Name: Une méthode efficace pour obtenir des cellules dédifférenciées Fat (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-07-15T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 11 s
Description: Découvrez une méthode de culture cellulaire efficace pour générer des cellules adipeuses dédifférenciées (DFAT) de haute qualité. Cette technique améliore la médecine régénérative et l'ingénierie tissulaire.

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Cette recherche a été soutenue en partie par le Programme de création de start-ups à partir de la recherche et de la technologie avancées (Programme START) de la Société japonaise pour la promotion de la science (ST261006IP, TM) et par le Programme pour la Fondation de recherche stratégique dans les universités privées (2014-2019) (S1411018, TM) du ministère de l’Éducation, des Sports, des Sciences et de la Technologie.

Des échantillons de graisse sous-cutanée humaine ont été obtenus chez des patients subissant une intervention chirurgicale dans les départements de chirurgie plastique, urologie, chirurgie pédiatrique et chirurgie orthopédique de Nihon University Hospital Itabashi (Tokyo, Japon). Les patients ont donné leur consentement éclairé écrit, et le Comité d&#39;éthique de la Faculté de médecine de l&#39;Université Nihon a approuvé l&#39;étude. 1. Préparation des tissus <ol><li> Amener l&#39;échantillon de tissu à partir de la salle d&#39;opération au laboratoire. </li><li> Laver 1-2 g de tissu adipeux avec 5 ml de PBS (-) à la température ambiante (RT) une fois, dans un tube de 50 ml, puis placer l&#39;échantillon dans un plat en plastique de 10 cm. </li></ol> 2. digestion à la collagénase <ol><li> Retirer l&#39;échantillon du PBS (-), puis ajouter 10 ml de solution stérile à 0,1% (p / v) de solution de collagénase (collagénase de type II), le récipient contenant l&#39;échantillon de tissu. </li><li> Émincer le tissu avec des ciseaux chirurgicaux pendant environ 15 min, jusqu&#39;à ce qu&#39;elle atteigne une purée se composentence. </li><li> Par la suite, la digestion du tissu haché dans 0,1% (p / v) d&#39;une solution de collagénase à 37 ° C pendant 30 min (60 min) dans un tube de 50 ml, en agitant doucement sur un agitateur. </li><li> Filtrer l&#39;échantillon digéré à travers un filtre de 100 um dans un tube de 50 ml. Ensuite, passer 10 ml de DCM (voir le tableau des matériaux) additionné de 2% de FBS à travers le filtre. </li></ol> 3. Cellule d&#39;isolement <ol><li> Centrifuger les cellules filtrées à 100 xg pendant 1 min à température ambiante. </li><li> A ce stade, la préparation 5 ml de DCM, supplémenté avec 2% de FBS dans un tube de 50 ml. </li><li> Ensuite, dessinez les cellules graisseuses flottantes en utilisant une pipette de 1000 et ajouter les cellules à un milieu contenant 50 ml de tube. </li><li> Par la suite, secouer le tube de 50 ml doucement pour mélanger le milieu DCM avec les cellules. </li><li> Ensuite, centrifuger le tube à 100 g pendant 1 min à température ambiante. </li><li> Jeter le milieu au fond du tube en utilisant une aiguille de 18 G et une seringue de 20 ml. </li><li> Ensuite, ajouter 10 ml de DCM supplemented FBS à 2% aux cellules recueillies. </li><li> Mélanger le DCM avec les cellules en agitant doucement le tube de 50 ml. </li><li> Centrifuger le tube à 100 g pendant 1 min à température ambiante. </li></ol> 4. Cellules Placage <ol><li> Ajouter 41 ml de DCM ou DMEM supplémenté avec 20% de FBS à 12,5 cm flacon. </li><li> Ensuite, en utilisant une pipette de 200 pi ajouter 40 ul de cellules adipeuses dans le ballon. </li><li> Ensuite, remplir le flacon avec du DCM ou DMEM supplémenté avec 20% de FBS. ÉTAPE CRITIQUE: À ce stade, faire en sorte que les cellules sont réparties dans tout le milieu. Contrôler visuellement les cellules détachées et ensuite garder le ballon sur le couvercle d&#39;une boîte de Pétri ronde pour le maintenir à plat. </li><li> Enfin, placer le ballon à l&#39; intérieur de l&#39;incubateur et à laisser non perturbée dans un incubateur à CO2 à 5% à 37 ° C pendant 7 jours. </li><li> Après une semaine d&#39;incubation, inverser le flacon et vérifier les cellules DFAT. Ensuite, évaluer DFAT génération cellulaire compétences comme décrit 10 depuis à ce stade fibroblcellules ast-like (cellules DFAT) sont situés dans des régions distinctes de cellules graisseuses. </li><li> Ajouter 5 ml de DCM ou du DMEM supplémenté avec 20% de FBS dans le ballon après l&#39;enlèvement du milieu de culture de la cellule précédente. Laisser les cellules DFAT à croître pendant une semaine après avoir changé le milieu. </li><li> L&#39;utilisation d&#39;un compteur de cellules, compter le nombre de cellules DFAT générées dans différentes conditions de culture cellulaire (DCM vs. DMEM). </li></ol>

