Name: Spécificité des anticorps de liaison pour Kappa (VK) humaines (IgM) contenant de chaîne légère: POLYSIALIQUE Acid (PSA) Rattaché à NCAM comme étude de cas (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 10 s
Description: Découvrez une méthode d'immunoprécipitation pour identifier les antigènes des anticorps IgM humains à l'aide de billes d'agarose Protein L. Cette technique permet de détecter de nouvelles cibles thérapeutiques pour le cancer et les maladies du système nerveux central.

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Ce travail a été soutenu par des subventions des National Institutes of Health (R01 GM092993, R01 NS048357 et R21 NS073684), la National Science Foundation (CAREER Award), le prix du Minnesota Partenariat pour la biotechnologie et génomique médicale, la National Multiple Sclerosis Society (CA1060A) , et la clinique Mayo Centre pour la science clinique et translationnelle (CCATS). Les auteurs reconnaissent le soutien des Fondations Applebaum, Hilton, Peterson et Sanford, la Lune et Marilyn Fonds Directorship Park et la famille McNeilus.

Les brevets pour les anticorps qui favorisent la remyélinisation et la réparation du SNC sont délivrés et détenus par la Mayo Clinic. Les auteurs sont en conflit d’intérêts potentiel.

Autoanticorps IgM naturelles humaines sont attrayants pour les candidats immunothérapies et ont démontré un potentiel thérapeutique pour le traitement de diverses maladies , y compris le cancer et les troubles du SNC 1-7. Avantageusement, ces anticorps ne sont pas provoquer une réponse immunitaire dans lequel la génération d&#39;anticorps neutralisants réduit considérablement la dose thérapeutique efficace et l&#39;efficacité. Surtout, tous les anticorps ayant un potentiel thérapeutique ont été de l&#39;isotype IgM et appartiennent au répertoire NAb 3-5,8,9,37,40,42-45. Un obstacle majeur à l&#39;application clinique potentielle des anticorps IgM est l&#39;identification de leurs antigènes, qui sont indéterminés dans de nombreux cas. Les techniques standard utilisées pour les anticorps IgG ne sont souvent pas applicable pour identifier l&#39;antigène d&#39;un IgM. Ce protocole décrit la détermination de PSA-NCAM comme antigène pour l&#39;anticorps IgM humaine de régénération HIgM12, efficace dans des modèles animauxde la SP et la SLA 15-18. La méthodologie utilisée est principalement applicable à tous les anticorps humains avec des chaînes légères Vk spécifiques VκI, VκIII et VκIV et des anticorps de souris avec des chaînes légères VκI, quel que soit le isotype de l&#39;anticorps. L&#39;étape la plus critique de ce protocole est l&#39;utilisation d&#39;anticorps IgM dans des applications de Chromatographie d&#39;affinité. Plus précisément, les anticorps retenus doivent agir en tant qu&#39;agents pull-down dans immunoprécipitations d&#39;isoler ou d&#39;enrichir un antigène de tissu ou de culture cellulaire lysats complexes. Les fractions enrichies de l&#39;antigène peuvent être comparés à des immunoprécipitations provenant d&#39;anticorps de contrôle d&#39;isotype et analysés par la suite les différences par spectrométrie de masse. Une exigence ou la limitation de cette étape essentielle est la présence de l&#39;anticorps correcte Vk chaîne légère et l&#39;hôte (humain, souris) pour permettre la liaison à la protéine L agarose anticorps. L&#39;utilisation de la protéine de liaison au mannane lié à agarose (également callelectine d liant le mannose) au lieu de la protéine L agarose est une alternative potentielle à immunoprécipiter IgM sans chaînes spécifiques de lumière Vk. Cependant, comme indiqué par Arnold et al. , 35, IgM lié à l&#39; antigène ne se lient pas à la protéine de liaison au mannane, comme les glycanes cibles semblent devenir inaccessibles une fois que l&#39;IgM est lié à son antigène. Sur la base de ces résultats mannane protéine ne peut pas être utilisée comme matrice de liaison à immunoprécipiter un antigène chargé par les molécules d&#39; IgM 35. D&#39; autres solutions de rechange potentielles pourraient être l&#39;utilisation d&#39;agarose lié des anticorps anti-IgM IgG secondaires 46,47 ou utilisation de billes magnétiques activées en surface 48. Les anticorps IgG dirigés contre les IgM peuvent être réticulés chimiquement à de l&#39;agarose ou un agarose G dans le but de réduire l&#39;ampleur de l&#39;anticorps élue conjointement avec l&#39;antigène d&#39;intérêt. Une comparaison valable entre les différentes variantes de immunoprécipitation IgM par rapport à des antigènes identifiés avec succès is difficile parce que la plupart des immunoprécipitations ont été effectuées pour isoler ou épuiser les IgM sans intérêt pour leurs antigènes. En outre, les immunoprécipitations utilisant IgM ont été principalement utilisés pour confirmer un seul antigène déjà connu ou attendu avec une exposition d&#39;anticorps à des antigènes purifiés 49. Un inconvénient d&#39;IgG d&#39;agarose couplées à l&#39; encontre IgM humaine est un très faible rendement (10-15%) des molécules d&#39; IgM sériques immunoprécipité par rapport à la matière de départ 50. En revanche, les billes magnétiques activées en surface ont été appliqués avec succès à des anticorps de différents isotypes IgM , y compris pour immunoprécipiter fibrilles associées à la tremblante 48. Ce procédé ne se limite pas à kappa spécifique (Vk) ou lambda (λ) des chaînes ou d&#39;un hôte particulier et peut sensiblement élargir le spectre d&#39;anticorps IgM utilisés dans les immunoprécipitations. Une autre étape importante dans le protocole est la capacité de l&#39;anticorps à fonctionner en tant que detète anticorps (anticorps primaire) dans Western blots ou d&#39;autres plates-formes de dépistage. des anticorps choisis doivent cibler leur antigène avec une affinité suffisamment élevée pour permettre la liaison d&#39;antigène, en présence de détergents non ioniques ou éventuellement ioniques. anticorps de haute affinité sont fréquents chez les anticorps IgG affinité maturée, mais moins fréquent chez les anticorps de l&#39;isotype IgM, qui est l&#39;une des raisons pour lesquelles il y a relativement peu d&#39;anticorps IgM disponibles dans le commerce en tant qu&#39;agents de détection dans les paramètres biochimiques. Haute affinité de liaison des anticorps est une exigence pour les immunoprécipitations d&#39;antigènes moléculaires et pour le transfert de Western. Abaisser les concentrations de détergent ou de l&#39;absence totale de détergents dans des tampons IP et les tampons de lyse permet à l&#39;antigène cible par des anticorps de faible affinité via son domaine Fab. En revanche, la capacité de l&#39;anticorps