Name: Imitant la fonction des protéines de signalisation: Vers Artificial Signal Therapy transduction (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 24 s
Description: Découvrez la conception de transducteurs chimiques synthétiques pour activer une communication protéique artificielle entre le PDGF et la GST. Cette méthode spectroscopique ouvre la voie à de nouvelles stratégies thérapeutiques en transduction du signal.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Cette recherche a été soutenue par la Fondation Minerva, l&#39;Organisation HFSP, et un Conseil de recherche Grant européenne (Starting Grant 338265).

1. Synthèse de la «Chemical Transducer» <ol><li> Préparatifs préliminaires <ol><li> Préparer 2 M d&#39;acétate de triéthylammonium (TEAA) un tampon en mélangeant 278 ml de triéthylamine avec 114 ml d&#39;acide acétique et 400 ml d&#39;eau ultrapure. Ajuster le pH à 7 et ajouter de l&#39;eau à un volume final de 1 L. Gardez-le dans une bouteille sombre. Remarque: Cette solution est stable pendant des années. </li><li> Préparer une solution d&#39;acide ascorbique à 5 mM en dissolvant 18 mg d&#39;acide ascorbique dans 20 ml d&#39;eau ultrapure. Utiliser une solution fraîche; la solution est stable pendant une journée. </li><li> Préparer un (II) / tris (benzyltriazolylmethyl) amine (TBTA) Solution mM de Cu 10 en dissolvant 25 mg de cuivre (II) pentahydrate de sulfate dans 10 ml d&#39;eau ultra-pure et 58 mg de TBTA dans 11 ml de diméthylsulfoxyde (DMSO). Mélanger les deux solutions. Gardez-le à la température ambiante et de le protéger de la lumière. </li></ol></li><li> procédure Conjugaison <ol><li> Dissoudre 100 nmoles de l&#39;oligonucléotide modifié (ODN-1) dans 80 uld&#39;eau ultrapure frais. Ajouter 20 ul de 2 M TEAA, pH = 7. Ajouter 80 ul d&#39;une solution fraîchement préparée d&#39;acide ascorbique (5 mM dans de l&#39;eau). </li><li> Dissoudre 1,5 umol (574,5 ug) d&#39;acide éthacrynique azido modifié dans 180 pi de DMSO et on ajoute à la solution. Dégazer la solution à l&#39;aide d&#39;argon pendant 60 sec, puis ajouter 40 ul de l &#39;(II) une solution de Cu / TBTA (10 mM dans 55% (v / v) de DMSO / eau) rapidement. </li><li> Purger à nouveau avec de l&#39;argon, fermer hermétiquement et agiter pendant une nuit. </li><li> Surveiller la progression de la réaction et on purifie le conjugué par RP-HPLC preparative (phase mobile: A) 5% d&#39;acétonitrile, 5% de TEAA, 90% d&#39;eau ultrapure; B) 65% Acétonitrile, 5% TEAA, 30% d&#39; eau ultrapure). 24 </li></ol></li></ol> 2. Contrôle de la TPS Activité par PDGF <ol><li> Préparatifs préliminaires <ol><li> Préparer 50 ml du tampon de dosage en mélangeant 33,9 ml de tampon phosphate salin (PBSx1) avec 16,1 ml d&#39;eau ultra-pure pour obtenir une concentration finale de phosphate et ad 8 mMd 23,8 mg de MgCl2 pour parvenir à une concentration finale de 5 mM. </li><li> Préparer une solution de réserve de GST M1-1 par dissolution de la protéine dans un tampon contenant 50 mM de Tris pH 7,5, NaCl 50 mM, dithiothréitol 1 mM (DTT) et 5 mM d&#39;acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA) à une concentration finale de 30 uM. Divisez cette solution dans de petites aliquotes et stocker à -80 ° C. Diluer fraîchement, conformément à la section 2.1.5.1, dans le tampon de dosage et de garder sur la glace. Remarque: La solution est stable pendant environ 5 heures, ou jusqu&#39;à ce qu&#39;il y a une réduction de l&#39;activité enzymatique. </li><li> La préparation du substrat selon les instructions suivantes: <ol><li> Dissolvez 10 mg de glutathion réduit (GSH) dans 325 pi d&#39;eau ultrapure à une concentration finale de mM solution 100. Diluer 21 pi de cette solution mère dans 979 pi de tampon de dosage pour une concentration finale de la solution de travail 2.1 mM. </li><li> Dissolvez 10 mg de 2,4-dinitrochlorobenzène (CDNB) dans 492 pi d&#39;ethanol à une concentration finale de mM solution 100. Diluer 43,2 ul de la solution mère dans 956,8 pi d&#39;un tampon de dosage pour une concentration finale de solution de travail 4,32 