Name: Imitant la fonction des protéines de signalisation: Vers Artificial Signal Therapy transduction (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 24 s
Description: Découvrez la conception de transducteurs chimiques synthétiques pour activer une communication protéique artificielle entre le PDGF et la GST. Cette méthode spectroscopique ouvre la voie à de nouvelles stratégies thérapeutiques en transduction du signal.

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Cette recherche a été soutenue par la Fondation Minerva, l&#39;Organisation HFSP, et un Conseil de recherche Grant européenne (Starting Grant 338265).

1. Synthèse de la «Chemical Transducer» <ol><li> Préparatifs préliminaires <ol><li> Préparer 2 M d&#39;acétate de triéthylammonium (TEAA) un tampon en mélangeant 278 ml de triéthylamine avec 114 ml d&#39;acide acétique et 400 ml d&#39;eau ultrapure. Ajuster le pH à 7 et ajouter de l&#39;eau à un volume final de 1 L. Gardez-le dans une bouteille sombre. Remarque: Cette solution est stable pendant des années. </li><li> Préparer une solution d&#39;acide ascorbique à 5 mM en dissolvant 18 mg d&#39;acide ascorbique dans 20 ml d&#39;eau ultrapure. Utiliser une solution fraîche; la solution est stable pendant une journée. </li><li> Préparer un (II) / tris (benzyltriazolylmethyl) amine (TBTA) Solution mM de Cu 10 en dissolvant 25 mg de cuivre (II) pentahydrate de sulfate dans 10 ml d&#39;eau ultra-pure et 58 mg de TBTA dans 11 ml de diméthylsulfoxyde (DMSO). Mélanger les deux solutions. Gardez-le à la température ambiante et de le protéger de la lumière. </li></ol></li><li> procédure Conjugaison <ol><li> Dissoudre 100 nmoles de l&#39;oligonucléotide modifié (ODN-1) dans 80 uld&#39;eau ultrapure frais. Ajouter 20 ul de 2 M TEAA, pH = 7. Ajouter 80 ul d&#39;une solution fraîchement préparée d&#39;acide ascorbique (5 mM dans de l&#39;eau). </li><li> Dissoudre 1,5 umol (574,5 ug) d&#39;acide éthacrynique azido modifié dans 180 pi de DMSO et on ajoute à la solution. Dégazer la solution à l&#39;aide d&#39;argon pendant 60 sec, puis ajouter 40 ul de l &#39;(II) une solution de Cu / TBTA (10 mM dans 55% (v / v) de DMSO / eau) rapidement. </li><li> Purger à nouveau avec de l&#39;argon, fermer hermétiquement et agiter pendant une nuit. </li><li> Surveiller la progression de la réaction et on purifie le conjugué par RP-HPLC preparative (phase mobile: A) 5% d&#39;acétonitrile, 5% de TEAA, 90% d&#39;eau ultrapure; B) 65% Acétonitrile, 5% TEAA, 30% d&#39; eau ultrapure). 24 </li></ol></li></ol> 2. Contrôle de la TPS Activité par PDGF <ol><li> Préparatifs préliminaires <ol><li> Préparer 50 ml du tampon de dosage en mélangeant 33,9 ml de tampon phosphate salin (PBSx1) avec 16,1 ml d&#39;eau ultra-pure pour obtenir une concentration finale de phosphate et ad 8 mMd 23,8 mg de MgCl2 pour parvenir à une concentration finale de 5 mM. </li><li> Préparer une solution de réserve de GST M1-1 par dissolution de la protéine dans un tampon contenant 50 mM de Tris pH 7,5, NaCl 50 mM, dithiothréitol 1 mM (DTT) et 5 mM d&#39;acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA) à une concentration finale de 30 uM. Divisez cette solution dans de petites aliquotes et stocker à -80 ° C. Diluer fraîchement, conformément à la section 2.1.5.1, dans le tampon de dosage et de garder sur la glace. Remarque: La solution est stable pendant environ 5 heures, ou jusqu&#39;à ce qu&#39;il y a une réduction de l&#39;activité enzymatique. </li><li> La préparation du substrat selon les instructions suivantes: <ol><li> Dissolvez 10 mg de glutathion réduit (GSH) dans 325 pi d&#39;eau ultrapure à une concentration finale de mM solution 100. Diluer 21 pi de cette solution mère dans 979 pi de tampon de dosage pour une concentration finale de la solution de travail 2.1 mM. </li><li> Dissolvez 10 mg de 2,4-dinitrochlorobenzène (CDNB) dans 492 pi d&#39;ethanol à une concentration finale de mM solution 100. Diluer 43,2 ul de la solution mère dans 956,8 pi d&#39;un tampon de dosage pour une concentration finale de solution de travail 4,32 mM. </li></ol></li><li> Dans une plaque de 96 puits, mettre chaque substrat dans une ligne distincte (12 puits). Insérez au moins 60 pi dans chaque puits pour permettre le retrait rapide et facile de la solution. Couvrir la plaque avec une feuille d&#39;aluminium pour la protection de la lumière. </li><li> Préparer les solutions mères suivantes dans le tampon de dosage: <ol><li> GST M1-1 diluer 50 à une concentration finale de 0,6 uM du dimère. </li><li> Diluer le «capteur chimique» à une solution stock de 30 uM. </li><li> Diluer le PDGF à une concentration finale de 40 uM. </li><li> Diluer le PDGF aptamère à une concentration finale de 250 uM. </li></ol></li></ol></li><li> Mesurer l&#39;activité de la TPS en présence du «capteur chimique» et PDGF. <ol><li> Mettre en place une procédure expérimentale in le lecteur de plaques pour la mesure cinétique. <ol><li> Créer une nouvelle expérience comme un «protocole standard». </li><li> Appuyez sur «procédure» pour ouvrir la fenêtre des paramètres de procédure. </li><li> Dans la liste déroulante sur la face supérieure de