à la protéine cible d&#39;agarose L par l&#39;intermédiaire de sa partie Fc est substantiellement pas affectée chez les témoins isotypiques sur une gamme de différentes concen détergentestrations. Toutefois, une faible concentration de détergent dans le tampon de lyse et un tampon IP empêche la perturbation de la membrane cellulaire et à l&#39;isolement de molécules spécifiques. De même, une faible concentration de détergent dans Western blot tampons de lavage (par exemple, PBS-T) permet la liaison des anticorps de faible affinité antigène , mais en même temps augmente la liaison non spécifique et est donc pas une option. La présence d&#39;un noyau de protéine d&#39;antigène est une autre exigence pour cette méthode. Les protéines avec des modifications post - traductionnelles (par exemple, les glycoprotéines, les lipoprotéines) et des protéines non modifiées, mais pas les lipides ou les glucides seuls, sont détectables dans les Western blots. Il est impossible d&#39;immunoprécipiter des lipides (par exemple, des sphingolipides) à partir de lysats de tissus ou de cellules en présence ou en l&#39; absence de détergents. Les propriétés physico-chimiques des détergents et des lipides sont trop similaires pour permettre des interactions lipide-anticorps sélectifs, alors que dans le même temps les détergents sont essentiels pour perturberLes membranes de manière à permettre l&#39;isolement sélectif de molécules spécifiques. À notre connaissance, seul immunoprécipitations comprenant des hydrates de carbone, en l&#39;absence d&#39;un noyau de protéine, n&#39;a pas été précédemment rapporté. Cela devient particulièrement pertinent parce que les anticorps IgM ciblent fréquemment des glucides et des glycolipides, qui ne sont pas nécessairement liés à une unité de protéines. D&#39;autres techniques chromatographiques sont nécessaires pour la séparation et l&#39;identification immunologique des lipides et des hydrates de carbone en l&#39;absence d&#39;un noyau de protéine. Par exemple, la Chromatographie sur couche mince (CCM) des lipides cellulaires avec la détection d&#39;anticorps ultérieure sur la plaque de CCM (Chromatographie sur couche mince immuno-) peut être mis en œuvre 51,52. D&#39;autres anticorps anti-PSA ont été décrits dans des études antérieures et les résultats ont été comparés avec HIgM12 ainsi que disponible dans le commerce anti-PSA IgM (clone 2-2B). L&#39;anticorps le plus couramment utilisé dans le domaine de PSA est un anticorps IgG (clone 735) disponible en tant que Monoc de la sourisun anticorps polyclonal de lapin lonal ou 53. Cet anticorps IgG anti-PSA PSA détecte le SynCAM et NCAM sur différents types de cellules du système nerveux central incluant les cellules microgliales 41. Par contraste avec l&#39;anticorps anti-PSA IgG, IgM humains HIgM12, HIgM42 et l&#39;anticorps anti-PSA IgM de souris (clone 2-2B) ne sont pas capables de cibler le PSA SynCAM (mais NCAM) à divers stades embryonnaires et post-natales précoces chez des souris , tandis que SynCAM non polysialylés est facilement détectable 15. Les anticorps IgM utilisés sont également pas en mesure de détecter PSA sur les cellules microgliales (figures 3 + 4). Une explication possible pour les différences observées entre les isotypes d&#39;anticorps peuvent être des niveaux de PSA-SynCAM bas par rapport aux niveaux de PSA-NCAM combiné avec l&#39;affinité de liaison potentiellement plus faible d&#39;anticorps IgM par rapport à l&#39;IgG anti-PSA. Pour tester cette hypothèse, nous avons effectué des immunoprécipitations chez les animaux NCAM KO au stade embryonnaire E17 avec de vastes quantités de SynCAM présent et utilisé HIgM12 comme un «agent pull-down&quot; &lt;sup&gt; 15. Dans littermate E17 WT commande le HIgM12 immunoprécipitée PSA-NCAM dans une mesure qui a montré des intensités similaires de la «tirée vers le bas&quot; PSA-NCAM par rapport à la chaîne lourde IgM telle que détectée par densitométrie en Western Blot ultérieure en utilisant des antigènes élués. Ce résultat a suggéré au moins une affinité suffisante de HIgM12 à son PSA cible. Contrairement à WT littermate contrôle HIgM12 n&#39;a pas détecté PSA attaché à SynCAM chez les animaux NCAM KO. Des résultats identiques ont été obtenus en utilisant des immunoprécipitations anti-PSA HIgM42 IgM humaine. HIgM12 et HIgM42, ainsi que la souris anti-PSA IgM (clone 2-2B) ont été incapables de cibler PSA sur SynCAM en Western blots de WT et NCAM KO animaux à des stades de développement embryonnaire et postnatal. Compte tenu de la faible quantité de HIgM12 requise (0,1 pg / ml) pour détecter spécifiquement PSA attaché à la NCAM dans des Western blots en utilisant de petites quantités de tissu du système nerveux central (SNC 0,1 ug de tissu par puits) , 15 il semble peu probable que de faibles affinités seulesresponsable de l&#39;absence totale de détection PSA-SynCAM par HIgM12 dans trois méthodes différentes. Nous concluons qu&#39;il existe des différences significatives entre les anticorps anti-PSA IgM et l&#39;anticorps anti-PSA IgG fréquemment publié (clone 735). On ne sait pas pourquoi les anticorps anti-PSA IgM disponibles dans le commerce ne sont pas utilisés plus fréquemment dans le passé pour confirmer les résultats obtenus avec antiPSA anticorps IgG 735. Ceci est particulièrement intéressant parce HIgM12 a déjà prouvé leur efficacité dans des modèles de maladies différentes. Alors que d&#39;autres anticorps anti-PSA IgM peuvent avoir des effets thérapeutiques similaires, il reste difficile de savoir si l&#39;anticorps anti-PSA IgG (clone 735) a un résultat thérapeutique similaire dans les modèles de sclérose en plaques et la SLA. En bref, les méthodes décrites ici ont été principalement utilisés pour identifier l&#39;antigène des HIgM12 d&#39;anticorps humains régénératrices pour soutenir les essais cliniques potentiels pour MS et éventuellement d&#39;autres maladies neurodégénératives. L&#39;identification des fourmisigens pour les anticorps ayant une activité biologique est l&#39;étape comme essentielle pour comprendre leur mécanisme d&#39;action. Cela devient particulièrement pertinent dans le contexte de nombreux anticorps monoclonaux actuellement testés pour la sécurité et l&#39;efficacité dans des essais humains. Alors que le nombre d&#39;anticorps IgM cliniquement testés à ce jour est faible, les progrès récents dans la technologie des hybridomes ainsi qu&#39;un nombre croissant d&#39;études mettant en évidence le potentiel thérapeutique de cette classe d&#39;anticorps 1-10,37,40,42-45 exhorte le développement de nouvelles ou méthodes modifiées applicables à identifier les antigènes IgM non protéiques.