<ol><li>Lanzoni, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concise+review%3A+clinical+programs+of+stem+cell+therapies+for+liver+and+pancreas%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Concise review: clinical programs of stem cell therapies for liver and pancreas.</a> Stem Cells. 31 (10), 2047-2060 (2013).</li>
<li>de Girolamo, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stem%2Fstromal+cells%3A+a+new+%22cells+as+drugs%22+paradigm.+Efficacy+and+critical+aspects+in+cell+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Pharm.+Des%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stem/stromal cells: a new "cells as drugs" paradigm. Efficacy and critical aspects in cell therapy.</a> Curr. Pharm. Des. 19 (13), 2459-2473 (2013).</li>
<li>Lindroos, B., Suuronen, R., Miettinen, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+potential+of+adipose+stem+cells+in+regenerative+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell.+Rev%22%5BJournal%5D)">The potential of adipose stem cells in regenerative medicine.</a> Stem Cell. Rev. 7 (2), 269-291 (2011).</li>
<li>Yan, J., Tie, G., Xu, T. Y., Cecchini, K., Messina, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stem+cells+as+a+treatment+for+peripheral+arterial+disease%3A+current+status+and+potential+impact+of+type+II+diabetes+on+their+therapeutic+efficacy%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell.+Rev%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stem cells as a treatment for peripheral arterial disease: current status and potential impact of type II diabetes on their therapeutic efficacy.</a> Stem Cell. Rev. 9 (3), 360-372 (2013).</li>
<li>Ringden, O., Keating, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stromal+cells+as+treatment+for+chronic+GVHD%5BTitle%5D)+AND+%22Bone+Marrow+Transplant%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stromal cells as treatment for chronic GVHD.</a> Bone Marrow Transplant. 46 (2), 163-164 (2011).</li>
<li>Matsumoto, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mature+adipocyte-derived+dedifferentiated+fat+cells+exhibit+multilineage+potential%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Mature adipocyte-derived dedifferentiated fat cells exhibit multilineage potential.</a> J. Cell. Physiol. 215 (1), 210-222 (2008).</li>
<li>Lessard, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+human+adipose+stem+cells+through+dedifferentiation+of+mature+adipocytes+in+ceiling+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Generation of human adipose stem cells through dedifferentiation of mature adipocytes in ceiling cultures.</a> J. Vis. Exp. (97), (2015).</li>
<li>Lessard, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+dedifferentiating+human+mature+adipocytes+from+the+visceral+and+subcutaneous+fat+compartments%3A+fibroblast-activation+protein+alpha+and+dipeptidyl+peptidase+4+as+major+components+of+matrix+remodeling%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Characterization of dedifferentiating human mature adipocytes from the visceral and subcutaneous fat compartments: fibroblast-activation protein alpha and dipeptidyl peptidase 4 as major components of matrix remodeling.</a> PLoS One. 10 (3), 0122065(2015).</li>
<li>Peng, X., et al. Phenotypic and Functional Properties of Porcine Dedifferentiated Fat Cells during the Long-Term Culture In Vitro. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPeng%2C+X+%22Biomed.+Res.+Int%22">Biomed. Res. Int</a>. 2015, 673651(2015).</li>
<li>Kono, S., Kazama, T., Kano, K., Harada, K., Uechi, M., Matsumoto, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenotypic+and+functional+properties+of+feline+dedifferentiated+fat+cells+and+adipose-derived+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Vet.+J%22%5BJournal%5D)">Phenotypic and functional properties of feline dedifferentiated fat cells and adipose-derived stem cells.</a> Vet. J. 199 (1), 88-96 (2014).</li>
<li>Bellin, M., Marchetto, M. C., Gage, F. H., Mummery, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+pluripotent+stem+cells%3A+the+new+patient%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Induced pluripotent stem cells: the new patient.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 13 (11), 713-726 (2012).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Adipocytes matures qui subissent en dédifférenciation in vitro, un processus connu sous le nom de la culture de plafond, peuvent revenir à un phénotype plus primitif et d&#39; acquérir des capacités prolifératives. Ces cellules sont appelées graisse comme dédifférenciées (DFAT) cellules. Le potentiel de différenciation multilignée DFAT des cellules a été évaluée. Analyse par cytométrie en flux et l&#39; analyse de l&#39; expression du gène a révélé que les cellules DFAT étaient très homogènes par rappo...

