Une approche simple et efficace de construire Mutant Vaccinia vecteurs de virus

L’objectif global de cette expérience est d’améliorer l’efficacité de la génération du virus mutant de la vaccine en utilisant la technologie CRISPR-Cas9. Cette méthode peut contribuer à la création de nouveaux vecteurs du virus de la vaccine pour la recherche biologique et la recherche médicale, en particulier pour la thérapie génique et la vaccination. La démonstration virale avec cette méthode est essentielle, car l’identification et la détection des plaques positives sont difficiles à réaliser.

Le principal avantage de cette technique est qu’elle améliore considérablement l’efficacité de la fabrication de notre mutant, le virus de la vaccine. En commençant par les cellules CV-1 récoltées, ajustez leur concentration à 100 000 cellules par millilitre. Semez ensuite deux millilitres de suspension dans chaque puits d’une plaque à six puits pour la transfection.

Le lendemain, transfectez les cellules avec 0,5 nanogramme de plasmide gRNA-N2 et 0,5 nanogramme de plasmide pSTCas9. Ensuite, incubez-les pendant 24 heures. 24 heures plus tard, remplacez le fluide.

Ensuite, préparez le virus VVL15. Diluer le virus VVL15 avec du DMEM à 200 000 PFU par millilitre. Ajoutez ensuite 100 microlitres du virus dilué dans chaque puits des cellules CV-1 transfectées.

Deux heures plus tard, transfectez les cellules avec un microgramme du vecteur donneur navette pour l’expression de HR, et incubez les cellules pendant 24 heures. Le lendemain, détachez les cellules CV-1 transfectées à l’aide d’un grattoir cellulaire. Ensuite, collectez la suspension cellulaire dans un cryoflacon et stockez-la à moins 80 degrés Celsius pour une utilisation future.

Pour commencer la première série de purification du VV modifié, ensemencez 15 plaques à six puits avec 300 000 cellules CV-1 non modifiées par puits. Le lendemain, décongelez la suspension congelée des cellules CV-1 transfectées à 37 degrés Celsius pendant trois minutes, puis agitez vigoureusement la suspension pendant 30 secondes pour lyser les cellules. Diluez ensuite un microlitre de lysat avec trois millilitres de DMEM.

Ajoutez un demi-millilitre de cette dilution à chaque puits de plaque de cellules CV-1 non modifiées. Remettez ensuite les plaques dans l’incubateur pendant deux jours. Deux jours plus tard, identifiez les plaques positives à l’aide d’un microscope à fluorescence.

Ils peuvent être repérés avec un objectif 10X. Au fur et à mesure qu’elles sont identifiées, étiquetez avec précision les plaques sous la plaque à l’aide d’un marqueur. Préparez maintenant un flacon cryogénique contenant 200 microlitres de DMEM sans sérum pour chaque plaque positive à récolter.

Ensuite, il est important d’aspirer tout le milieu des puits avec des plaques étiquetées. Ensuite, à l’aide d’une pipette de 200 microlitres réglée pour aspirer 30 microlitres, chargez partiellement la pipette avec 10 microlitres de milieu du cryoflacon, puis grattez la plaque et aspirez les cellules avec l’aspiration restante. Éjectez-le dans le cryoflacon et répétez cette procédure deux fois de plus, en ciblant la même plaque positive RFP pour collecter autant de cellules que possible.

Conservez les collections à moins 80 degrés Celsius ou, si le deuxième cycle de purification doit être effectué immédiatement, congelez les cryoflacons sur de la glace sèche pendant 10 minutes. Le deuxième tour de purification du VV modifié est effectué comme le premier en utilisant les cellules congelées du premier tour. Cependant, plus de six plaques positives à l’appel d’offres peuvent être sélectionnées pour chaque ligne positive à l’appel d’offres.

Répétez le processus de sélection jusqu’à ce que toutes les plaques formées à partir d’une plaque positive soient positives à la RFP, ce qui indique que la plaque est pure, ce qui peut prendre trois à cinq tours supplémentaires. Un jour à l’avance, préparez une plaque à six parois avec un demi-million de cellules CV-1 par puits. Le lendemain, décongelez la plaque purifiée congelée à 37 degrés Celsius pendant trois minutes.

Ensuite, faites tourbillonner vigoureusement la plaque pendant 30 secondes pour faire un lysat. Ajoutez tout le lysat, y compris les débris cellulaires, dans un puits de cellules CV-1 et incubez la plaque pendant trois jours. N’utilisez pas les cinq autres puits.

Inspectez les cellules quotidiennement au microscope. Lorsque plus de la moitié des cellules apparaissent cytopathiques, récoltez les cellules infectées. Idéalement, toutes les cellules devraient être cytopathiques.

À l’aide d’un grattoir cellulaire, recueillez les cellules dans un tube de 15 millilitres avec un milieu de culture. Ensuite, granulez les cellules à 300 g pendant trois minutes. Jetez le surnageant et procédez à l’utilisation de la PCR pour vérifier la modification du VV mutant, ou congelez la pastille cellulaire à moins 80 degrés Celsius pour le faire plus tard.

La méthode décrite améliore l’efficacité de recombinaison de plus de 100 fois par rapport aux protocoles conventionnels. Par exemple, le VV N1LG a été ciblé pour être modifié. Comme décrit, des plasmas exprimant Cas9 et un ARNg spécifique de N1L ont été co-transfectés dans les cellules CV-1 pour améliorer leur efficacité pour la recombinaison homologue.

Un jour après la transfection, la RFP a été exprimée dans les cellules CV-1. Ensuite, les cellules CV-1 ont été infectées par la totalité du lysat issu de la recombinaison homologue. Des plaques positives et négatives à la RFP ont toutes deux été observées dans les cellules CV-1.

En suivant le protocole de purification, un recombinant pur a été obtenu. Toutes les plaques après infection par le lysat cellulaire dérivé d’une plaque pure avec le virus mutant de la vaccine présentaient un signal RFP. La PCR a été utilisée pour vérifier la délétion du gène ciblé.

Le virus modifié a montré un signal positif pour la RFP, et aucun signal pour N1L, contrairement au témoin N1L intact. Tous étaient positifs pour le gène non ciblé A52R. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de fabriquer rapidement un nouveau vecteur du virus de la vaccine.

Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en 10 jours si elle est bien exécutée. Après son développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine des sciences biomédicales pour explorer de nouveaux vecteurs viraux dans le développement d’agents biologiques pour le traitement et la prévention du cancer et des maladies infectieuses.