Anticorps de l&#39;isotype IgM montrent un grand potentiel thérapeutique pour le traitement de diverses maladies telles que le cancer et les troubles du SNC 1-7. Le groupe du Vollmers a identifié de nombreux anticorps chez les patients cancéreux pour une utilisation potentielle en tant que biomarqueurs spécifiques de la tumeur ou thérapeutiques actives qui sont capables de tuer les cellules malignes en induisant les voies apoptotiques 4,8,9. Fait intéressant, tous les anticorps identifiés ayant un potentiel thérapeutique sont de l&#39;isotype IgM et appartiennent au groupe des «autoanticorps naturels» (NABS). De même, le groupe de la souris et Rodriguez a identifié des anticorps humains qui stimulent la remyélinisation dans les lésions de la moelle épinière chronique démyélinisées dans des modèles de sclérose en plaques (SEP). Identiques à des anticorps ayant des effets anti-cancéreux, les anticorps de la remyélinisation favorisant AcN et sont de l&#39;isotype IgM 1,6,7,10. Les antigènes précis pour IgM plus identifiés sont encore undetermined y compris l&#39;anticorps remyélinisation promotion humaine rHIgM22, actuellement en phase I des essais cliniques pour les patients atteints de SEP 11. Malgré les efforts répétés par des experts dans le domaine de la recherche sur les lipides et les glucides à la fois dans le milieu universitaire et en partenariat avec l&#39; industrie 11, tente d&#39;identifier les antigènes de rHIgM22 n&#39;a pas été couronnée de succès. L&#39;échec des techniques standard utilisées pour identifier des antigènes d&#39;anticorps IgG à travailler avec des anticorps IgM identifie un besoin critique d&#39;affiner les méthodes spécifiques pour ces anticorps que les plus susceptibles de glucides ou lipides cible les antigènes. L&#39;objectif de ce manuscrit est l&#39;anticorps régénérative humaine HIgM12 et les procédures expérimentales utilisées pour identifier son antigène. HIgM12 anticorps a été identifié chez des patients atteints de macroglobulinémie de Waldenstrom, stimule la croissance des neurites in vitro de 12 à 14 et des cibles d&#39; acide sialique (PSA) fixé à la molécule d&#39;adhésion des cellules neurales (PSA-NCAM) 15,16. HIgM12 prolonge la durée de vie dans un modèle de souris de la SLA 17 et améliore le résultat fonctionnel dans le virus de l&#39; encéphalomyélite murine de Theiler (TMEV) des souris infectées par. Plus précisément, HIgM12 stimule l&#39; activité motrice horizontale et verticale spontanée chez la souris et augmente chroniquement démyélinisation nombre de petites et moyennes diamètre de la moelle épinière axones huit semaines après une seule dose faible de intrapéritonéale, injecté anticorps 18. La molécule d&#39;adhésion cellulaire neuronale (NCAM) est une glycoprotéine de l&#39;immunoglobuline (Ig) superfamille exprimée sur la surface cellulaire des neurones, des cellules gliales, les muscles squelettiques et les cellules tueuses naturelles 19-25. Les trois principales isoenzymes NCAM appelés NCAM180, NCAM140 et NCAM120, sont des variants d&#39;épissage alternatifs d&#39;un transcrit primaire qui varient seulement dans leur domaine cytoplasmique. Au sein du système nerveux central, la NCAM est la principale molécule polysialylés (&gt; 95%) avec de longues homopolymères d&#39;acide sialique chargés négativement. pOLYSIALIQUE uncid avec n&gt; 10 est appelé PSA mais les structures oligomériques plus courtes existent qui sont aussi biologiquement pertinents. D&#39; autres protéines polysialylés exprimées dans le SNC sont SynCAM1 26, Neuropilin-2 (NRP-2) 27,28 et une sous - unité de canal de sodium 25 (pour revue , voir 29). Les méthodes décrites ici permettent l&#39; identification d&#39;antigènes pour les immunoglobulines humaines et de souris contenant kappa (Vk) chaînes légères (VκI, VκIII ou VκIV chaînes légères pour des anticorps humains et les chaînes légères VκI pour les anticorps de souris) spécifiques indépendamment de la isotype de l&#39;anticorps (par exemple, IgG, IgM , IgA, IgD ou IgE). Cette limitation est basée sur l&#39;utilisation de la protéine L agarose pour immunoprécipitations avec des anticorps de l&#39;isotype IgM. D&#39;autres stratégies peuvent inclure des lectines liant le mannose et des anticorps IgG anti-IgM secondaires liés de manière covalente à des billes d&#39;agarose, qui peuvent élargir l&#39;applicabilité de cette méthode pour plusieurs anticorps IgM incLUDING ceux qui lambda (λ) des chaînes légères (voir la discussion). Ratios de sérum chaînes légères IgM Vk par rapport aux chaînes légères de IgM provenant d&#39;individus en bonne santé sont de 1,5: 1 30. Sur la base de la méthodologie chromatographique utilisé ici pour séparer, enrichir et immunologiquement détecter certaines molécules 31, tous les antigènes sont tenus d&#39;inclure au moins un domaine de petites protéines. Épitope de liaison spécifique de l&#39;anticorps peut être à l&#39; intérieur ou en dehors du domaine des protéines (par exemple, dans les glycoprotéines, les lipoprotéines). étapes biochimiques initiales utilisées pour identifier l&#39;antigène spécifique pour HIgM12, respective pour réduire la liste des candidats potentiels, sont les étapes les plus cruciales dans cette méthode. préparations spécifiques de type cellulaire et la caractérisation basée sur la morphologie des cellules sont décrites pour les cellules gliales, mais cette méthodologie peuvent être extrapolés pour accueillir d&#39;autres types de cellules à l&#39;intérieur ou à l&#39;extérieur du SNC. Il est urgentbesoin de développer de nouvelles ou modifiées techniques applicables pour le nombre croissant d&#39;anticorps IgM ayant un potentiel thérapeutique pour les différents troubles de l&#39;homme en particulier dans les cas (la majorité des antigènes IgM) où les cibles d&#39;anticorps sont des structures d&#39;hydrates de carbone ou des lipides.