la fenêtre, choisissez le type «384 de la plaque», selon le fabricant de la plaque. </li><li> Appuyez sur Lire &#39;sur le menu de gauche. </li><li> En ce qui concerne la méthode de détection choisissez &#39;Absorbance&#39;. </li><li> En ce qui concerne le type de lecture choisissez «Point final». </li><li> Écrire 340 nm dans la fenêtre de longueurs d&#39;onde. </li><li> Appuyez sur la «plaque pleine» en bas sur le côté supérieur droit et choisir le bien à mesurer. </li><li> de ok &#39;pour fermer la «Lecture» fenêtre Press. </li><li> Choisissez «start cinétique» sur le menu de gauche. </li><li> Faire le temps d&#39;exécution 10 min. </li><li> Sélectionnez l&#39;option d&#39;intervalle minimum. </li><li> Appuyez sur &quot;OK&quot; pour fermer la fenêtre cinétique. </li><li> Faites glisser le &#39;Lire&#39; ligne into la mesure cinétique. </li><li> Appuyez sur le bouton «valider», puis sur le bouton «OK». </li><li> Enregistrer l&#39;expérience. </li><li> Appuyez sur le bouton &#39;play&#39;. Une boîte de dialogue apparaîtra - appuyez sur le bouton «ok» que lorsque la mesure doit être démarré. </li></ol></li><li> Afin d&#39;effectuer l&#39;essai de triplicats préparer quatre échantillons contenant chacun 3,25 ul du «transducteur chimique» et 3,25 pi de GST M1-1. Ajouter à chaque échantillon à 0, 1,2, 2,4 ou 4,9 ul de PDGF et 123,5, 122,3, 121,1, 118,6 ou pi du tampon de dosage, respectivement. </li><li> Incuber la solution à température ambiante pendant 10 min. </li><li> Dans une plaque de 384 puits-transparent, insérer 40 pi d&#39;échantillon dans chaque puits. Insérer les seuls échantillons dans les puits impairs ou uniquement dans le même puits de la même ligne pour permettre l&#39;utilisation d&#39;un multi-pipetteur pour l&#39;addition du substrat. </li><li> En utilisant un pipetteur multi-canaux 12, ajouter rapidement 10 ul de chacun des til substrats qui ont été pré-préparés dans la plaque de 96 puits (section 2.1.4). Mélanger doucement et rapidement pour éviter les bulles. Insérez la plaque dans le lecteur et lancer la mesure cinétique. La cinétique de la TPS est assez rapide, essayez de réduire le temps entre l&#39;addition de substrat et le début de la mesure cinétique. </li></ol></li><li> TPS Activation Cycles / d&#39;inhibition médiée par le «capteur chimique». <ol><li> Afin de réaliser l&#39;expérience de triplicats, préparer 5 échantillons contenant chacun 84,5 pi de tampon de dosage, 3,25 ul de «capteur chimique», et 3,25 ul de TPS M1-1. Incuber à température ambiante pendant 3 min. </li><li> Ajouter 3,65 pi de tampon de dosage à l&#39;échantillon 1 et 3,65 ul de PDGF à des échantillons 2-5. Incuber à température ambiante pendant 3 min. </li><li> Ajouter 3.12 pi de tampon de dosage à des échantillons 1-2 et 3,12 ul de PDGF aptamère aux échantillons 3-5. Incuber à température ambiante pendant 3 min. </li><li> Ajouter 24,4 pi de tampon de dosage à des échantillons1-3 et 24,4 ul de PDGF à des échantillons 4-5. Incuber à température ambiante pendant 3 min. </li><li> Ajouter 7,8 pi de tampon de dosage à des échantillons 1-4 et 7,8 ul de PDGF aptamère à l&#39;échantillon 5. Incuber à température ambiante pendant 5 min. </li><li> Dans une plaque de 384 puits-transparent, insérer 40 pi d&#39;échantillon dans chaque puits. Insérez les échantillons uniquement dans le bizarre ou seulement dans les même puits dans la même ligne. </li><li> L&#39;utilisation d&#39;un multi-pipetteur 12 canaux, ajouter rapidement 10 ul de chaque substrat (pré-établi dans la plaque de 96 puits). Mélanger doucement et rapidement pour éviter les bulles. Insérez la plaque dans le lecteur et lancer la mesure cinétique. </li><li> Calculer le V 0 [MOD / min] dans chaque condition en soustrayant la DO mesurée à 340 nm à t = 0,5 min à partir de la DO mesurée à 340 nm à t = 1,5 min pour évaluer l&#39;activation / inhibition recyclabilité. 25 </li></ol></li><li> Évaluer la réponse en temps réel de la «sonde chimique» aux changements dans l&#39;environnement. <ol> &lt;li&gt; effet en temps réel de plus PDGF <ol><li> Mettre en place une procédure expérimentale dans le lecteur de plaques pour la mesure cinétique. </li><li> Répétez les étapes 2.2.1.1-2.2.1.10. </li><li> Prenez le temps d&#39;exécution 3,5 min. </li><li> Sélectionnez l&#39;option d&#39;intervalle minimum. </li><li> Appuyez sur &quot;OK&quot; pour fermer la fenêtre cinétique. </li><li> Faites glisser la ligne «Lire» dans la mesure cinétique. </li><li> Choisissez Plate Out / In sur le menu de gauche. </li><li> Choisissez l&#39;option &#39;étaler (pas de dialogue). </li><li> Choisissez l&#39;option «Retard» sur le menu de gauche et entrez 30 sec. </li><li> Choisissez Plate Out / In sur le menu de gauche. </li><li> Choisissez l&#39;option &#39;plaque (pas de dialogue). </li><li> Créer une deuxième mesure cinétique en répétant les étapes 2.2.1.4 - 2.2.1.14, mais dans la section 2.2.1.11 régler la cinétique de 25 min au lieu de 10 min. </li><li> Appuyez sur le bouton «valider», puis sur le bouton «OK». </li><li> Enregistrer l&#39;expérience. </li><li> Appuyez sur le «plabouton y &#39;. Une boîte de dialogue apparaîtra - appuyez sur