Imitant la fonction des protéines de signalisation: Vers Artificial Signal Therapy transduction

L’objectif global de cette expérience est de suivre spectroscopiquement la communication non naturelle entre deux protéines induite par un transducteur chimique synthétique. Ils démontreront la possibilité de développer des analogues synthétiques de protéines de signalisation qui seront capables d’effectuer des voies de transduction de signaux que l’on ne trouve pas dans la nature. La capacité de suivre une communication non naturelle de protéine à protéine par un spectrophotomètre commun pourrait aider à développer et à améliorer le fonctionnement des transducteurs chimiques artificiels et nous rapprocher de la réalisation d’une thérapie de transduction de signal artificielle.

Le transducteur chimique est composé d’un facteur de croissance dérivé des plaquettes, ou aptamère PDGF. Un inhibiteur bivalent de la GST de l’amide éthacrynique, un fluorophore et un désaltérant. La synthèse du transducteur chimique ne sera pas démontrée dans cette vidéo.

Mais est décrit dans le protocole de texte. Les principes de fonctionnement du transducteur chimique sont illustrés ici. Le transducteur chimique inhibe l’activité enzymatique de GST, lorsque les deux groupes EA se lient aux sites actifs des enzymes.

L’ajout de PDGF conduit à la formation du complexe de transducteurs chimiques PDGF. Ce qui perturbe l’interaction transducteur-GST, rétablissant ainsi l’activité enzymatique de GST. L’ajout suivant d’un aptamère PDGF non modifié libère le transducteur chimique et lui permet de réinhiber l’enzyme.

Avant de commencer les expériences d’examen du contrôle de l’activité GST par PDGF, mettre en place une procédure expérimentale dans le lecteur de plaques pour la mesure cinétique. Créez une nouvelle expérience en tant que protocole standard. Sélectionnez Procédure pour ouvrir la fenêtre Paramètres de procédure.

Dans la liste contextuelle située en haut de la fenêtre, choisissez le type de plaque 384 en fonction du fabricant de la plaque. Sélectionnez Lire dans le menu de gauche. Choisissez Absorbance pour la méthode de détection.

et point de terminaison pour le type de lecture. Dans la fenêtre Longueur d’onde, tapez 340 nanomètres. Sélectionnez Plaque complète et choisissez les puits à mesurer.

Cliquez ensuite sur OK pour fermer la fenêtre de lecture. Dans le menu de gauche, choisissez Démarrer cinétique. Définissez la durée d’exécution sur 10 minutes.

Sélectionnez l’option Intervalles minimum. Cliquez ensuite sur OK pour fermer la fenêtre Cinétique. Faites glisser la ligne de lecture dans la mesure cinétique.

Sélectionnez le bouton Valider, puis le bouton OK. Enregistrez l’expérience. Sélectionnez le bouton Lecture.

Une boîte de dialogue s’affiche, mais ne sélectionnez pas le bouton OK tant que vous n’êtes pas prêt à démarrer la mesure cinétique. Une fois le lecteur de plaques configuré, l’étape suivante consiste à préparer les échantillons pour mesurer l’activité GST en présence du transducteur chimique et du PDGF. Afin de tester quatre concentrations de PDGF en trois exemplaires, préparez quatre échantillons contenant chacun 3,25 microlitres de transducteur chimique et 3,25 microlitres de GST M-1.

Ajouter à chaque échantillon, zéro, 1,2, 2,4 ou 4,9 microlitres de PDGF respectivement. Ajoutez ensuite le volume approprié de tampon de dosage à chaque échantillon pour porter le volume total à 130 microlitres. Incuber les échantillons à température ambiante pendant 10 minutes.

Après 10 minutes, transférez 40 microlitres de chaque échantillon dans les puits d’une plaque à puits transparente 384. Transférez chacun des quatre échantillons dans les puits pairs ou impairs de la même rangée uniquement. Pour permettre l’utilisation d’un multi-pipeteur pour l’ajout de substrat.

Ensuite, à l’aide d’un multi-pipeteur à 12 canaux, ajoutez rapidement à chaque échantillon 10 microlitres de chaque substrat préalablement préparé dans une plaque à 96 puits. Mélangez rapidement, mais doucement, pour éviter les bulles. Insérez immédiatement la plaque dans le lecteur de plaques et lancez la mesure cinétique en sélectionnant le bouton OK dans la boîte de dialogue.

Pour examiner les cycles d’inhibition de l’activation de la GST médiés par le transducteur chimique, préparez cinq échantillons, chacun contenant 84,5 microlitres de tampon de dosage, 3,25 microlitres de transducteur chimique et 3,25 microlitres de GST M1-1. Incuber à température ambiante pendant trois minutes.

Ajoutez 3,65 microlitres de tampon de dosage au premier échantillon, et 3,65 microlitres de PDGF aux échantillons deux, trois, quatre et cinq. Incuber à température ambiante pendant trois minutes. Ajoutez 3,12 microlitres de tampon de dosage aux échantillons un et deux, et 3,12 microlitres d’aptamère PDGF aux échantillons trois, quatre et cinq.

Incuber à température ambiante pendant trois minutes. Ajouter 24,4 microlitres de tampon de dosage aux échantillons un, deux et trois. Et 24,4 microlitres de PDGF pour les échantillons quatre et cinq.

