Création de sous-50 Nm nanofluidiques Jonctions en PDMS microfluidique Chip via processus d'auto-assemblage des particules colloïdales

Ce protocole démontre une technique d’auto-assemblage nouvelle et simple de nanoparticules de silice colloïdale pour créer une jonction nanofluidique entre deux microcanaux dans le polydiméthylsiloxane. La membrane de billes d’une taille de pore d’environ 45 nanomètres, agissant comme une membrane sélective de cations, peut être utilisée pour la concentration électrocinétique d’échantillons d’ADN et de protéines. Vue d’ensemble :Dans un premier temps, le dispositif PDMS avec des nanopièges est coulé par un processus de double moulage.

Après avoir collé le dispositif au plasma à un substrat de verre, des billes de silice fonctionnalisées en surface sont injectées dans les microcanaux pour former la membrane colloïdale auto-assemblée. Enfin, une tension est appliquée à travers la membrane à l’aide d’un compteur de source et d’un diviseur de tension. L’appauvrissement des ions et l’augmentation de la concentration sont observés à l’aide d’un microscope à épifluorescence inversée, avec une caméra CCD.

Préparation des suspensions de particules colloïdales de silice :À partir des billes de silice de 300 nanomètres ; stock de perles vortex pendant 30 secondes ; retirer une suspension de 600 microlitres dans un tube Eppendorf et centrifuger pendant une minute à 2 600 g. Après la centrifugation, retirez soigneusement le surnageant. Remettre les billes en suspension avec 400 microlitres de tampon de phosphate de sodium d’un millimolaire, pour atteindre une concentration de travail de 15 %.

Vortex pour obtenir une suspension homogène. Répétez les mêmes étapes pour préparer des billes de silice de 500 nanomètres. Pour des billes de silice carboxylique de 500 nanomètres, pesez 100 milligrammes dans un tube Falcon de 15 millilitres.

Transférez ensuite 9,8 millilitres de chlorure de sodium à une molaire pour remettre les billes en suspension. Agitez vigoureusement le tube. Retournez le tube plusieurs fois pour déplacer les billes impactées en bas.

Pour modifier la charge de surface sur les billes, nous préparons deux polyélectrolytes : HAP et PSS. Le PSS à 0,9 % est préparé en dissolvant 180 milligrammes de PSS avec 200 millilitres de chlorure de sodium à une molaire. Les 0,4 % de HAP sont préparés en déviant 300 microlitres de la solution mère en 15 millilitres de chlorure de sodium à une molaire.

Vortex les deux solutions pour s’assurer qu’elles sont complètement dissoutes. Pour déposer une couche de HAP chargée positivement, ajoutez 200 microlitres de la solution HAP à la suspension de billes. Agitez pendant une minute et incubez la suspension dans un rotateur pendant une heure à température ambiante.

Pour éliminer les HAP non liés, centrifugez la suspension à 1 801 g pendant une minute, afin de précipiter les billes. Retirez le surnageant. Pipetez un à deux millilitres d’eau dans le tube pour perturber les billes.

Ajouter les huit millilitres d’eau restants, puis vortex. Répétez la procédure de lavage quatre fois de plus. Après le cinquième lavage et la centrifugeuse, jetez le surnageant et restaurez les billes avec 9,8 millilitres de chlorure de sodium une molaire.

Pour déposer la couche PSS chargée négativement, ajoutez 200 microlitres de la solution PSS à la suspension de billes. Agitez pendant une minute et incubez la suspension dans le rotateur pendant une heure à température ambiante. Lavez les perles cinq fois avec de l’eau DI comme pour le revêtement HAP.

Après le dernier lavage, jetez le surnageant et remettez les billes en suspension avec 650 microlitres de tampon de phosphate de sodium d’un millimolaire avec 0,05 % Tween 20. Transférez la suspension des billes dans un tube eppendorf. Pour la préparation des billes de silice amine de 500 nanomètres, répétez la même procédure pour déposer une seule couche de PSS chargée négativement.

Fabrication de la puce microfluidique PDMS : Pour fabriquer le maître de silicium, appliquez d’abord une photorésine d’un micromètre d’épaisseur à 4 000 tr/min sur une plaquette de silicium. Ensuite, utilisez la lithographie par projection et la gravure ionique réactive pour créer des nanocanaux planaires de 700 nanomètres de profondeur et de deux micromètres de large comme nanopièges pour les billes. Ensuite, appliquez une couche de photorésine à 2 000 tr/min et effectuez un alignement sur les nanopièges précédemment structurés.

Ajoutez les microcanaux par lithographie par contact et par gravure ionique réactive profonde du silicium. Pour créer la couche de démoulage, silanate le maître de silicium dans un bocal sous vide avec 50 microlitres de trichlorosilane, pendant la nuit. Pour couler le moule PDMS, mélangez la base PDMS avec un agent de durcissement dans un rapport de 10:1.

Versez le mélange sur le master en silicone. Placez le master avec PDMS dans un bocal sous vide pour éliminer les bulles d’air et faites-le cuire au four à 70 degrés C pour réticuler le PDMS. Après une cuisson de deux heures, retirez délicatement la plaque PDMS du maître en silicone.

