Une méthode efficace pour obtenir des cellules dédifférenciées Fat

L’objectif global de cette nouvelle méthode de culture cellulaire est de générer des cellules graisseuses dédifférenciées avec une plus grande efficacité. Notre méthode peut aider les chercheurs travaillant dans le domaine de la médecine régénérative à répondre à des questions clés sur les différents processus impliqués dans la production de cellules adipogènes, ostéogéniques et chondrogéniques. Étant donné que le principal avantage de notre protocole de culture cellulaire est qu’il améliore la qualité des cellules DEFAT, il pourrait être appliqué dans un avenir proche pour améliorer les applications actuelles en thérapie cellulaire et en ingénierie tissulaire.

Après avoir apporté l’échantillon de graisse sous-cutanée du patient au laboratoire depuis la salle d’opération, pesez le tissu et placez un échantillon d’un à deux grammes de tissu adipeux dans un tube de 15 millilitres. Ensuite, lavez l’échantillon avec cinq millilitres de PBS, puis transférez l’échantillon dans un plat en plastique de 10 centimètres. Retirez le PBS.

Ajoutez ensuite 10 millilitres de collagénase stérile à 0,1 % en poids par volume dans la boîte contenant l’échantillon. Ensuite, utilisez des ciseaux chirurgicaux pour hacher le tissu jusqu’à ce qu’il atteigne une consistance en purée. Transférez la solution de tissu haché et de collagénase dans un tube à centrifuger de 15 millilitres et digérez à 37 degrés Celsius pendant 30 minutes, en agitant à 60 tr/min.

Après la digestion, filtrez l’échantillon digéré à travers un filtre de 100 microns dans un tube frais de 15 millilitres. Ensuite, passez 10 millilitres de milieu de culture DEFAT complété par 2 %FBS à travers le filtre. Pour isoler les cellules graisseuses de la suspension cellulaire, centrifugez d’abord les cellules filtrées à 100 fois g pendant une minute à température ambiante.

Pendant la centrifugation, préparez cinq millilitres de DCM complétés par 2 % de FBS dans un tube de 15 millilitres. Ensuite, utilisez une pipette de 1000 microlitres pour aspirer les cellules de graisse flottantes du tube centrifugé et ajoutez les cellules dans un tube de 15 millilitres contenant du milieu. Secouez doucement le tube pour mélanger le milieu DCM avec les cellules.

Ensuite, centrifugez le tube à 100 fois g pendant une minute à température ambiante. Après la centrifugation, utilisez une aiguille de calibre 18 et une seringue de 20 millilitres pour prélever le fluide au fond du tube. Ajoutez ensuite 10 millilitres de DCM complété par 2 %FBS dans les cellules et mélangez en secouant doucement le tube.

Centrifugez à nouveau les cellules à 100 fois g pendant une minute à température ambiante. Pour commencer le placage, ajoutez 41 millilitres de DCM ou de DMEM complété par 20 % de FBS dans une fiole de 12,5 centimètres. Ensuite, à l’aide d’une pipette de 200 microlitres, prélevez 40 microlitres de cellules graisseuses et ajoutez-les dans le ballon.

Remplissez ensuite le ballon avec du DCM ou du DMEM complété par 20 % de FBS. Il est essentiel que les cellules soient réparties dans tout le milieu. Placez la fiole sur le couvercle d’une boîte de Pétri ronde pour la maintenir à plat.

Enfin, placez le flacon dans un incubateur réglé à 5 % de dioxyde de carbone et 37 degrés Celsius et laissez-le tranquille pendant sept jours. Après une semaine d’incubation, retournez le ballon et vérifiez s’il y a des cellules graisseuses dédifférenciées. Ensuite, aspirez le milieu, puis ajoutez cinq millilitres de DCM ou de DMEM complétés par 20 % de FBS dans le flacon.

Laissez les cellules DEFAT se développer pendant une semaine supplémentaire après avoir changé de milieu. Après une semaine, utilisez un compteur de cellules pour compter le nombre de cellules DEFAT générées dans diverses conditions de culture cellulaire. Cette image montre les colonies de cellules DEFAT après 14 jours de culture dans du DMEM.

Ici, les cellules DEFAT sont mises en évidence après 14 jours de culture en DCM. Dans chaque cas, la barre d’échelle représente 200 microns. La prolifération des cellules DEFAT a été quantifiée à l’aide d’un compteur de cellules, et l’efficacité du DCM et du DMEM dans la génération de cellules DEFAT a été comparée.

Comme on le voit ici, une prolifération cellulaire accrue est observée avec l’utilisation de la DCM. Ici, des cellules DEFAT humaines, générées à l’aide de DCM, ont été cultivées pendant trois semaines dans le milieu d’induction approprié afin d’évaluer les capacités de redifférenciation et de différenciation des cellules DEFAT. La capacité ostéogénique des cellules était positive par coloration à la phosphatase alcaline et par coloration au rouge d’alizarine S. Enfin, la capacité adipogénique a été démontrée avec une coloration au rouge d’huile O.

Il est très important de s’assurer que la collagénase avec rudiment et l’isolement des cellules graisseuses sont toutes deux effectuées avec le plus grand soin afin de générer avec succès des cellules DEFAT de haute qualité. Grâce à ces efforts, notre méthode de culture cellulaire validée vise à faciliter les efforts de recherche actuels et futurs dans les domaines de la biologie du développement et de la médecine régénérative.