le bouton «ok» que lorsque la mesure doit être démarré. </li><li> Préparer deux échantillons en mélangeant 1 pi de TPS M1-1 et 1 pl de la «capteur chimique» dans 38 pi de tampon de dosage. Insérez les échantillons dans deux puits d&#39;une plaque de 384 puits-transparent, laissant un puits vide entre ces deux puits. </li><li> L&#39;utilisation d&#39;un multi-pipetteur 12 canaux, ajouter rapidement 10 pi de chaque substrat, mélanger délicatement et rapidement pour éviter les bulles, insérer la plaque dans le lecteur et lancer la mesure cinétique. </li><li> Lorsque la plaque ouvre (après 3,5 min), ajouter rapidement 1,125 ul de PDGF à l&#39; un des puits, mélanger doucement, et laisser la plaque fermer pour les mesures cinétiques restantes. </li></ol></li><li> effet en temps réel de l&#39;ajout de l&#39;aptamère PDGF <ol><li> Répétez les étapes 2.4.1.1-2.4.1.15. </li><li> Préparer deux échantillons en mélangeant 1 pi de TPS M1-1, 1 pl de la &#39;transducteur chimique », et 1,125 ul de PDGF dans 36,9 pi de tampon de dosage. Insérez les échantillons dans deux puits d&#39;une plaque de 384 puits-transparent, laissant un puits vide entre ces deux puits. </li><li> L&#39;utilisation d&#39;un multi-pipetteur 12 canaux, ajouter rapidement 10 pi de chaque substrat, mélanger délicatement et rapidement pour éviter les bulles, insérer la plaque dans le lecteur, et commencer la mesure cinétique. </li><li> Lorsque la plaque ouvre (après 1,5 min), ajouter rapidement 1,2 ul de PDGF aptamère à l&#39; un des puits, mélanger doucement et laisser la plaque fermer pour les mesures cinétiques restantes. </li></ol></li></ol></li><li> Mesurer JS-K Promédicament d&#39;activation par GST en présence du «transducteur chimique» et PDGF. <ol><li> Mettre en place une procédure expérimentale dans le lecteur de plaques pour la mesure cinétique. <ol><li> Créer une nouvelle expérience comme un «protocole standard». </li><li> Appuyez sur «procédure» pour ouvrir la fenêtre des paramètres de procédure.</li><li> Dans la liste déroulante sur la face supérieure de la fenêtre, sélectionnez le type &#39;384 de la plaque », selon le fabricant de la plaque. </li><li> Appuyez sur Lire &#39;sur le menu de gauche. </li><li> En ce qui concerne la méthode de détection a choisi &#39;Absorbance&#39;. </li><li> En ce qui concerne le type de lecture choisissez «Point final». </li><li> Écrire 305 nm dans la fenêtre de longueurs d&#39;onde. </li><li> Appuyez sur le bouton «plaque pleine» sur le côté supérieur droit et choisir le bien à mesurer. </li><li> de ok &#39;pour fermer la «Lecture» fenêtre Press. </li><li> Choisissez «start cinétique» sur le menu de gauche. </li><li> Faire le temps d&#39;exécution 10 min. </li><li> Sélectionnez l&#39;option d&#39;intervalle minimum. </li><li> Appuyez sur &quot;OK&quot; pour fermer la fenêtre cinétique. </li><li> Faites glisser la ligne «Lire» dans la mesure cinétique. </li><li> Appuyez sur le bouton «valider», puis sur le bouton «OK». </li><li> Enregistrer l&#39;expérience. </li><li> Appuyez sur le bouton &#39;play&#39;. Une bo dialoguex apparaîtra - appuyez sur le bouton «ok» que lorsque la mesure doit être démarré. </li></ol></li><li> Pour la production de NO mesures utilisent un kit calorimétrique nitrite / nitrate. Dans une plaque de 96 puits d&#39;insérer 50 ul de tampon d&#39;essai dans une rangée, 70 pl de Griess I réactif dans une deuxième rangée, et 70 pi de réactif de Griess II dans une troisième rangée. </li><li> Afin d&#39;effectuer l&#39;essai de triplicats préparer quatre échantillons contenant chacun 4,8 pi de «capteur chimique. Pour échantillonner 1, ajouter 155,2 pi de tampon de dosage; échantillonner 2, ajouter 3,2 pi de GST-M1-1 et 152 pi de tampon de dosage; à l&#39;échantillon 3, ajouter 9,6 pi de PDGF et 145,6 pi de tampon de dosage; et à l&#39;échantillon 4, ajouter 3,2 pi de GST-M1-1, 9,6 pi de PDGF, et 142,4 pi de tampon de dosage. </li><li> Incuber la solution à température ambiante pendant 10 min. </li><li> Dans une plaque de 384 puits-transparent, insérez 50 ul d&#39;échantillon dans chaque puits. Insérez les échantillons uniquement dans le bizarre ou seulement dans lemême les puits de la même ligne pour permettre l&#39;utilisation d&#39;un multi-pipetteur pour l&#39;addition du substrat. </li><li> Ajouter 0,54 pi de JS-K (5 mM dans du DMSO) à chaque puits. </li><li> L&#39;utilisation d&#39;un multi-pipetteur 12 canaux, ajouter rapidement 10 ul de la solution GSH (pré-préparée dans la plaque de 96 puits), mélanger doucement et rapidement pour éviter les bulles. Insérez la plaque dans le lecteur et lancer la mesure cinétique. </li><li> Immédiatement après la mesure cinétique, à l&#39;aide d&#39;un multi-pipetteur 12 canaux, prendre 50 ul de chaque échantillon dans la rangée de tampon de dosage dans la plaque de 96 puits pré-préparés et ajouter rapidement à ce 50 pi de réactif de Griess I et 50 pi de réactif Griess II. Incuber tout en protégeant de la lumière pendant 10 min à température ambiante et mesurer l&#39;absorbance à 550 nm. Note: Le tampon de dosage et les réactifs volumes sont dépendants du protocole de la trousse. </li></ol></li></ol>