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>Fisher Scientific</td><td>MT-10-013-CVRF</td><td>Glycémie élevée, avec glutamine, avec pyruvate de sodium, 500 ml</td></tr><tr><td>DMEM/F-12, HEPES</td><td>Life Technologies</td><td>11330-032</td><td>500 ml, L-glutamine, pyruvate de sodium, haute teneur</td></tr><tr><td>en glucose Pénicilline-Streptomycine</td><td>Life Technologies</td><td>15140-122</td><td>10 000 U/ml, 100 ml</td></tr><tr><td>Supplément N-2 (100x)</td><td>Life Technologies</td><td>17502-048</td><td>5 ml</td></tr><tr><td>B-27 Supplement (50x)</td><td>Life Technologies</td><td>17504-044</td><td>sans sérum, 10 ml</td></tr><tr><td>Sérum fœtal bovin - Optima</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S12450</td><td>500 ml</td></tr><tr><td>Eau stérile pour l’irrigation</td><td>Baxter Healthcare</td><td>#2F7114</td><td>USP-1 000 ml, 12/CA</td></tr><tr><td>Bromhydrate de poly-D-lysine</td><td>Sigma</td><td>P7886-50MG</td><td>D-Lys-(D-Lys)n-D-Lys &middot ; xHBr, poids moléculaire 30 000-70 000 g/mol, 50 mg</td></tr><tr><td>d’albumine sérique bovine fraction V</td><td>Sigma</td><td>A-3294-100G</td><td>, fraction de choc thermique, sans protéase, pH 7, pureté 98 %, 100 g</td></tr><tr><td>D-(+)-Glucose</td><td>Sigma</td><td>G5767-500G</td><td>C6H12O6, Poids moléculaire : 180,16 g/mol, réactif ACS, 500 g</td></tr><tr><td>de trypsine du pancréas bovin</td><td>Sigma</td><td>T9935-100mg</td><td>essentiellement sans sel, poudre lyophilisée, 9 000 unités BAEE/mg</td></tr><tr><td>de protéine désoxyribonucléase I du pancréas bovin Sigma</td><td></td><td>D5025-150KU</td><td>Type IV, poudre lyophilisée, 2 000 unités Kunitz/mg de protéine</td></tr><tr><td>de rat recombinant FGF basic Protein</td><td>R& D systems</td><td>3339-FB-025</td><td>BSA en tant que protéine porteuse, 25 &#181 ; g, lyophilisé, > 95 %, 16,2 kDa</td></tr> R<tr><td>& Protéine de rat recombinant PDGF-AA</td><td> D systems</td><td>1055-AA-50</td><td>sans porteur, 50 &#181 ; g, lyophilisé, > 97 %, E. coli-dérivé, 12,5 kDa</td></tr><tr><td>Neurobasal-A</td><td>Life Technologies</td><td>10888-022</td><td>500 ml, sans glutamine, sans acide aspartique, sans acide glutamique</td></tr><tr><td>Paraformaldéhyde</td><td>Sigma</td><td>P6148-1KG</td><td>cristallin, 1 kg, qualité réactif, poids moléculaire 30,03 g/mol (sous forme de monomère)</td></tr><tr><td>Tris[hydroxyméthyl]aminométhane (Tris bas</td><td>Biorad</td><td>#1610719</td><td>1 kg, 99,8 % pur, poudre</td></tr><tr><td>Dodécylsulfate de sodium (SDS)</td><td>Biorad</td><td>#1610302</td><td>1 kg, poudre</td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP-381-5</td><td>C2H5NO2, Poids moléculaire : 75,07 g/mol, Poudre cristalline blanche, 5 kg</td></tr><tr><td>Chlorure de sodium</td><td>Sigma</td><td>S7653-5KG</td><td>NaCl, Poids moléculaire : 58,44 g/mol, 5 kg</td></tr><tr><td>de phosphate de sodium monobasique</td><td>Sigma</td><td>S0751-500G</td><td>NaH2PO4, Poids moléculaire : 119,98 g/mol, 500 g</td></tr><tr><td>Solution tamponnée au phosphate 1x (PBS)</td><td>Cellgro</td><td>MT-21-040-CV</td><td>sans calcium ni magnésium, 6 x 500 ml</td></tr><tr><td>Falcon 60 mm TC-treated TC-Culture Dish</td><td>Corning Life Sciences</td><td>#353002</td><td>Boîte de culture cellulaire de 60 mm, polystyrène traité TC, 20/paquet, stérile</td></tr><tr><td>Boîte de Pétri Falcon 60 mm x 15 mm</td><td>Corning Life Sciences</td><td>#351007</td><td>Boîte de Pétri bactériologique non traitée TC, 20/paquet</td></tr><tr><td>Plaques de culture cellulaire à 6 puits</td><td>Corning Costar</td><td>CLS3516</td><td>6 puits, fond plat (emballé individuellement), irradié aux rayons gamma, surface de croissance 9,5 c</td></tr><tr><td>75 cm&sup2 ; flacon de culture tissulaire</td><td>Corning Life Sciences</td><td>430720U</td><td>75 cm&sup2 ; Fiole de culture cellulaire à col incliné en forme de U avec bouchon d’étanchéité</td></tr><tr><td>Pierce & commerce ; Protéine L Plus Agarose</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>#20520</td><td>2 ml, réticulé 6 % agarose perlée (CL-6B), capacité de liaison : 10 à 20 mg IgG</td></tr><tr><td>4 - 20 % Mini-PROTEAN TGX Precast Gel</td><td>Biorad</td><td>456-1094</td><td>10 puits, 50 & micro ; l, pour une utilisation avec les cellules d’électrophorèse Mini-PROTEAN</td></tr><tr><td>Immobilon-P Membrane</td><td>Millipore</td><td>IPVH00010</td><td>PVDF, 0,45 & micro ; m, rouleau de 26,5 cm x 3,75 m</td></tr><tr><td>Anticorps anti-acide polysialique-NCAM, clone</td><td>Millipore</td><td>MAB5324</td><td>50 microlitres, Hôte : souris, monoclonal IgM</td></tr><tr><td>4x Laemmli Sample Buffer</td><td>Biorad</td><td>#1610747</td><td>10 ml, 4x tampon d’échantillon de protéines prémélangées</td></tr><tr><td>2-mercaptoethanol</td><td>Biorad</td><td>#1610710</td><td>25 ml, 98 % pur, 14,2 M</td></tr><tr><td>Endoneuraminidase-N (Endo-N)</td><td>ABC Scientific</td><td>ABC0020</td><td>50 microlitres, 200 & micro ; g/ml, 3 500 U/mg</td></tr><tr><td>Lamelles de verre de 25 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-545-102</td><td>Cercles n° 1 ; Epaisseur : 0,13 à 0,17 mm ; Taille : 25 mm</td></tr><tr><td>HEPES solution tampon</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15630-080</td><td>100 ml, 1 M</td></tr><tr><td>Hanks' Balanced Salt Solution 1x (HBSS)</td><td>Cellgro</td><td>MT-21-022-CV</td><td>500 ml, sans calcium, magnésium, phénol rouge</td></tr><tr><td>Papaïne</td><td>Worthington Coopération biochimique</td><td>LS003119</td><td>poudre lyophilisée, 100 mg</td></tr><tr><td>Magnesiumsulfate</td><td>Sigma</td><td>M-2643-500G</td><td>poudre, 500 g</td></tr><tr><td>de L-Glutamine</td><td>Gibco</td><td>#25030-081</td><td>100 ml, 200 mM&nbsp ;</td></tr></tbody></table>

