Spécificité des anticorps de liaison pour Kappa (VK) humaines (IgM) contenant de chaîne légère: POLYSIALIQUE Acid (PSA) Rattaché à NCAM comme étude de cas

L’objectif global de cette procédure est d’identifier les antigènes des anticorps ayant un potentiel thérapeutique, en mettant l’accent sur l’isotype IgM. Cette méthode comble une lacune dans les connaissances dans le domaine biomédical et pourrait aider à identifier de nouveaux biomarqueurs et agents immunothérapeutiques pour la recherche sur le cancer et les maladies du système nerveux central. Le principal avantage de cette technique est qu’elle ouvre la porte à une classe négligée d’anticorps à fort potentiel thérapeutique.

Les implications de cette technique s’étendent au diagnostic et au traitement de toutes les maladies qui peuvent être ciblées par des thérapies à base d’anticorps. Ce que cette question peut fournir un aperçu des antigènes des anticorps IgM et des tissus et sous-cultures en croissance. Il peut également être un fléau pour d’autres isotypes d’anticorps de toutes les espèces.

J’ai eu l’idée de cette méthode pour la première fois lorsque j’ai réalisé une liaison spécifique et proéminente de l’anticorps IgM dans différentes applications biochimiques. Robert Kahoud et Jens Watzlawik feront la démonstration de la procédure. Pour commencer cette procédure, faites une incision sur le crâne vers l’avant au niveau de l’oreille et retirez le crâne.

Ensuite, placez délicatement le cerveau dans un tube de 15 millilitres et rangez-le immédiatement sur de la glace sèche. Après cinq minutes, transférez le cerveau sur un papier de pesée propre et retirez rapidement le cervelet et le tronc cérébral à l’aide d’une lame de rasoir propre. Ensuite, pesez le cerveau congelé avant de le transférer dans le tube de 15 millilitres sur de la glace.

Ajoutez un tampon de lyse glacé à une concentration finale de 150 microgrammes de tissu cérébral par microlitre de tampon de lyse. Ensuite, homogénéisez le cerveau dans un tampon de lyse par trituration à l’aide d’une pointe de pipette d’un millilitre suivie d’une trituration à l’aide d’une seringue de cinq millilitres équipée d’une aiguille de calibre 27. Après cela, incubez le lysat cérébral pendant 30 minutes supplémentaires sur de la glace pour permettre une lyse complète des tissus.

Après 30 minutes, retirez le détergent, les matières insolubles et les lipides cérébraux jusqu’à la centrifugation en série. Jetez la myéline et les débris cellulaires contenant des pastilles, mais conservez le surnageant après chaque étape de centrifugation. Aliquote le lysat du cerveau et stockez-le à 80 degrés Celsius.

Dans cette étape, préparez 200 millilitres de tampon IP avec BSA et 200 millilitres supplémentaires de tampon IP sans BSA. Pour la réaction d’immunoprécipitation, transférez 100 microlitres de boue d’agarose de protéine L dans un tube de microcentrifugation de 1,5 millilitre. Ajoutez un millilitre de tampon IP avec BSA dans le tube.

Ensuite, mélangez-le manuellement par inversion. Ensuite, lavez quatre fois les billes d’agarose Protein L par centrifugation. Après cela, retirez le surnageant sans déranger la pastille d’agarose et répétez la procédure de lavage trois fois de plus.

Ensuite, ajoutez du BSA frais contenant un tampon IP à l’agarose protéique L et incubez-le pendant la nuit sur un rouleau à quatre degrés Celsius. Dans 800 microlitres de tampon IP contenant du BSA et 30 milligrammes de tissu cérébral lysé, ajoutez 20 microgrammes d’anticorps expérimental, d’anticorps de contrôle ou de PBS. Incuber 30 milligrammes de tissu cérébral lysé dans un tampon IP glacé avec des anticorps IgM dans un tube de microcentrifugation de 1,5 millimètre pendant la nuit à quatre degrés Celsius.

Le lendemain, faites tourner des billes d’agarose Protein L dans une centrifugeuse de paillasse. Jetez le surnageant sans déranger la pastille d’agarose. Ensuite, ajoutez la solution de lysat de cerveau d’anticorps réfrigérée à l’agarose protéique L.

Incuber l’antigène de l’anticorps, la protéine L en suspension d’agarose, pendant deux heures sur un rouleau à quatre degrés Celsius. Après deux heures, laver le complexe d’antigènes d’anticorps attaché à l’agarose L par centrifugation. Jetez soigneusement le surnageant sans déranger la pastille et ajoutez-y un millilitre de tampon IP glacé contenant 0,2 % BSA.

Répétez l’étape de lavage une fois de plus en utilisant un tampon IP glacé contenant 0,2 % de BSA et deux fois de plus en utilisant un tampon IP glacé sans BSA. Après cela, faites tourner le complexe antigène d’anticorps attaché à l’agarose L.Utilisez une pipette de 200 microlitres pour jeter le surnageant jusqu’à ce qu’environ 50 microlitres de la solution soient laissés sur le dessus sur la pastille d’agarose de protéine L. Ensuite, utilisez une pipette de 10 microlitres pour le retirer complètement.