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<li>Nissinkorn, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensing+Protein+Surfaces+with+Targeted+Fluorescent+Receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Eur.+J%22%5BJournal%5D)">Sensing Protein Surfaces with Targeted Fluorescent Receptors.</a> Chem. Eur. J. 21, 15981-15987 (2015).</li>
<li>Huber, C. G., Oefner, P. J., Bonn, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-Resolution+Liquid+Chromatography+of+Oligonucleotides+on+Nonporous+Alkylated+Styrene-Divinylbenzene+Copolymers%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">High-Resolution Liquid Chromatography of Oligonucleotides on Nonporous Alkylated Styrene-Divinylbenzene Copolymers.</a> Anal. Biochem. 212, 351-358 (1993).</li>
<li>Lyon, R. P., Hill, J. J., Atkins, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+class+of+bivalent+glutathione+S-transferase+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Novel class of bivalent glutathione S-transferase inhibitors.</a> Biochemistry. 42, 10418-10428 (2003).</li>
<li>Battle, C., Chu, X., Jayawickramarajah, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oligonucleotide-based+systems+for+input-controlled+and+non-covalently+regulated+protein+binding%5BTitle%5D)+AND+%22Supramol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Oligonucleotide-based systems for input-controlled and non-covalently regulated protein binding.</a> Supramol. Chem. , 1-16 (2013).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Nous avons présenté une méthode de conception et de test d’un « transducteur chimique » capable d’induire une communication artificielle entre deux protéines naturellement non apparentées, GST et PDGF, sans modifier les protéines natives. Les communications non naturelles GST-PDGF ont pu être détectées en temps réel à l’aide de tests enzymatiques qui suivent les changements dans l’activité de GST en présence du « transducteur chimique » et en augmentant les concentrations de PDGF. En plus de détecter l’activation de la G...