spécificité des anticorps de liaison pour kappa (vk) humaines (igm) contenant de chaîne légère: polysialique acid (psa) rattaché à ncam comme étude de cas

Antibody Binding Specificity for Kappa (V&#954;) Light Chain-containing Human (IgM) Antibodies: Polysialic Acid (PSA) Attached to NCAM as a Case Study

Les anticorps de l’isotype IgM sont souvent négligés en tant que traitements potentiels dans les essais sur l’homme, les modèles animaux de maladies humaines ainsi que la détection d’agents dans les techniques de laboratoire standard. En revanche, plusieurs IgM humaines ont démontré leur efficacité dans des modèles de cancer et des modèles de troubles du SNC, notamment la sclérose en plaques (SEP) et la sclérose latérale amyotrophique (SLA). Parmi les raisons pour lesquelles ils ne sont pas pris en compte, citons les difficultés à exprimer, à purifier et à stabiliser les anticorps IgM, la difficulté d’identifier les antigènes (non protéiques), la faible affinité de liaison et les lacunes fondamentales dans les connaissances sur les glucides et les lipides. 
Ce manuscrit utilise HIgM12 comme exemple pour fournir un protocole détaillé de détection des antigènes par Western blot, immunoprécipitations et immunocytochimie. HIgM12 cible l’acide polysialique (PSA) attaché à la molécule d’adhésion des cellules neurales (NCAM). Du tissu cérébral de souris postnatal précoce provenant de souris de type sauvage (WT) et de souris knock-out NCAM (KO) dépourvues des trois principales variantes d’épissage du système nerveux central (SNC) NCAM180, 140 et 120 a été utilisé pour évaluer l’importance de NCAM pour la liaison à HIgM12. Une digestion enzymatique plus poussée des tissus du SNC et des cellules du SNC en culture à l’aide d’endoneuraminidases nous a permis d’identifier le PSA comme l’épitope de liaison spécifique de HIgM12.