La thérapie cellulaire et l&#39; ingénierie tissulaire sont des sujets brûlants dans le domaine de la médecine régénérative 1-5. Bien que ces modalités thérapeutiques très prometteuses, plusieurs problèmes techniques entravent actuellement leur utilisation clinique. À cet égard, comme dans la génération de cellules iPS, toutes les thérapies d&#39;ingénierie tissulaire doivent produire des cellules libres de transduction de gènes externes afin de maintenir la sécurité des patients. En conséquence, nous avons été le premier groupe à produire avec succès des cellules DFAT humaines 6. Plusieurs autres groupes de recherche ont depuis adopté notre méthode pour générer des cellules DFAT d&#39;origine mammifère 7-9, soulignant en outre l&#39;utilité de notre modèle. Au cours de plusieurs études, nous avons constaté que la qualité du milieu de culture cellulaire peut être modifiée en ajustant la teneur du milieu cellulaire. Cette constatation a conduit à une augmentation du taux de production de cellules DFAT de réussite et une meilleure qualité de cellule; les deux facteurs critiquesgénérer efficacement des cellules pour les futurs essais cliniques. À cet égard, un meilleur milieu de culture DFAT (DCM, un support similaire à souches mésenchymateuses milieu cellulaire, qui contient de l&#39;insuline humaine recombinante, l&#39;albumine sérique, l&#39;acide L-glutamique, de plusieurs acides gras et de cholestérol) et un procédé pour DFAT génération de cellules et prolifération a été développé (plus d&#39;informations sur le contenu du DCM est disponible sur demande). En utilisant cette méthode cellules DFAT de haute qualité ont été obtenues avec la capacité de se différencier en différents types de cellules, y compris adipogène, osteogene et les cellules chondrogéniques. Au total, ce protocole de culture cellulaire validé améliore la qualité des cellules DFAT et peut être très utile pour améliorer les applications cliniques de la thérapie cellulaire et l&#39;ingénierie tissulaire.

<table><tbody><tr><td>CSTI303-MSC moyen&nbsp ;</td><td>CSTI</td><td>87-671</td><td>Ce milieu est défini comme DCM dans le texte</td></tr><tr><td>PBS(-)</td><td>Wako</td><td>166-23555</td><td>Il ne contient pas de Mg2+ et de Ca2+</td></tr><tr><td>DMEM milieu</td><td>Gibco</td><td>11965-092</td><td></td></tr><tr><td>Sérum fœtal bovin</td><td>Sigma</td><td>172012</td><td></td></tr><tr><td>Collagénase de type II</td><td>Sigma</td><td>C-6885</td><td></td></tr><tr><td>Ciseaux</td><td>Takasago Medical Industry Co., Ltd</td><td>TKZ-F2194-1</td><td></td></tr><tr><td>Shaker</td><td>TAITEC</td><td>Bioshaker V.BR-36</td><td></td></tr><tr><td>Falcon Cell Strainer 100 &mu ; m Jaune</td><td>CORNING LIFE SCIENCES&nbsp ;</td><td>DL 352360</td><td></td></tr><tr><td>Faucon 12,5 cm&sup2 ; Fiole de culture cellulaire rectangulaire à col incliné avec bouchon à vis ventilé bleu</td><td>CORNING LIFE SCIENCES&nbsp ;</td><td></td><td></td>353107</tr><tr><td>Aiguille 18 G</td><td>NIPRO</td><td>02-002</td><td></td></tr><tr><td>Seringue de 20 ml&nbsp ;</td><td>NIPRO</td><td>08-753</td><td></td></tr><tr><td>Compteur de socs série Z</td><td>BECKMAN COULTER</td><td>383550</td><td></td></tr></tbody></table>