Les voies de transduction du signal jouent un rôle important dans pratiquement tous les processus cellulaire et permettent à la cellule de répondre rapidement à des signaux environnementaux. 1 Ces voies sont souvent déclenchées par la liaison d&#39;une molécule de signalisation à un récepteur extracellulaire, ce qui se traduit par l&#39; activation des enzymes intracellulaires. L&#39;amplification et la propagation de ce signal dans la cellule est médié par la fonction des protéines qui forment un réseau d&#39;interactions protéine-protéine dans lequel les enzymes sont activées de manière réversible avec une spécificité élevée de signalisation. Parce que la dysrégulation de ces réseaux conduit souvent au développement du cancer, il y a eu beaucoup d&#39; intérêt pour l&#39; établissement d&#39;une «thérapie de signal de transduction du cancer &#39;, 2 dans lequel les médicaments sont conçus pour perturber les voies de signalisation malignes. Nous avons récemment proposé une approche alternative pour signaler la thérapie de transduction qui repose sur la capacité des médicaments pour générer anormales des voies de transduction du signal. <sup&gt; 3 En particulier, nous pensons que par la conception d&#39; agents synthétiques qui imitent la fonction des protéines de signalisation, il serait possible de moduler la fonction de la cellule indirectement. Par exemple, ces réseaux artificiels peuvent permettre à des biomarqueurs protéiques pour activer les enzymes qui clivent promédicaments. En variante, ces mimétiques de protéines de signalisation pourraient être en mesure d&#39;activer contre nature des voies de signalisation cellulaire, entraînant des effets thérapeutiques. Pour démontrer la faisabilité de cette approche, nous avons récemment créé un «capteur chimique» synthétique 4 qui permet le facteur de croissance dérivé des plaquettes (PDGF) pour déclencher le clivage d&#39;un promédicament anticancéreux en activant le glutathion-S-transférase (GST), qui est pas son partenaire de liaison naturel. La structure de ce «transducteur» se compose d&#39;un anti-PDGF ADN aptamère qui a été modifié avec un inhibiteur de la TPS bivalent. Par conséquent, cet agent synthétique appartient à une famille de molécules ayant des sites de liaison àprotéines différentes, telles que 5-7 inducteurs chimiques de dimérisation (CID) , 8-10 et aussi pour le groupe de protéines de liants à base de conjugués de molécules d&#39; oligonucléotides synthétiques. 21/11 Les principes généraux sous-jacents à la conception de tels systèmes sont décrits ici et des protocoles détaillés pour la synthèse et le test du fonctionnement de ce «transducteur» avec des dosages enzymatiques classiques sont fournis. Ce travail est destiné à faciliter le développement de «transducteurs» supplémentaires de cette classe, qui peut être utilisé pour la médiation intracellulaire communication protéine-protéine et, par conséquent, pour induire artificiels voies de signalisation cellulaire. La figure 1 décrit schématiquement les principes de fonctionnement des transducteurs «chimiques» synthétiques non naturels qui peuvent médier des communications protéine-protéine. Dans cette illustration, un «transducteur chimique», qui intègre des liants synthétiques pour la proteins I et II (liants I et II), permet la protéine II pour déclencher l&#39;activité catalytique de la protéine I, qui ne fait pas son partenaire de liaison naturel. En l&#39;absence de la protéine II, le transducteur se lie au site catalytique de l&#39;enzyme (protéine I) et inhibe son activité (figure 1, l&#39; état ii). La liaison du «transducteur» à la protéine II, cependant, favorise les interactions entre le liant I et la surface de la protéine II (figure 1, l&#39; état iii), ce qui réduit son affinité envers la protéine I. En conséquence, la concentration efficace du &#39; transducteur libre »dans la solution est réduite, ce qui conduit à la dissociation de la protéine de transduction complexe I et à la réactivation de la protéine I (figure 1, l&#39; état iv). Pris ensemble, ces étapes souligner trois principes fondamentaux qui sous-tendent la conception des «transducteurs» efficaces: (1) un «transducteur» devrait avoir un liant spécifique pour chacune des cibles protéiques, (2) l&#39;betwe d&#39;interactionen liant II et la protéine II devrait être plus forte que l&#39;interaction entre le liant I et la protéine I, et (3) liant je dois être capable d&#39;interagir avec la surface de la protéine II. Ce dernier principe ne requiert pas nécessairement que liant moi seul aurait une grande affinité et sélectivité pour la protéine II. Au lieu de cela, elle est basée sur nos études récentes qui montrent que l&#39; introduction d&#39; une molécule synthétique à proximité d&#39;une protéine est de nature à favoriser les interactions entre cette molécule et la surface de la protéine 19,22,23. <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/54396/54396fig1.jpg" /> Figure 1:. Utilisation des principes de «transducteurs chimiques» Lorsque le «capteur chimique» est ajouté à une protéine active I (état i), il se lie à son site actif par le biais de liant I et inhibe son activité (état ii). En présence de la protéine II, cependant, la non liés &quot;chimique transducer &#39;interagit avec la protéine II liant à travers II, qui favorise les interactions entre le liant I et la surface de la protéine II. Ce liant induit I-protéine interaction II réduit la concentration efficace de liant I, ce qui conduit à la dissociation de la «protéine de transducer&#39; complexe I et de la protéine I réactivation (état iv). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54396/54396fig1large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure .</a>