Cette section illustre des exemples de résultats qui peuvent être obtenus par l&#39;étude de PSA-antigènes spécifiques d&#39;IgM humaines dans le système nerveux central. L&#39;utilisation d&#39;anticorps IgM humains contenant des chaînes légères spécifiques dans Vk paramètres biochimiques et par immunocytochimie fluorescent est représenté. HIgM12 immunoprécipite son antigène à partir de lysats cérébraux du cerveau et agit en tant qu&#39;agent (anticorps primaire), la détection dans des Western blots. Ni l&#39; anticorps témoin isotypique ni L billes d&#39; agarose immunoprécipitent un antigène similaire, ce qui démontre la spécificité de la tirer vers le bas (figure 1). Western blots en utilisant des lysats du système nerveux central de souris WT et KO NCAM démontrent la spécificité de liaison à HIgM12 contenant du PSA-NCAM (figure 2A). La digestion enzymatique du tissu du SNC de souris WT utilisant ENDO-NF identifie PSA attaché à NCAM que l&#39;épitope de liaison spécifique pour HIgM12 (figure 2B). Utilisation de la méthode décrite ici, sont obtenus chez le rat IBA-1 positif cultures microgliales de haute pureté (Figure 3). Disponible dans le commerce anticorps anti-PSA (clone 2-2B) n&#39;étiquette surface cellulaire ou des pools de PSA internes fixées et perméabilisées cellules microgliales IBA-1 positifs par microscopie à fluorescence. En accord avec la littérature publiée antérieurement, qui ne signale aucune expression de surface cellulaire de PSA-NCAM dans la microglie 16,41 HIgM12 ne marque pas les antigènes de surface cellulaire dans les cellules microgliales de rat purifiés. Fait intéressant, l&#39; étiquetage HIgM12 des résultats fixes et perméabilisées microglie dans un intracellulaire, motif périnucléaire qui ne sont pas limités à des organites spécifiques (figure 3). Les résultats sont en contraste avec ceux obtenus en utilisant un anticorps IgG anti-PSA (clone 735) , 26 qui cible PSA SynCAM dans la microglie au niveau de l&#39;appareil de Golgi 41. Contrairement à la microglie, HIgM12et des antigènes de surface des cellules cibles dans des cultures A2B5 OPC de rat hautement enrichis dans des conditions de cellules vivantes (figure 4). Les cultures OPC contiennent environ 5% contaminant les cellules microgliales. La figure 5 illustre un schéma pratiquement identique à la surface cellulaire de coloration entre HIgM12 et Acm anti-PSA (clone 2-2B) dans les astrocytes GFAP-positifs (figure 5A). Marquage immunofluorescent des astrocytes WT ENDO-NF-digérée par rapport au tampon astrocytes WT contrôle traités à l&#39; aide HIgM12 démontre la présence de PSA astrocytaire (figure 5B). La présence d&#39;astrocytes PSA positif in vivo doit encore être confirmé. <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/54139/54139fig1.jpg" /> Figure 1: HIgM12 agit comme un &quot;pull-down&quot; Agent immunoprécipitations immunoprécipitations de lysat total du cerveau des souris de trois mois vieux utilisant HIgM12, isotype contrôle humain HIGM.126 ou agarose L perles uniquement comme agents &quot;tirer vers le bas&quot;. Les protéines éluées ont été exécutées dans les Western blots avec des membranes sondées contre HIgM12. Les poids moléculaires des protéines éluées à partir des billes revêtues HIgM12 étaient dans la gamme de 160-200 kDa, en plus de la chaîne lourde IgM (~ 65-73 kDa). Ce chiffre a été modifié depuis J. Neurochem. 15. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54139/54139fig1large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/54139/54139fig2.jpg" /> Figure 2: HIgM12 Cibles l&#39;acide sialique (PSA) Moitié sur NCAM. A. homogénats de cerveau de P7, P13, P16 et P27 NCAM au total des souris KO et les contrôles de même portée hétérozygotes ont été exécutés dans les Western blots avec des membranes sondées contre HIgM12, PSA et β-actine comme témoin de chargement. <strong&gt; B. 10 ug de l&#39; adulte WT cerveau de souris lysat dans 1% de NP40 dans du PBS, pH 6,5 a été traitée avec endoneuraminidase N (ENDO-N) (exo) neuraminidase avec une spécificité de polymère d&#39;acide sialique α2-3 (sialidase) ou de PBS pendant une nuit à 37 ºC, exécuter en tant doublets dans Western blots et sondé contre HIgM12, PSA et β-actine comme témoin de chargement. Ce chiffre a été modifié depuis J. Neurochem. 15. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54139/54139fig2large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <img alt="Figure 3" src="/files/ftp_upload/54139/54139fig3.jpg" /> Figure 3: L&#39;absence de PSA sur le Rat microglies se reflète par un manque de HIgM12 Étiquetage microglie Rat ont été cultivées pendant 48 h sur enduit poly-D-lysine lamelles de verre et soit étiqueté en direct sur ​​la glace avec HIgM12 ou après fixation avec HIgM12 ou anti. -PSA mAb (clone 2-2B). Les cellules ont été triple marqué avec microglie marqueur IBA-1 (vert), HIgM12 / PSA (rouge) et DAPI (bleu). Images montrent le manque de surface cellulaire microgliale liaison utilisant HIgM12 (rangée du haut) et le manque d&#39;anti-PSA de liaison (clone 2-2B) à la surface cellulaire et les magasins internes dans la microglie de rat primaire (ligne inférieure). Sur la base de la morphologie bipolaire et absence d&#39;IBA-1 coloration, la petite cellule de PSA-positive (rangée inférieure) a été suggéré d&#39;être un OPC. Dans les cellules fixes, HIgM12 coloration a entraîné une punctated, motif périnucléaire qui n&#39;a pas été limité aux organites spécifiques et a été considéré comme une liaison non spécifique (rangée du milieu). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54139/54139fig3large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <img alt="Figure 4" src="/files/ftp_upload/54139/54139fig4.jpg" /> Figure 4: HIgM12 Cibles de surface cellulaire PSA-NCAM sur Rat OPCs OPCs Rat et microglie étaient cultu.rouge pendant 4 jours dans un milieu de prolifération sur des lamelles de verre revêtu de poly-D-lysine et triple marqués en direct sur la glace avec HIgM12 ou A2B5 (vert), interne macrophage / monocyte marqueur CD68 (clone ED-1) (rouge) et DAPI (bleu) . Images montrent des populations de cellules majorly positif pour le marqueur OPC A2B5 (rangée du haut) et HIgM12 (rangée du bas) avec quelques microglie CD68-positif (~ 5%). Phase contraste et des images DAPI ont été ajoutées pour révéler l&#39; intégrité des cellules et le nombre de cellules pour chaque population. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54139/54139fig4large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <img alt="Figure 5" src="/files/ftp_upload/54139/54139fig5.jpg" /> Figure 5: HIgM12 et anti-PSA mAb co-étiqueter une sous - population astrocytaire dans Souris mixte Glia. A. Souris cellules gliales mixtes de WT et NCAM au total des animaux KO contenant des astrocytes, des cellules oligodendrocytes lignée et microglia ont été cultivées pendant 3 jours et étiqueté en direct sur la glace avec HIgM12 (vert), anti-PSA mAb (clone 2-2B) (rouge) et ensuite pour le marqueur astrocytaire GFAP (violet) et DAPI (bleu). HIgM12 et anti-PSA révèlent un schéma de coloration identique virtuelle sur astrocytes WT GFAP-positifs, mais le manque de liaison aux astrocytes en culture de souris NCAM KO. Ce chiffre a été modifié depuis J. Neurochem. 15. B. glie mixtes ont été cultivées de manière identique , comme décrit sous A. et traités pendant la nuit avec endoneuraminidase-NF (aimablement fourni par le Dr Martina Muehlenhoff) ou le contrôle PBS. Les cellules ont été marquées en direct sur la glace avec HIgM12 (vert) et ensuite colorées pour les marqueurs GFAP interne (rouge) et DAPI (bleu). HIgM12 cible les antigènes de surface cellulaire sur PBS-contrôle traités cultures gliales mixtes mais pas endoneuraminidase-NF traités glie mixte. Ce chiffre a été modifié depuis JNSCI 16. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54139/54139fig5large.jpg" target="_blank">Pl</a>facilité cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure. Toutes les images ont été prises à 60X grossissement en utilisant les mêmes réglages de l&#39;appareil et traitées de manière identique. <img alt="Tableau 1" src="/files/ftp_upload/54139/54139table1.jpg" /> Tableau 1:. Buffer et Solution Recettes <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54139/Table1.xls">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour télécharger ce tableau.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td></td><td> tissu du SNC </td><td> ENDO-NF / PBS </td><td> Le tampon de lyse </td><td> Volume total </td></tr><tr><td> 1. WT souris </td><td> 67 ug (0,45 ul) </td><td> 2 ul (12 ug) ENDO-NF </td><td> 7,55 pi </td><td> 10 ul </td></tr><tr><td> 2. WT souris </td><td> 67 ug (0,45 ul) </td><td> 2 pl de PBS </td><td> 7,55 pi </td><td> 10 ul </td></tr><tr><td> 3. WT souris </td><td> 67 ug (0,45 ul) </td><td> pas de PBS ou ENDO-NF </td><td> 9,55 pi </td><td> 10 ul </td></tr><tr><td> 4. NCAM souris KO </td><td> 67 ug (0,45 ul) </td><td> 2 ul (12 ug) ENDO-NF </td><td> 7,55 pi </td><td> 10 ul </td></tr><tr><td> 5. NCAM souris KO </td><td> 67 ug (0,45 ul) </td><td> 2 pl de PBS </td><td> 7,55 pi </td><td> 10 ul </td></tr><tr><td> 6. NCAM souris KO </td><td> 67 ug (0,45 ul) </td><td> pas de PBS ou ENDO-NF </td><td> 9,55 pi </td><td> 10 ul </td></tr></tbody></table> Tableau 2: ENDO-NF digestion du tissu du SNC de souris P7 WT et NCAM KO.

