce que 40 microlitres de volume final soient atteints. Étant donné que les sels entravent la chromatographie liquide et la spectrométrie de masse, les échantillons doivent être dessalés avant l’analyse. Pour les besoins de cette vidéo, seule la construction des pointes de scène sera démontrée.

À l’aide d’une pointe de pipette P1000, poinçonnez un disque de matériau C18 à partir d’un disque d’extraction en phase solide. À l’aide d’un capillaire en silice fondue, le mini-disque est sorti de l’embout P1000 et l’a inséré dans le fond d’un embout de pipette P100 ou P200. Assurez-vous que le disque est solidement calé au bas de la pointe.

Si vous dessalez plus de 25 microgrammes d’échantillon, utilisez deux mini-disques C18 dans la même pointe P100 ou P200. Utilisez un adaptateur de centrifugeuse pour maintenir les pointes de la platine en place dans des tubes de microcentrifugation de 1,5 ou deux millilitres. Rincez la résine en la filant avec 50 microlitres d’acétonitrile à 100 % pour activer le matériau C18 et éliminer les contaminants potentiels.

Le dessalage de l’échantillon est ensuite effectué comme décrit dans le texte du protocole. Les peptides d’histones sont présents sous diverses formes isobares. Deux exemples couramment abondants dans l’analyse des histones sont présentés.

Le chromatogramme ionique extrait de la masse de leur précurseur et de leurs isotopes relatifs, illustré ci-dessus, est identique. Cependant, le chromatogramme ionique extrait des ions produits, illustré ci-dessous, permet de discriminer les deux formes isobares. Seuls les ions de fragments uniques, surlignés en rouge, doivent être utilisés pour estimer l’abondance relative des deux espèces.

Des histones extraites de cellules souches embryonnaires humaines, avec et sans stimulation à l’acide rétinoïque, ont été analysées. La quantification relative de deux peptides d’histone H3 a révélé une nette réduction de l’acétylation dans les cellules souches embryonnaires humaines, stimulées pour la différenciation. Ceci est cohérent avec les rapports précédents faisant état d’une acétylation plus élevée dans les cellules souches embryonnaires, par rapport aux cellules différenciées.

Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en trois jours si elle est correctement exécutée. Un jour pour l’extraction des histones, le deuxième jour pour la dérivation et la digestion des protéines et le troisième jour pour la dérivation peptidique, le basculement d’étage et l’analyse LC-MS. La purification des histones peut être exploitée à d’autres fins que l’analyse des peptides, y compris la protéomique intermédiaire et descendante, où il est possible de caractériser les modifications combinatoires des histones.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’identifier et de quantifier la modification post-traductionnelle des histones à l’aide de la protéomique basée sur la spectrométrie de masse.