<table><tbody><tr><td>1-chloro-2,4-dinitrobenzène</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>237329</td><td></td></tr><tr><td>Acide acétique</td><td>Bio Lab</td><td>01070521</td><td></td></tr><tr><td>Acétnitrile</td><td>J.T.Baker</td><td>9017-03</td><td></td></tr><tr><td>Acide ascorbique</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4544</td><td></td></tr><tr><td>Sulfate de cuivre(II) pentahydraté</td><td>Merck-Millipore</td><td>102790</td><td></td></tr><tr><td>Diméthylsulfoxyde</td><td>Merck-Millipore</td><td>802912</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline</td><td>Biological Industries</td><td>02-023-5A</td><td></td></tr><tr><td>Acide éthacrynique</td><td>Tokyo Chemical Industry Co. Ltd</td><td>E0526</td><td></td></tr><tr><td>Glutathion-s-transférase M1-1</td><td>Israel Structural Proteomics Center (Weizmann Institute of Science, Rehovot, Israël)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>JS-K</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>J4137</td><td></td></tr><tr><td>L-glutathion réduit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G4251</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure de magnésium</td><td>J.T.Baker</td><td>0162</td><td></td></tr><tr><td>nitrate/nitrite kit de dosage colorimétrique</td><td>Cayman Chemical</td><td>780001</td><td></td></tr><tr><td>Oligonucléotides</td><td>W. M. Keck Fondation Biotechnologie à l’Université</td><td></td> de Yale <td>commande personnalisée</td></tr><tr><td>PDGF-BB</td><td>Centre de Protéomique Structurale d’Israël (Weizmann Institute of Science, Rehovot, Israël)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TBTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>678937</td><td></td></tr><tr><td>Triethylamine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T0886</td><td></td></tr><tr><td>Colonne de dessalage</td><td>GE Healthcare</td><td>illustra MicroSpin G-25 Colonnes</td><td></td></tr><tr><td>HPLC</td><td>Waters&nbsp ;</td>Module <td></td><td>de séparation 2695</td></tr><tr><td>Colonne HPLC</td><td>Waters</td><td>XBridgeTM OST C18 colonne (2.5 &mu ; M, 4,6 mm & temps ; 50 mm)</td><td></td></tr><tr><td>Colonne HPLC</td><td>Waters</td><td>XBridgeTM OST C18 (2,5 pouces &mu ; M, 10 mm & temps ; 50 mm)</td><td></td></tr><tr><td>Lecteur de plaques</td><td>BioTek</td><td>synergy H4 hybrid</td><td></td></tr></tbody></table>