mM. </li></ol></li><li> Dans une plaque de 96 puits, mettre chaque substrat dans une ligne distincte (12 puits). Insérez au moins 60 pi dans chaque puits pour permettre le retrait rapide et facile de la solution. Couvrir la plaque avec une feuille d&#39;aluminium pour la protection de la lumière. </li><li> Préparer les solutions mères suivantes dans le tampon de dosage: <ol><li> GST M1-1 diluer 50 à une concentration finale de 0,6 uM du dimère. </li><li> Diluer le «capteur chimique» à une solution stock de 30 uM. </li><li> Diluer le PDGF à une concentration finale de 40 uM. </li><li> Diluer le PDGF aptamère à une concentration finale de 250 uM. </li></ol></li></ol></li><li> Mesurer l&#39;activité de la TPS en présence du «capteur chimique» et PDGF. <ol><li> Mettre en place une procédure expérimentale in le lecteur de plaques pour la mesure cinétique. <ol><li> Créer une nouvelle expérience comme un «protocole standard». </li><li> Appuyez sur «procédure» pour ouvrir la fenêtre des paramètres de procédure. </li><li> Dans la liste déroulante sur la face supérieure de la fenêtre, choisissez le type «384 de la plaque», selon le fabricant de la plaque. </li><li> Appuyez sur Lire &#39;sur le menu de gauche. </li><li> En ce qui concerne la méthode de détection choisissez &#39;Absorbance&#39;. </li><li> En ce qui concerne le type de lecture choisissez «Point final». </li><li> Écrire 340 nm dans la fenêtre de longueurs d&#39;onde. </li><li> Appuyez sur la «plaque pleine» en bas sur le côté supérieur droit et choisir le bien à mesurer. </li><li> de ok &#39;pour fermer la «Lecture» fenêtre Press. </li><li> Choisissez «start cinétique» sur le menu de gauche. </li><li> Faire le temps d&#39;exécution 10 min. </li><li> Sélectionnez l&#39;option d&#39;intervalle minimum. </li><li> Appuyez sur &quot;OK&quot; pour fermer la fenêtre cinétique. </li><li> Faites glisser le &#39;Lire&#39; ligne into la mesure cinétique. </li><li> Appuyez sur le bouton «valider», puis sur le bouton «OK». </li><li> Enregistrer l&#39;expérience. </li><li> Appuyez sur le bouton &#39;play&#39;. Une boîte de dialogue apparaîtra - appuyez sur le bouton «ok» que lorsque la mesure doit être démarré. </li></ol></li><li> Afin d&#39;effectuer l&#39;essai de triplicats préparer quatre échantillons contenant chacun 3,25 ul du «transducteur chimique» et 3,25 pi de GST M1-1. Ajouter à chaque échantillon à 0, 1,2, 2,4 ou 4,9 ul de PDGF et 123,5, 122,3, 121,1, 118,6 ou pi du tampon de dosage, respectivement. </li><li> Incuber la solution à température ambiante pendant 10 min. </li><li> Dans une plaque de 384 puits-transparent, insérer 40 pi d&#39;échantillon dans chaque puits. Insérer les seuls échantillons dans les puits impairs ou uniquement dans le même puits de la même ligne pour permettre l&#39;utilisation d&#39;un multi-pipetteur pour l&#39;addition du substrat. </li><li> En utilisant un pipetteur multi-canaux 12, ajouter rapidement 10 ul de chacun des til substrats qui ont été pré-préparés dans la plaque de 96 puits (section 2.1.4). Mélanger doucement et rapidement pour éviter les bulles. Insérez la plaque dans le lecteur et lancer la mesure cinétique. La cinétique de la TPS est assez rapide, essayez de réduire le temps entre l&#39;addition de substrat et le début de la mesure cinétique. </li></ol></li><li> TPS Activation Cycles / d&#39;inhibition médiée par le «capteur chimique». <ol><li> Afin de réaliser l&#39;expérience de triplicats, préparer 5 échantillons contenant chacun 84,5 pi de tampon de dosage, 3,25 ul de «capteur chimique», et 3,25 ul de TPS M1-1. Incuber à température ambiante pendant 3 min. </li><li> Ajouter 3,65 pi de tampon de dosage à l&#39;échantillon 1 et 3,65 ul de PDGF à des échantillons 2-5. Incuber à température ambiante pendant 3 min. </li><li> Ajouter 3.12 pi de tampon de dosage à des échantillons 1-2 et 3,12 ul de PDGF aptamère aux échantillons 3-5. Incuber à température ambiante pendant 3 min. </li><li> Ajouter 24,4 pi de tampon de dosage à des échantillons1-3 et 24,4 ul de PDGF à des échantillons 4-5. Incuber à température ambiante pendant 3 