une méthode efficace pour obtenir des cellules dédifférenciées fat

An Efficient Method to Obtain Dedifferentiated Fat Cells

L&#39;ingénierie tissulaire et la thérapie cellulaire sont très prometteurs cliniquement. À cet égard, des cellules pluripotentes, telles que des cellules souches mésenchymateuses (MSC) peuvent être utilisés en thérapeutique, dans un avenir proche, pour restaurer la fonction des organes endommagés. Néanmoins, plusieurs questions techniques, y compris la procédure très envahissante d&#39;isoler MSCs et l&#39;inefficacité entourant leur amplification, entravent actuellement l&#39;utilisation clinique potentielle de ces modalités thérapeutiques. Ici, nous introduisons une méthode très efficace pour la production de cellules graisseuses dédifférenciées (DFAT), les cellules MSC-like. Fait intéressant, les cellules peuvent être différenciées DFAT en plusieurs types cellulaires incluant adipogène, osteogene et les cellules chondrogéniques. Bien que d&#39;autres groupes ont déjà présenté différentes méthodes pour générer des cellules DFAT du tissu adipeux mature, notre méthode nous permet de produire des cellules DFAT plus efficacement. À cet égard, nous démontrons que le milieu de culture DFAT (DCM), supplémenté avec 20% de FBS,est plus efficace pour générer des cellules DFAT que DMEM, supplémenté avec 20% de FBS. En outre, les cellules DFAT produites par notre procédé de culture cellulaire peuvent être redifférenciés dans plusieurs types de tissus. En tant que tel, un modèle très intéressant et utile pour l&#39;étude de la dédifférenciation du tissu est présenté.

<html> Dans cette étude, la méthode et d&#39; outils pour DFAT génération de cellules a été améliorée (Figure 1). Notre méthode nous permet de générer des cellules DFAT utilisant à la fois du DCM et du milieu DMEM contenant 20% de FBS (figure 2A). En tant que tel, nous avons comparé l&#39;efficacité de DCM et DMEM dans la génération de cellules DFAT. À cet égard, le DCM amélioré DFAT la prolifération cellulaire par trois fois par rapport au DMEM, quel que...

Nous avons modifié les conditions de génération des cellules DFAT et fournissons ici des informations concernant l’utilisation d’un milieu de croissance amélioré pour la production de ces cellules.

Une méthode efficace pour obtenir des cellules dédifférenciées Fat

Tissue engineering and cell therapy hold great promise clinically. In this regard, multipotent cells, such as mesenchymal stem cells (MSCs), may be used ...