imitant la fonction des protéines de signalisation: vers artificial signal therapy transduction

Mimicking the Function of Signaling Proteins: Toward Artificial Signal Transduction Therapy

Les voies de transduction du signal, qui contrôlent la réponse des cellules à divers signaux environnementaux, sont médiées par la fonction des protéines de signalisation qui interagissent les unes avec les autres et s’activent mutuellement avec une spécificité élevée. Des agents synthétiques qui imitent la fonction de ces protéines pourraient donc être utilisés pour générer des étapes de transduction de signal non naturelles et, par conséquent, modifier la fonction de la cellule. Nous présentons des lignes directrices pour la conception de « transducteurs chimiques » capables d’induire une communication artificielle entre les protéines natives. De plus, nous présentons des protocoles détaillés pour synthétiser et tester un « transducteur » spécifique, qui peut induire la communication entre deux protéines non apparentées : le facteur de croissance dérivé des plaquettes (PDGF) et la glutathion-S-transférase (GST). La manière dont cette communication non naturelle PDGF-GST pourrait être utilisée pour contrôler le clivage d’un promédicament anticancéreux est également présentée, indiquant le potentiel d’utilisation de tels systèmes dans la « thérapie de transduction de signal artificiel ». Ce travail vise à faciliter le développement de « transducteurs » supplémentaires de cette classe, qui peuvent être utilisés pour médier la communication protéine-protéine intracellulaire et, par conséquent, pour induire des voies de signalisation cellulaire artificielles.

La conception, la synthèse et le mécanisme d&#39;action d&#39;un «capteur chimique» qui peut induire la communication artificielle entre PDGF et la TPS sont présentés dans la figure 2. La structure du «transducteur» intègre un aptamère PDGF ADN et un amide bis-éthacrynique (Bea ), qui est un inhibiteur connu de la GST (figure 2a). 19 Ces liants permettent le «transducteur» pour se lier à la fois le PDGF et GST avec des affinités différentes, à...

Nous présentons des lignes directrices pour le développement de 'transducteurs chimiques' synthétiques capables d’induire la communication entre des protéines naturellement non apparentées. De plus, des protocoles détaillés sont présentés pour synthétiser et tester un « transducteur » spécifique qui permet à un facteur de croissance d’activer une enzyme détoxifiante et, par conséquent, de réguler le clivage d’un promédicament anticancéreux.

Imitant la fonction des protéines de signalisation: Vers Artificial Signal Therapy transduction

Signal transduction pathways, which control the response of cells to various environmental signals, are mediated by the function of signaling proteins ...