Incuber à température ambiante pendant trois minutes. Ajoutez 7,8 microlitres de tampon de dosage aux échantillons un à quatre, et 7,8 microlitres d’aptamère PDGF à l’échantillon cinq. Incuber à température ambiante pendant cinq minutes.

Transférez les échantillons sur une plaque à puits transparente 384. Réaliser l’expérience en trois exemplaires, et ajouter rapidement le substrat aux échantillons. Insérez la plaque dans le lecteur et lancez la mesure cinétique.

Pour commencer ce test, mettez en place une procédure expérimentale dans le lecteur de plaques pour la mesure cinétique comme décrit dans le texte du protocole. Préparez deux échantillons dans deux puits d’une plaque transparente 384. Pour chaque puits, mélangez un microlitre de GST M1-1 et un microlitre de transducteur chimique dans 38 microlitres de tampon de dosage.

Laissez un puits vide entre les deux puits. À l’aide d’un multi-pipeteur à 12 canaux, ajoutez rapidement 10 microlitres de substrat dans chaque puits. Et mélangez doucement et rapidement pour éviter les bulles.

Insérez immédiatement la plaque dans le lecteur et lancez la mesure cinétique. Lorsque le lecteur de plaques s’ouvre après 3,5 minutes, ajoutez rapidement 1,125 microlitres de PDGF dans l’un des puits, mélangez doucement et laissez la plaque rentrer dans le lecteur pour les mesures cinétiques restantes. Avant de préparer les échantillons pour cette expérience, mettre en place une procédure expérimentale dans le lecteur de plaques pour la mesure cinétique décrite dans le texte du protocole.

Un kit colorimétrique nitrite/nitrate sera utilisé pour mesurer la production d’oxyde nitrique. Dans une plaque à 96 puits, distribuez 50 microlitres de tampon de dosage par puits dans la première rangée. 70 microlitres de réactif Griess One par puits dans la deuxième rangée.

Et 70 microlitres de réactif Griess Two par puits dans la troisième rangée. Préparez quatre échantillons, chacun contenant 4,8 microlitres de transducteur chimique. Pour en échantillonner un, ajoutez 155,2 microlitres de tampon de dosage.

Pour en échantillonner deux, ajoutez 3,2 microlitres de GST M1-1 et 152 microlitres de tampon de dosage. Pour le troisième échantillon, ajoutez 9,6 microlitres de PDGF et 145,6 microlitres de tampon de dosage. Et pour en échantillonner quatre, ajoutez 3,2 microlitres de GST M1-1, 9,6 microlitres de PDGF et 142,4 microlitres de tampon de dosage.

Incuber les échantillons à température ambiante pendant 10 minutes. Distribuer 50 microlitres d’échantillon par puits dans une plaque transparente de 384 puits pour réaliser l’expérience en trois exemplaires. Distribuez des échantillons uniquement aux puits pairs ou impairs de la même ligne pour permettre l’utilisation d’un multi-pipeteur pour l’ajout de substrat.

Ajoutez 0,54 microlitre de promédicament JS-K à chaque échantillon. Ajouter rapidement à chaque échantillon 10 microlitres de solution de glutathion et mélanger doucement et rapidement pour éviter les bulles. Insérez la plaque dans le lecteur et lancez la mesure cinétique.

Immédiatement après la mesure cinétique, transférez 50 microlitres de chaque échantillon dans chaque puits de la première rangée de la plaque à 96 puits avec tampon de dosage. Transférez ensuite 50 microlitres de chaque puits de la deuxième rangée de la plaque dans les puits de la première rangée de la plaque. Et 50 microlitres par puits de la troisième rangée de la plaque dans les puits de la première rangée de la plaque.

Incuber à l’abri de la lumière pendant 10 minutes à température ambiante. Avant de mesurer l’absorbance à 550 nanomètres. La mesure de l’activité GST sans le transducteur chimique, et avec le transducteur chimique, a montré que le transducteur chimique inhibe l’activité GST.

La GST est réactivée par l’ajout de concentrations croissantes de PDGF au complexe de transducteurs chimiques GST. Des ajouts séquentiels de PDGF et d’un aptamère PDGF non modifié au complexe de transducteurs GST-chimiques ont révélé que la communication entre le PDGF et le GST était réversible. L’ajout de PDGF au complexe de transducteurs GST a entraîné une augmentation rapide de l’activité GST, 3,5 minutes après l’ajout de substrats.

Alors que l’ajout d’un aptamère PDGF à un mélange de GST, de PDGF et du transducteur chimique a entraîné une diminution de l’activité GST. Ces résultats indiquent que le système réagit en temps réel aux changements de son environnement. Par la suite, la capacité de ce système à contrôler l’activation du promédicament a été étudiée à l’aide du JS-K, un promédicament anticancéreux qui est activé par la GST pour libérer de l’oxyde nitrique toxique.

Les mesures des quantités d’oxyde nitrique libérées lors de l’ajout de JS-K dans le transducteur chimique et de différentes combinaisons de GST et de PDGF ont confirmé que seule la présence de GST et de PDGF active JS-K. Tout cela montre comment un agent synthétique peut permettre à un facteur de croissance de déclencher l’activité catalytique de la glutathion S-transférase, qui n’est pas son partenaire enzymatique naturel. Les futurs biomimétiques de cette classe pourraient donc être utilisés pour modifier la réponse des cellules aux signaux environnementaux ou leur conférer de nouvelles propriétés.