Gardez tous les échantillons sur de la glace. Ensuite, ajoutez 40 microlitres de tampon d’élution IP dans chaque tube de microcentrifugation de 1,5 millilitre. Effleurez le tube six fois et chauffez-le pendant cinq minutes à 95 degrés Celsius.

Après cela, placez l’échantillon sur de la glace pendant deux minutes et faites-le tourner pendant 30 secondes. Ensuite, transférez 35 microlitres de surnageant dans un nouveau tube de microcentrifugation de 1,5 millimètre sans déranger la pastille. Ensuite, confirmez l’absence de billes d’agarose de protéine L en rinçant une petite quantité d’échantillon dilué au niveau de la paroi du tube intérieur.

S’il y a des billes d’agarose de protéine L, faites tourner l’échantillon pendant encore 30 secondes à 13 000 fois g et transférez le surnageant dans un tube propre. Répétez cette étape jusqu’à ce qu’il n’y ait plus de perles d’agarose détectables. Ensuite, chargez 10 à 20 microlitres d’échantillons dilués par puits sur un gel de polyacrylamide SDS et un système de tampon SDS de tris-glycine et faites fonctionner le gel pendant environ une heure à 100 volts sur la paillasse sans refroidissement supplémentaire.

Ensuite, transférez les protéines dans une membrane PVDF. Les protéines sont transférées pendant deux heures et demie dans la chambre froide à 100 volts à l’aide d’un tampon de transfert à froid. Bloquez la membrane avec 10 % de poids par volume de poudre de lait en poudre dans du PBS-T pendant une heure à 25 degrés Celsius sur un agitateur orbital de paillasse.

Lavez-le deux fois pendant 10 minutes à chaque fois avec PBS-T. Sonde la membrane avec l’anticorps primaire dans 5 % BSA dans PBS-T. Incuber sur un agitateur orbital dans la chambre froide pendant la nuit.

Le lendemain matin, lavez la membrane une fois avec un excès de PBS-T à 25 degrés Celsius, suivie de trois lavages avec du PBS-T pendant 10 minutes chacun sur un agitateur orbital. Ensuite, ajoutez de l’anticorps secondaire et 5 % de poudre de lait en poudre dans du PBS-T à la membrane et incubez-le pendant une heure à 25 degrés Celsius sur un agitateur orbital. Après cela, lavez la membrane une fois avec un excès de PBS-T à 25 degrés Celsius, suivie de trois lavages avec du PBS-T pendant 10 minutes chacun sur un agitateur orbital.

Mélangez un millilitre de substrat A de substrat HRP à chimiluminescence améliorée réfrigérée avec un millilitre de composant B à 25 degrés Celsius. Transférez la membrane sur une serviette en papier pour enlever l’excès de liquide. Ensuite, séchez le récipient avec du papier absorbant avant d’y transférer la membrane.

Ajoutez immédiatement deux millilitres du substrat HRP à la membrane et incubez-le pendant deux minutes à 25 degrés Celsius. Inclinez le récipient à la main toutes les 20 secondes pour humidifier uniformément la membrane. Après cela, transférez la membrane dans un manchon en plastique transparent et éliminez l’excès de liquide et les bulles d’air avec des serviettes en papier.

Collez le manchon en plastique dans la cassette et fermez-la. Cette figure montre que l’immuno-HigM12 précipite son antigène à partir des lysats cérébraux du cerveau et agit comme un agent détecteur dans les transferts de Western. Ni l’anticorps de contrôle d’isotype, ni les billes d’agarose L n’immunoprécipitent un antigène similaire, ce qui démontre la spécificité de la traction vers le bas.

Ici, les transferts Western utilisant des lysats du SNC de souris de type sauvage et des souris knock-out NCAM démontrent la spécificité de la liaison de HIgM au PSA contenant NCAM. En utilisant la méthode décrite dans le présent document, des cultures microgliales de rat positives à IBA-1 de haute pureté sont obtenues. Contrairement à la microglie, les antigènes de surface des cellules cibles HIgM12 et A2B5 étaient fortement enrichis dans les cultures d’OPC de rat dans des conditions de cellules vivantes.

Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée dans les 13 heures ouvrables. À la suite de cette procédure, d’autres méthodes telles que Biacore ou la technologie de résonance plasmonique de surface peuvent être utilisées pour identifier les affinités de liaison des anticorps aux constantes d’association et d’association. Après son développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de la recherche sur le cancer, des immunothérapies et des auto-anticorps naturels pour identifier les apitopes glucidiques sur des protéines similaires en tant qu’antigènes pour les anticorps IgM thérapeutiques chez l’homme.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’identifier les antigènes de glycoprotéines pour les travaux de recherche contenant des anticorps IgM humains. Les données fournissent une nouvelle cible pour le traitement de la SEP. PSA ENCAP, le traitement par anticorps que nous avons développé, est l’un des premiers à montrer une amélioration fonctionnelle dans une boîte d’activité en utilisant le modèle rigoureux qui est dans la maladie et dévalorisant la maladie similaire à la sclérose en plaques.