Développement et maintenance d'une tumeur du patient Préclinique dérivé modèle de xénogreffe de l'enquête de Novel Anti-Cancer Therapies

L’objectif global de cette procédure de xénogreffe de tumeur sous-cutanée dérivée d’un patient est d’étudier l’efficacité de nouvelles thérapies, la découverte prédictive de biomarqueurs et les voies de résistance aux médicaments dans les tumeurs. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de l’oncologie : est-ce qu’un médicament particulier présente une activité contre un type de tumeur spécifique. Le principal avantage de cette technique est que les xénographes tumoraux dérivés de patients conservent l’hétérogénéité moléculaire, génétique et histologistique typique des tumeurs d’origine, ce qui rend le modèle plus pertinent sur le plan clinique.

Stacey Bagby, assistante de recherche professionnelle et technicienne vétérinaire certifiée de notre laboratoire, fera la démonstration de la procédure. Après avoir recueilli un à deux millilitres de sang dans un tube de séparation de cellules sanguines contenant du citrate de sodium, centrifugez les échantillons et transférez la couche de cellules mononucléées du sang périphérique dans un tube de micro-centrifugeuse de 1,5 millilitre. Remplissez le tube jusqu’en haut avec du PBS stérile.

Ensuite, faites tourner à nouveau les cellules. Suivi d’un lavage rapide avec un millilitre de PBS, en faisant attention de ne pas déranger la pastille PMBC. Ensuite, à l’aide d’une pipette, transférez le plasma du tube de prélèvement de cellules sanguines dans un flacon cryogénique stérile de 1,5 millilitre, et conservez le plasma et la pastille PBMC à moins 80 degrés Celsius.

Transférez le tissu tumoral humain dans l’animalerie dans une tasse stérile contenant un milieu complet et placez la tasse dans une hotte à flux laminaire. Dès que possible, après la récolte, transférez le tissu dans une boîte de découpe en plastique stérile dans une petite quantité de milieu de récupération. Ensuite, à l’aide de petits ciseaux et de pinces stérilisés en autoclave, coupez le tissu en morceaux d’environ trois par trois par trois millilitres et placez 10 à 12 morceaux dans un tube de micro-centrifugeuse de 1,5 millilitre stérilisé en autoclave contenant 300 microlitres de solution de mélange de protéines gélatineuses sur de la glace pour l’implantation.

Pour le stockage surgelé, transférez le nombre approprié de morceaux tumoraux dans un nouveau tube de micro-centrifugeuse de 1,5 millilitre et placez le flacon dans un doseur d’azote liquide. Ensuite, placez dans un congélateur à moins 80 degrés Celsius. Pour l’infixation formelle et l’enrobage de paraffine, placez trois petits morceaux de tumeur dans une tasse de formol de 10 millilitres à 10 % pendant 24 heures.

Une fois que les tissus sont transformés en blocs inclus dans la paraffine, transférez tous les morceaux de tissu restants dans un tube cryogénique. Ensuite, ajoutez un millilitre de milieu complet complété par 10 % de DMSO au tissu et conservez les tubes sur de la glace jusqu’à ce qu’ils puissent être transférés dans un récipient de congélation d’alcool isopropylique. Et mettez ce récipient dans un congélateur à moins 80 degrés Celsius.

Pour injecter le tissu tumoral, chargez les morceaux de tumeur stockés dans la solution de mélange de protéines gélatineuses dans des trocarts autoclavés de calibre 12, en veillant à ce que chaque morceau de tumeur soit complètement inséré dans le trocart. Ensuite, confirmez une absence de réponse au pincement des orteils chez une souris nue athymique âgée de six à huit semaines et transférez la souris sur un champ propre dans une hotte à flux laminaire stérile. Administrer la tumeur F0 par voie sous-cutanée dans la région dorsale du cou et de chaque côté du flanc de la souris, suivie de l’administration sous-cutanée d’une analgésie distale à l’un des sites d’injection de la tumeur sur le flanc.