Traitez la surface avec du plasma pour créer une liaison permanente à une plaquette de silicium vierge. Fixez du ruban adhésif le long du bord pour marquer une ligne de partition pour l’étape de coulée PDMS suivante. Pour créer une couche de démoulage du moule, silanisez le moule PDMS dans un bocal sous vide pendant la nuit.

Coulez le PDMS sur le dessus du moule PDMS et transférez-le dans un bocal sous vide pour le dégazage. Ensuite, faites-le cuire au four. Décollez la dalle PDMS durcie du moule PDMS le long de la ligne de séparation marquée avec du ruban adhésif.

Coupez soigneusement les appareils et percez des trous avec un poinçon de biopsie de 1,5 millimètre dans les réservoirs. Après le nettoyage de la surface avec du ruban adhésif et de l’IPA, le plasma lie le dispositif PDMS sur une lame de verre de microscope de 25 millimètres sur 75 millimètres. Immédiatement après le collage plasma, injectez 10 microlitres de suspension dans les entrées quatre et six des canaux de distribution des billes.

Après avoir rempli les canaux de distribution des billes, couvrez tous les réservoirs, à l’exception des sorties un et neuf, des canaux de distribution des billes. Faites sécher l’appareil à l’air libre pendant trois heures à température ambiante et rangez-le à quatre degrés C avant de l’utiliser. Les micrographies de l’appareil montrent que les particules colloïdales s’assemblent à l’intérieur des canaux de distribution des billes supérieure et inférieure.

L’image MEB montre des particules colloïdales de silice de 300 nanomètres auto-assemblées piégées avec les réseaux de nanopièges, entre l’échantillon et le canal tampon. Remplissez les entrées trois et sept des canaux tampons avec 10 microlitres de tampon de phosphate de sodium d’un millimolaire. Remplissez l’entrée du canal d’échantillonnage cinq avec 10 microlitres d’échantillon d’ADN nanomolaire.

Appliquez une légère pression négative avec une pointe de pipette inversée sur toutes les sorties pour remplir les canaux avec les solutions sans bulles d’air. Ajoutez 10 microlitres de tampon de phosphate de sodium dans les réservoirs deux et huit, et 10 microlitres d’échantillon d’ADN dans le réservoir 10, pour stabiliser la pression pendant cinq minutes. Expérience de concentration électrocinétique de l’ADN : Connectez la puce microfluidique à un diviseur de tension connecté à un compteur de source.

Insérez les fils PT dans les réservoirs trois, sept, cinq et 10. Appliquez une tension aux bornes d’une jonction nanofluidique. Appliquez d’abord 30 volts sur les réservoirs cinq et 10, puis rectifiez sur les réservoirs trois et sept.

Diminuez la tension à 25 volts sur le réservoir 10 après environ 30 secondes. Résultats de la préconcentration électrocinétique : Le canal microfluidique est rempli d’ADN, avec une concentration initiale à 10 nanomolaires. Les micrographies time-lapse montrent la formation d’une région d’appauvrissement ionique, soit des jonctions colloïdales nanofluidiques.

La région de déplétion ionique a été initiée en 10 secondes. Une prise d’ADN concentrée a été générée lorsque la tension est appliquée au canal de l’échantillon, tandis que les canaux tampons ont été mis à la terre. Les lignes pointillées ont été utilisées pour mettre en valeur les parois du canal.

Un facteur de concentration d’environ 1 700 fois est atteint en 15 minutes à l’aide d’une membrane colloïdale de 300 nanomètres. L’intensité moyenne de fluorescence de l’ADN augmente en fonction du temps dans un membrabe nanoporeux. Les lignes pointillées représentent le niveau du signal pour l’ADN de 10 nanomolaires, 17 micromolaires, deux micromolaires et 10 micromolaires.

Le bouchon concentré est généré au niveau de la membrane nanoporeuse des billes de silice de 300 nanomètres ; les billes de silice de 500 nanomètres ; les billes d’amine de silice de 500 nanomètres, recouvertes d’une seule couche de PSS ; et les billes de carboxyle de silice de 500 nanomètres, recouvertes de deux couches de HAP et de PSS. En utilisant la membrane de silice colloïdale auto-assemblée avec une taille de pore estimée à 45 nanomètres, nous avons démontré la polarisation de la concentration ionique près de la jonction nanofluidique et concentré un échantillon d’ADN 1700 fois en 15 minutes. Par rapport aux nanocanaux à base de silicium, le principal avantage de la membrane colloïdale auto-assemblée est la possibilité d’effectuer une fonctionnalisation de surface complètement en dehors du dispositif microfluidique scellé, dans un flacon séparé.

Nous pensons que cette approche ouvre la possibilité de fabriquer rapidement une plateforme micro nanofluidique avec des tailles de pores facilement réglables, en contrôlant la taille des billes, la force ionique ou la valeur du pH de la solution tampon pour étudier le transport ionique et moléculaire dans la gamme de 10 à 100 nanomètres.