Nous présentons un protocole permettant d’identifier des fractions protéiques contenant des antigènes pour les anticorps IgM humains et murins avec des chaînes légères spécifiques kappa (Vκ). Ce protocole n’est pas limité aux anticorps de classe IgM mais s’applique à tous les isotypes d’immunoglobulines qui ciblent leur antigène avec une affinité suffisamment élevée lors des immunoprécipitations.

Spécificité des anticorps de liaison pour Kappa (VK) humaines (IgM) contenant de chaîne légère: POLYSIALIQUE Acid (PSA) Rattaché à NCAM comme étude de cas

Antibodies of the IgM isotype are often neglected as potential therapeutics in human trials, animal models of human diseases as well as detecting agents ...

L'objectif général de cette procédure est d'identifier des antigènes pour des anticorps possédant un potentiel thérapeutique, en mettant l'accent sur l'isotype IgM. Cette méthode comble une lacune dans le domaine biomédical et pourrait aider à découvrir de nouveaux biomarqueurs ainsi que des agents immunothérapeutiques pour la recherche sur le cancer et les maladies du système nerveux central. Le principal avantage de cette technique est qu'elle ouvre la voie à une classe négligée d'anticorps ayant un fort potentiel thérapeutique.Les implications de cette technique s'étendent aux diagnostics et au traitement de toutes les maladies pouvant être ciblées par des thérapeutiques à base d'anticorps. Ce procédé peut fournir des informations sur les antigènes des anticorps IgM ainsi que sur les tissus en croissance et les sous-cultures. Il peut également s'avérer néfaste pour d'autres isotopes d'anticorps provenant de toutes les espèces.L'idée de cette méthode m'est venue lorsque j'ai observé une liaison spécifique et marquée de l'anticorps IgM dans diverses applications biochimiques. La procédure sera démontrée par Robert Kahoud et Jens Watzlawik. Pour commencer cette procédure, effectuez une incision sur le crâne vers l'avant au niveau des oreilles et retirez le crâne.Ensuite, placez délicatement le cerveau dans un tube de 15 millilitres et stockez-le immédiatement sur de la glace sèche. Après cinq minutes, transférez le cerveau sur du papier d’aluminium propre et retirez rapidement le cervelet et le tronc cérébral à l’aide d’une lame de rasoir propre. Puis, pesez l’hémisphère cérébral congelé avant de le remettre dans le tube de 15 millilitres placé sur de la glace.Ajouter du tampon de lyse glacé à une concentration finale de 150 microgrammes de tissu cérébral par microlitre de tampon de lyse. Ensuite, homogénéiser le cerveau dans le tampon de lyse par trituration à l’aide d’une pipette d’un millilitre, suivie d’une trituration à l’aide d’une seringue de cinq millilitres équipée d’une aiguille de calibre 27. Puis, incuber le lysat cérébral pendant 30 minutes supplémentaires sur de la glace afin de permettre une lyse tissulaire complète.Après 30 minutes, éliminer le détergent, les matières insolubles et les lipides cérébraux par centrifugations en série. Jeter le culot contenant la myéline et les débris cellulaires, mais conserver le surnageant après chaque étape de centrifugation. Aliquoter le lysat cérébral et stocker à 80 degrés Celsius.Dans cette étape, préparez 200 millilitres de tampon IP avec de l'albumine sérique bovine (BSA) et 200 autres millilitres de tampon IP sans BSA. Pour la réaction d'immunoprécipitation, transférez 100 microlitres de suspension d'agarose protéine L dans un tube microcentrifuge de 1,5 millilitre. Ajoutez un millilitre de tampon IP contenant de la BSA au tube.Ensuite, mélangez manuellement par retournement. Puis, lavez les billes d'agarose Protéine L quatre fois par centrifugation. Après cela, éliminez le surnageant sans perturber le culot d'agarose et répétez la procédure de lavage trois fois supplémentaires.Ensuite, ajoutez du tampon IP frais contenant de la BSA à l'agarose Protéine L et incubez-la toute la nuit sur un rouleau à quatre degrés Celsius. Dans 800 microlitres de tampon IP contenant de la BSA et 30 milligrammes de tissu cérébral lysé, ajoutez 20 microgrammes d'anticorps expérimental, d'anticorps contrôle ou de PBS. Incubez 30 milligrammes de tissu cérébral lysé dans du tampon IP glacé avec un anticorps IgM dans un tube microcentrifuge de 1,5 millimètre toute la nuit à quatre degrés Celsius.Le lendemain, centrifuger les billes d'agarose protéine L dans une centrifugeuse de banc. Jeter le surnageant sans perturber le culot d'agarose. Ensuite, ajouter la solution de lyssat cérébral d'anticorps refroidie à l'agarose protéine L.Incuber le complexe anticorps-antigène avec la suspension d'agarose protéine L pendant deux heures sur un rouleau à quatre degrés Celsius. Après deux heures, laver le complexe anticorps-antigène fixé sur l'agarose L par centrifugation. Jeter soigneusement le surnageant sans perturber le culot et ajouter un millilitre de tampon IP glacé contenant 0,2 % de BSA.Répétez l'étape de lavage une fois supplémentaire en utilisant du tampon IP froid additionné de 0,2 % de BSA, puis deux fois supplémentaires en utilisant du tampon IP froid sans BSA. Ensuite, centrifugez pour récupérer le complexe anticorps-antigène lié à l'agarose L. Utilisez une pipette de 200 microlitres pour éliminer le surnageant jusqu'à ce qu'environ 50 microlitres de solution restent au-dessus du culot d'agarose Protein L. Puis, utilisez une pipette de 10 microlitres pour l'éliminer complètement.Gardez tous les échantillons sur de la glace. Ensuite, ajoutez 40 microlitres de tampon d'élution pour IP à