Ensuite, replacez la souris dans sa cage avec surveillance jusqu’à ce qu’elle soit complètement rétablie. Surveillez la croissance et la santé des souris implantées au xénographie au moins une fois par semaine, en enregistrant la taille des tumeurs, la génération de la tumeur, la date d’injection de la tumeur et la santé des souris dans un système de suivi approprié. Lorsqu’une tumeur atteint une taille d’environ 1 500 à 2 000 millimètres cubes, utilisez des ciseaux autoclavés et des pinces pour exciser la tumeur et faire passer la tumeur F1 dans la prochaine génération de cinq animaux, comme nous venons de le démontrer, en prenant soin de collecter des échantillons de formol congelés et de tumeurs viables, comme démontré pour chaque tumeur.

Lorsque les souris restantes du groupe de tumeurs F0 présentent des tumeurs d’une taille d’environ 1 500 à 2 000 millimètres cubes, collectez ces tumeurs comme nous venons de le démontrer. Lorsque la génération de tumeur de stade F15 est atteinte, utilisez la première génération de morceaux de tumeur viables disponibles dans le stockage d’azote liquide pour la prochaine série d’injections de tumeurs. Lorsque la tumeur souhaitée est très grande, de 1 500 à 2 000 millimètres cubes, suivez les procédures ci-dessus pour collecter la tumeur afin de l’étendre à la quantité souhaitée de souris.

Administrez le médicament aux souris et pesez-les et mesurez-les deux fois par semaine. Randomisez les souris dans des groupes de traitement avec 10 tumeurs par groupe et un volume tumoral de groupe moyen de 100 à 300 millimètres cubes à quelques écarts-types les uns des autres. Ensuite, triez les souris dans les groupes appropriés pour le traitement.

L’hybridation in situ par fluorescence bicolore pour l’homme et la souris attrapée un seul ADN démontre que les cellules stromales humaines de la tumeur F0 sont remplacées par les cellules stromales de la souris dans la tumeur F1. Alors que tout le facteur de croissance hépatocytaire d’origine humaine dans la génération F0 est remplacé par le facteur de croissance hépatocytaire de souris dans la génération F1, le ligand du facteur de croissance de l’endothélium vasculaire est constitué à la fois de protéines humaines et de protéines de souris dans la génération F1. Le traitement de différentes générations d’une même tumeur ne modifie pas la réponse au traitement.

La résistance ou la sensibilité de la tumeur semblant être une souche tumorale plutôt qu’une génération de tumeur. De plus, la fréquence des mutations dans ces gènes couramment mutés est très similaire entre l’atlas du génome du cancer et la banque de xénographes tumoraux dérivés de patients colorectaux. Ce qui suggère que les mutations courantes observées dans la population de patients colorectaux sont bien représentées dans le modèle de xénotransplantation dérivée de patients colorectaux.

Une fois maîtrisée, cette technique peut être complétée en une à deux heures, si elle est correctement exécutée. Lors de la tentative de cette procédure, il est important d’avoir une équipe clinique soudée pour identifier et obtenir le consentement des patients atteints de cancer et pour l’ablation et la grossification du tissu tumoral. À la suite de cette procédure, d’autres méthodes, comme l’étude de composés anticancéreux en tant qu’agents uniques ou combinés, peuvent être effectuées pour répondre à des questions supplémentaires sur la viabilité de ces stratégies pour les patients atteints d’un type de tumeur particulier.

Après son développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de l’oncologie pour explorer de nouvelles thérapies anticancéreuses, l’hétérogénéité tumorale, les mécanismes de résistance aux traitements, la biologie des cellules souches cancéreuses et les interactions stromales tumorales. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de développer et de maintenir un modèle de xénographie tumorale dérivé d’un patient pour évaluer de nouvelles thérapies contre le cancer.