Le but général de cette nouvelle méthode de culture cellulaire est de produire des cellules adipeuses dédifférenciées avec une efficacité accrue. Notre méthode pourrait aider les chercheurs travaillant dans le domaine de la médecine régénérative à répondre à des questions clés concernant les différents processus impliqués dans la production de cellules adipeuses, ostéogéniques et chondrogéniques. Étant donné que l'avantage principal de notre protocole de culture cellulaire réside dans l'amélioration de la qualité des cellules DEFAT, il pourrait être appliqué dans un avenir proche pour optimiser les applications actuelles en thérapie cellulaire et en ingénierie tissulaire.Après avoir apporté l'échantillon de tissu adipeux sous-cutané du patient de la salle d'opération au laboratoire, peser le tissu et placer un échantillon d'un à deux grammes de tissu adipeux dans un tube de 15 millilitres. Ensuite, laver l'échantillon avec cinq millilitres de PBS, puis transférer l'échantillon dans une boîte en plastique de 10 centimètres. Éliminer le PBS.Ensuite, ajoutez 10 millilitres de collagénase stérile à 0,1 % poids par volume dans la boîte contenant l'échantillon. Puis, utilisez des ciseaux chirurgicaux pour hacher le tissu jusqu'à l'obtention d'une consistance purée. Transférez le tissu haché et la solution de collagénase dans un tube de centrifugation de 15 millilitres et effectuez une digestion à 37 degrés Celsius pendant 30 minutes, sous agitation à 60 tr/min.Après la digestion, filtrer l'échantillon digéré à travers un filtre de 100 microns dans un nouveau tube de 15 millilitres. Ensuite, faire passer 10 millilitres de milieu de culture DEFAT supplémenté avec 2 % de FBS à travers le filtre. Pour isoler les cellules adipeuses de la suspension cellulaire, centrifuger d'abord les cellules filtrées à 100 × g pendant une minute à température ambiante.Pendant la centrifugation, préparez cinq millilitres de DCM supplémenté avec 2 % de FBS dans un tube de 15 millilitres. Ensuite, utilisez une pipette de 1000 microlitres pour prélever les cellules adipeuses flottantes du tube centrifugé et ajoutez les cellules dans un tube de 15 millilitres contenant le milieu. Secouez doucement le tube pour mélanger le milieu DCM avec les cellules.Ensuite, centrifuger le tube à 100 × g pendant une minute à température ambiante. Après la centrifugation, utiliser une aiguille de calibre 18 et une seringue de 20 millilitres pour éliminer le milieu se trouvant au fond du tube. Puis ajouter 10 millilitres de DCM supplémenté avec 2 % de FBS aux cellules et mélanger en agitant doucement le tube.Centrifuger à nouveau les cellules à 100 ×g pendant une minute à température ambiante. Pour commencer l'ensemencement, ajouter 41 millilitres de DCM ou de DMEM supplémenté en 20 % de FBS dans un flacon de 12,5 centimètres. Puis utiliser une pipette de 200 microlitres pour prélever 40 microlitres de cellules adipeuses et les ajouter au flacon.Ensuite, remplir le flacon avec du DCM ou du DMEM supplémenté en 20 % de FCS. Il est essentiel que les cellules soient réparties uniformément dans le milieu. Placer le flacon sur le couvercle d'une boîte de Pétri ronde afin de le maintenir à plat.Enfin, placer le flacon dans un incubateur réglé à 5 % de dioxyde de carbone et à 37 degrés Celsius, et le laisser au repos pendant sept jours. Après une semaine d'incubation, retourner le flacon et vérifier la présence de cellules adipeuses dédifférenciées. Ensuite, aspirer le milieu, puis ajouter cinq millilitres de DCM ou de DMEM supplémenté avec 20 % de SBF dans le flacon.Laisser les cellules DEFAT se développer une semaine supplémentaire après le changement de milieu. Après une semaine, utiliser un compteur de cellules pour déterminer le nombre de cellules DEFAT générées dans diverses conditions de culture. Cette image montre des colonies de cellules DEFAT après 14 jours de culture dans le DMEM.Ici, les cellules DEFAT sont montrées après 14 jours de culture dans le milieu DCM. Dans chaque cas, l'échelle représente 200 microns. La prolifération des cellules DEFAT a été quantifiée à l'aide d'un compteur de cellules, et l'efficacité du milieu DCM par rapport au DMEM pour générer des cellules DEFAT a été comparée.Comme on le voit ici, une prolifération cellulaire accrue est observée avec l'utilisation du milieu de conditionnement des dérivés (DCM). Ici, des cellules humaines DEFAT, générées à l'aide du DCM, ont été cultivées pendant trois semaines dans les milieux d'induction appropriés afin d'évaluer les capacités de redifférenciation et de différenciation des cellules DEFAT. Les cellules se sont révélées positives pour la capacité ostéogénique par coloration à la phosphatase alcaline et par coloration au rouge d'alizarine S. Enfin, la capacité adipogénique a été démontrée par une coloration à l'Oil Red O.Il est très important de s'assurer que la digestion au collagénase et l'isolement des cellules adipeuses soient tous deux réalisés avec le plus grand soin afin de produire avec succès des cellules DEFAT de haute qualité. Grâce à ces efforts, notre méthode de culture cellulaire validée vise à faciliter les recherches actuelles et futures dans les domaines de la biologie du développement et de la médecine régénérative.

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Developmental Biology

Biologie du développement

Les adipocytes matures peuvent représenter une source abondante de cellules souches par dédifférenciation, ce qui conduit à une population homogène de cellules de type fibroblaste. La digestion par la collagénase est utilisée pour isoler les adipocytes matures de la graisse humaine. L’objectif de notre protocole est d’obtenir des cellules graisseuses multipotentes et dédifférenciées à partir d’adipocytes matures humains.

Génération de tissu adipeux humain cellules souches par dédifférenciation des adipocytes matures dans les cultures de plafond

La différenciation des adipocytes blancs et beiges de tissu adipeux progéniteurs vasculaire porte le potentiel d’amélioration métabolique dans l’obésité. Les auteurs décrivent des protocoles pour un CD34 + CD31 + isolation de cellules endothéliales de la graisse humaine ainsi qu’un subséquent in vitro de l’expansion et la différenciation en adipocytes blancs et beiges. Plusieurs applications en aval sont discutées.

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Isolement de sous-populations de cellules stromales adipogènes et fibro-inflammatoires à partir de dépôts adipeux intra-abdominaux murins

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Découvrez une méthode de culture cellulaire efficace pour générer des cellules adipeuses dédifférenciées (DFAT) de haute qualité. Cette technique améliore la médecine régénérative et l'ingénierie tissulaire.

Une méthode efficace pour obtenir des cellules dédifférenciées Fat

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