L'objectif général de cette expérience est de suivre spectroscopiquement la communication artificielle entre deux protéines induite par un transducteur chimique synthétique. Cela démontrera la possibilité de développer des analogues synthétiques de protéines de signalisation capables d'effectuer des voies de transduction de signal inexistantes dans la nature. La capacité de suivre la communication artificielle entre protéines à l'aide d'un spectrophotomètre courant pourrait aider à concevoir et améliorer la fonction de transducteurs chimiques artificiels, nous rapprochant ainsi d'une thérapie de transduction de signal artificielle.Le transducteur chimique est composé d'un aptamère de facteur de croissance dérivé des plaquettes, ou PDGF, d'un inhibiteur bivalent de la GST, l'amide d'éthacrynique, d'un fluorophore et d'un inhibiteur de fluorescence. La synthèse du transducteur chimique ne sera pas démontrée dans cette vidéo.Mais est décrit dans le protocole textuel. Les principes de fonctionnement du transducteur chimique sont illustrés ici. Le transducteur chimique inhibe l'activité enzymatique de la GST lorsque les deux groupes EA se lient aux sites actifs de l'enzyme.L'ajout de PDGF conduit à la formation du complexe chimiotransducteur de PDGF. Ce dernier perturbe l'interaction entre le chimiotransducteur et GST, restaurant ainsi l'activité enzymatique de GST. L'ajout ultérieur d'un aptamère de PDGF non modifié libère le chimiotransducteur et lui permet de réinhiber l'enzyme.Avant de commencer les expériences visant à examiner le contrôle de l'activité de la GST par le PDGF, mettez en place un protocole expérimental dans le lecteur de plaques pour la mesure cinétique. Créez une nouvelle expérience selon un protocole standard. Sélectionnez Procédure pour ouvrir la fenêtre de paramétrage de la procédure.Dans la liste déroulante située en haut de la fenêtre, sélectionnez le type de plaque 384 en fonction du fabricant de la plaque. Sélectionnez Lecture dans le menu de gauche. Choisissez Absorbance comme méthode de détection.Et point final pour le type de lecture. Dans la fenêtre Longueur d'onde, saisissez 340 nanomètres. Sélectionnez Plaque complète et choisissez les puits à mesurer.Ensuite, cliquez sur OK pour fermer la fenêtre de lecture. Dans le menu de gauche, sélectionnez Démarrer la cinétique. Réglez la durée d'exécution sur 10 minutes.Sélectionnez l'option Intervalles minimums. Ensuite, cliquez sur OK pour fermer la fenêtre Cinétique. Faites glisser la ligne de lecture dans la mesure cinétique.Sélectionnez le bouton Valider, suivi du bouton OK. Enregistrez l'expérience. Sélectionnez le bouton Lecture.Une boîte de dialogue apparaîtra, mais ne cliquez pas sur le bouton OK avant d'être prêt à démarrer la mesure cinétique. Une fois le lecteur de plaques configuré, l'étape suivante consiste à préparer les échantillons pour mesurer l'activité de la GST en présence du transducteur chimique et du PDGF. Afin de tester quatre concentrations de PDGF en triplicata, préparez quatre échantillons, chacun contenant 3,25 microlitres de transducteur chimique et 3,25 microlitres de GST M-1.Ajouter à chaque échantillon respectivement zéro, 1,2, 2,4 ou 4,9 microlitres de PDGF. Ensuite, ajouter à chaque échantillon le volume approprié de tampon de dosage afin d'obtenir un volume total de 130 microlitres. Incuber les échantillons à température ambiante pendant 10 minutes.Après 10 minutes, transférez 40 microlitres de chaque échantillon dans les puits d'une plaque transparente à 384 puits. Transférez chacun des quatre échantillons uniquement vers les puits impairs ou pairs de la même rangée, afin de permettre l'utilisation d'une pipette multipuits pour l'ajout du substrat.Ensuite, utilisez un pipeteur multipipette à 12 canaux pour ajouter rapidement à chaque échantillon 10 microlitres de chaque substrat préparé au préalable dans une plaque 96 puits. Mélangez rapidement mais délicatement pour éviter la formation de bulles. Insérez immédiatement la plaque dans le lecteur de plaques et démarrez la mesure cinétique en sélectionnant le bouton OK dans la boîte de dialogue.Pour examiner les cycles d'inhibition de l'activation de la GST médiés par le transducteur chimique, préparez cinq échantillons, chacun contenant 84,5 microlitres de tampon de dosage, 3,25 microlitres de transducteur chimique et 3,25 microlitres de GST M1-1. Incubez à température ambiante pendant trois minutes.Ajouter 3,65 microlitres de tampon de dosage à l'échantillon un, et 3,65 microlitres de PDGF aux échantillons deux, trois, quatre et cinq. Incuber à température ambiante pendant trois minutes. Ajouter 3,12 microlitres de tampon de dosage aux échantillons un et deux, et 3,12 microlitres d'aptamère de PDGF aux échantillons trois, quatre et cinq.Incuber à température ambiante pendant trois minutes. Ajouter 24,4 microlitres de tampon de dosage aux échantillons un, deux et trois. Et 24,4 microlitres de PDGF aux échantillons quatre et cinq.Incuber à température ambiante pendant trois minutes. Ajouter 7,8 µL de tampon de dosage aux échantillons un à quatre, et 7,8 µL d'aptamère PDGF à l'échantillon cinq. Incuber à température ambiante pendant cinq minutes.Transférez les échantillons dans une plaque transparente de 384 puits. Pour réaliser l'expérience en triplicata et ajouter rapidement le substrat aux échantillons, insérez la plaque dans le lecteur et démarrez la mesure cinétique.Pour commencer ce dosage, configurez une procédure expérimentale dans le lecteur de plaques pour une mesure cinétique, comme décrit dans le texte du protocole. Préparez deux échantillons dans deux puits d'une plaque transparente de 384 puits. Pour chaque puits, mélangez un microlitre de GST M1-1 et un microlitre du transducteur chimique dans 38 microlitres de tampon de dosage.Laisser un puits vide entre les deux puits. À l’aide d’une pipette multipuits 12 canaux, ajouter rapidement 10 microlitres de substrat dans chaque puits. Puis mélanger doucement et rapidement pour éviter les bulles.Insérez immédiatement la plaque dans le lecteur et démarrez la mesure cinétique. Lorsque le lecteur de plaque s'ouvre après 3,5 minutes, ajoutez rapidement 1,125 microlitres de PDGF dans l'un des puits, mélangez délicatement, puis laissez la plaque réintégrer le lecteur pour les mesures cinétiques restantes. Avant de préparer les échantillons pour cette expérience, configurez une procédure expérimentale dans le lecteur de plaque pour la mesure cinétique, comme décrit dans le texte du protocole.Un kit colorimétrique nitrite/nitrate sera utilisé pour mesurer la production d'oxyde nitrique. Dans une plaque de 96 puits, distribuez 50 microlitres de tampon d'essai par puits dans la première rangée. Ajoutez 70 microlitres de réactif Griess Un par puits dans la deuxième rangée.Et 70 microlitres du réactif Griess deux par puits dans la troisième rangée. Préparez quatre échantillons, chacun contenant 4,8 microlitres du transducteur chimique. Pour l'échantillon un, ajoutez 155,2 microlitres de tampon de dosage.Pour l'échantillon deux, ajouter 3,2 µL de GST M1-1 et 152 µL de tampon de dosage. Pour l'échantillon trois, ajouter 9,6 µL de PDGF et 145,6 µL de tampon de dosage. Et pour l'échantillon quatre, ajouter 3,2 µL de GST M1-1, 9,6 µL de PDGF et 142,4 µL de tampon de dosage.Incuber les échantillons à température ambiante pendant 10 minutes. Distribuer 50 microlitres d'échantillon par puits dans une plaque transparente à 384 puits afin d'effectuer l'expérience en triplets. Distribuer les échantillons uniquement dans les puits impairs ou pairs d'une même ligne afin de permettre l'utilisation d'une pipette multipuits pour l'ajout du substrat.Ajouter 0,54 microlitre de prodrogue JS-K à chaque échantillon. Ajouter rapidement à chaque échantillon 10 microlitres de solution de glutathion et mélanger doucement et rapidement pour éviter les bulles. Insérer la plaque dans le lecteur et démarrer la mesure cinétique.Immédiatement après la mesure cinétique, transférez 50 microlitres de chaque échantillon dans chaque puits de la première rangée de la plaque 96 puits contenant le tampon de dosage. Ensuite, transférez 50 microlitres de chaque puits de la deuxième rangée de la plaque dans les puits de la première rangée de la plaque. Et 50 microlitres par puits de la troisième rangée de la plaque vers les puits de la première rangée de la plaque.Incuber en protégeant de la lumière pendant 10 minutes à température ambiante, avant de mesurer l'absorbance à 550 nanomètres. La mesure de l'activité de la GST sans le transducteur chimique, puis avec le transducteur chimique, a montré que ce dernier inhibe l'activité de la GST.La GST est réactivée par l'ajout de concentrations croissantes de PDGF au complexe GST-transducteur chimique. Des ajouts successifs de PDGF, ainsi que d'un aptamère de PDGF non modifié au complexe GST-transducteur chimique, ont révélé que la communication entre le PDGF et la GST était réversible. L'ajout de PDGF au complexe GST-transducteur a entraîné une augmentation rapide de l'activité de la GST, 3,5 minutes après l'ajout des substrats.Bien que l'ajout d'un aptamère de PDGF à un mélange de GST, de PDGF et du transducteur chimique ait entraîné une diminution de l'activité de la GST. Ces résultats indiquent que le système réagit en temps réel aux changements de son environnement. Par la suite, la capacité de ce système à contrôler l'activation d'un pro-médicament a été étudiée à l'aide de JS-K, un pro-médicament anticancéreux activé par la GST pour libérer de l'oxyde nitrique toxique.Les mesures des quantités de monoxyde d'azote libérées suite à l'ajout de JS-K au transducteur chimique et à différentes combinaisons de GST et de PDGF ont confirmé que seule la présence simultanée de GST et de PDGF active JS-K. L'ensemble de ces résultats montre comment un agent synthétique peut permettre à un facteur de croissance de déclencher l'activité catalytique de la Glutathion S-Transférase, qui n'est pas son enzyme partenaire naturelle. Des biomimétiques futurs de cette classe pourraient donc être utilisés pour modifier la réponse des cellules aux signaux environnementaux ou leur conférer de nouvelles propriétés.

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Découvrez la conception de transducteurs chimiques synthétiques pour activer une communication protéique artificielle entre le PDGF et la GST. Cette méthode spectroscopique ouvre la voie à de nouvelles stratégies thérapeutiques en transduction du signal.

Imitant la fonction des protéines de signalisation: Vers Artificial Signal Therapy transduction

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