chaque tube microcentrifuge de 1,5 millilitre. Tapez légèrement le tube avec le doigt six fois et chauffez-le pendant cinq minutes à 95 degrés Celsius.Ensuite, placez l'échantillon sur de la glace pendant deux minutes et centrifugez-le pendant 30 secondes. Puis, transférez 35 microlitres du surnageant dans un nouveau tube microcentrifuge de 1,5 millilitre sans perturber le culot. Ensuite, confirmez l'absence de billes d'agarose Protéine L en rinçant une petite quantité d'échantillon dilué sur la paroi interne du tube.Si des billes d'agarose protéine L sont présentes, centrifuger l'échantillon encore 30 secondes à 13 000 ×g et transférer le surnageant dans un tube propre. Répéter cette étape jusqu'à ce qu'aucune bille d'agarose ne soit détectable. Ensuite, charger 10 à 20 microlitres d'échantillons dilués par puits sur un gel de polyacrylamide SDS et utiliser un système tampon tris-glycine SDS, puis faire migrer le gel environ une heure à 100 volts sur le banc sans refroidissement supplémentaire.Ensuite, transférez les protéines sur une membrane en PVDF. Effectuez le transfert des protéines pendant deux heures et demie dans une chambre froide à 100 volts en utilisant un tampon de transfert froid. Bloquez la membrane avec 10 % p/v de poudre de lait écrémé dans du PBS-T pendant une heure à 25 degrés Celsius sur un agitateur orbital en surface. Lavez-le deux fois pendant 10 minutes chaque fois avec du PBS-T. Incubez la membrane avec l'anticorps primaire dans du PBS-T contenant 5 % de BSA. Incubez sur un agitateur orbital dans la chambre froide toute la nuit.Le lendemain matin, laver la membrane une fois avec du PBS-T en excès à 25 degrés Celsius, suivie de trois lavages avec du PBS-T de 10 minutes chacun sur un agitateur orbital. Ensuite, ajouter l'anticorps secondaire et 5 % de poudre de lait écrémé dans du PBS-T sur la membrane et incuber pendant une heure à 25 degrés Celsius sur un agitateur orbital. Après cela, laver la membrane une fois avec du PBS-T en excès à 25 degrés Celsius, suivie de trois lavages avec du PBS-T de 10 minutes chacun sur un agitateur orbital.Mélangez un millilitre du composant A du substrat HRP pour chimiluminescence améliorée refroidi avec un millilitre du composant B à 25 degrés Celsius. Placez la membrane sur une serviette en papier pour éliminer le liquide en excès. Ensuite, séchez le récipient avec des serviettes en papier avant de remettre la membrane à l'intérieur.Ajouter immédiatement deux millilitres du substrat HRP de chimiluminescence améliorée pré-mélangé à la membrane et l'incuber pendant deux minutes à 25 degrés Celsius. Incliner le récipient manuellement toutes les 20 secondes afin d'humidifier uniformément la membrane. Ensuite, transférer la membrane dans une pochette plastique transparente et éliminer l'excès de liquide et les bulles d'air à l'aide de papier absorbant.Fixer au ruban la gaine en plastique dans la cassette et la fermer. Cette figure montre que HigM12 immunoprécipite son antigène à partir des lysats cérébraux et agit comme agent de détection dans les immunotransferts. Aucun des anticorps contrôles d'isotype ni les billes d'agarose L n'immunoprécipitent un antigène similaire, ce qui démontre la spécificité du tirage (pull down).Ici, les immunotransferts réalisés à l'aide de lysats du SNC provenant de souris de type sauvage et de souris knock-out pour NCAM démontrent la spécificité de la liaison de HIgM à NCAM contenant des PSA. La digestion enzymatique de tissu du SNC de souris de type sauvage à l'aide d'ENDO-NF identifie les PSA liés à NCAM comme l'épitope de liaison spécifique pour HIgM12. En utilisant la méthode décrite ici, on obtient des cultures de microglies de rat positives pour IBA-1 et de haute pureté. Contrairement aux microglies, les antigènes membranaires ciblés par HIgM12 et A2B5 étaient fortement enrichis dans les cultures de CPO de rat dans des conditions de cellules vivantes.Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en moins de 13 heures de travail. Après cette procédure, d'autres méthodes telles que le Biacore ou la technologie de résonance plasmonique de surface peuvent être utilisées pour déterminer les affinités de liaison des anticorps ainsi que leurs constantes d'association et de dissociation. Depuis son développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans les domaines de la recherche sur le cancer, des immunothérapies et des autoanticorps naturels, en leur permettant d'identifier des épitopes glucidiques sur des protéines agissant comme antigènes pour les anticorps IgM thérapeutiques chez l'homme.Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment identifier des antigènes glycoprotéiques pour des travaux de recherche contenant des anticorps IgM humains. Les données fournissent une nouvelle cible pour le traitement de la sclérose en plaques. PSA ENCAP, le traitement par anticorps que nous avons mis au point, est l'un des premiers à montrer une amélioration fonctionnelle dans une boîte d'activité utilisant le modèle rigoureux de la maladie et une pathologie similaire à la sclérose en plaques.

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Spécificité des anticorps de liaison pour Kappa (VK) humaines (IgM) contenant de chaîne légère: POLYSIALIQUE Acid (PSA) Rattaché à NCAM comme étude de cas (Vidéo) | JoVE Journal

Spécificité des anticorps de liaison pour Kappa (VK) humaines (IgM) contenant de chaîne légère: POLYSIALIQUE Acid (PSA) Rattaché à NCAM comme étude de cas

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