min. </li><li> Ajouter 7,8 pi de tampon de dosage à des échantillons 1-4 et 7,8 ul de PDGF aptamère à l&#39;échantillon 5. Incuber à température ambiante pendant 5 min. </li><li> Dans une plaque de 384 puits-transparent, insérer 40 pi d&#39;échantillon dans chaque puits. Insérez les échantillons uniquement dans le bizarre ou seulement dans les même puits dans la même ligne. </li><li> L&#39;utilisation d&#39;un multi-pipetteur 12 canaux, ajouter rapidement 10 ul de chaque substrat (pré-établi dans la plaque de 96 puits). Mélanger doucement et rapidement pour éviter les bulles. Insérez la plaque dans le lecteur et lancer la mesure cinétique. </li><li> Calculer le V 0 [MOD / min] dans chaque condition en soustrayant la DO mesurée à 340 nm à t = 0,5 min à partir de la DO mesurée à 340 nm à t = 1,5 min pour évaluer l&#39;activation / inhibition recyclabilité. 25 </li></ol></li><li> Évaluer la réponse en temps réel de la «sonde chimique» aux changements dans l&#39;environnement. <ol> &lt;li&gt; effet en temps réel de plus PDGF <ol><li> Mettre en place une procédure expérimentale dans le lecteur de plaques pour la mesure cinétique. </li><li> Répétez les étapes 2.2.1.1-2.2.1.10. </li><li> Prenez le temps d&#39;exécution 3,5 min. </li><li> Sélectionnez l&#39;option d&#39;intervalle minimum. </li><li> Appuyez sur &quot;OK&quot; pour fermer la fenêtre cinétique. </li><li> Faites glisser la ligne «Lire» dans la mesure cinétique. </li><li> Choisissez Plate Out / In sur le menu de gauche. </li><li> Choisissez l&#39;option &#39;étaler (pas de dialogue). </li><li> Choisissez l&#39;option «Retard» sur le menu de gauche et entrez 30 sec. </li><li> Choisissez Plate Out / In sur le menu de gauche. </li><li> Choisissez l&#39;option &#39;plaque (pas de dialogue). </li><li> Créer une deuxième mesure cinétique en répétant les étapes 2.2.1.4 - 2.2.1.14, mais dans la section 2.2.1.11 régler la cinétique de 25 min au lieu de 10 min. </li><li> Appuyez sur le bouton «valider», puis sur le bouton «OK». </li><li> Enregistrer l&#39;expérience. </li><li> Appuyez sur le «plabouton y &#39;. Une boîte de dialogue apparaîtra - appuyez sur le bouton «ok» que lorsque la mesure doit être démarré. </li><li> Préparer deux échantillons en mélangeant 1 pi de TPS M1-1 et 1 pl de la «capteur chimique» dans 38 pi de tampon de dosage. Insérez les échantillons dans deux puits d&#39;une plaque de 384 puits-transparent, laissant un puits vide entre ces deux puits. </li><li> L&#39;utilisation d&#39;un multi-pipetteur 12 canaux, ajouter rapidement 10 pi de chaque substrat, mélanger délicatement et rapidement pour éviter les bulles, insérer la plaque dans le lecteur et lancer la mesure cinétique. </li><li> Lorsque la plaque ouvre (après 3,5 min), ajouter rapidement 1,125 ul de PDGF à l&#39; un des puits, mélanger doucement, et laisser la plaque fermer pour les mesures cinétiques restantes. </li></ol></li><li> effet en temps réel de l&#39;ajout de l&#39;aptamère PDGF <ol><li> Répétez les étapes 2.4.1.1-2.4.1.15. </li><li> Préparer deux échantillons en mélangeant 1 pi de TPS M1-1, 1 pl de la &#39;transducteur chimique », et 1,125 ul de PDGF dans 36,9 pi de tampon de dosage. Insérez les échantillons dans deux puits d&#39;une plaque de 384 puits-transparent, laissant un puits vide entre ces deux puits. </li><li> L&#39;utilisation d&#39;un multi-pipetteur 12 canaux, ajouter rapidement 10 pi de chaque substrat, mélanger délicatement et rapidement pour éviter les bulles, insérer la plaque dans le lecteur, et commencer la mesure cinétique. </li><li> Lorsque la plaque ouvre (après 1,5 min), ajouter rapidement 1,2 ul de PDGF aptamère à l&#39; un des puits, mélanger doucement et laisser la plaque fermer pour les mesures cinétiques restantes. </li></ol></li></ol></li><li> Mesurer JS-K Promédicament d&#39;activation par GST en présence du «transducteur chimique» et PDGF. <ol><li> Mettre en place une procédure expérimentale dans le lecteur de plaques pour la mesure cinétique. <ol><li> Créer une nouvelle expérience comme un «protocole standard». </li><li> Appuyez sur «procédure» pour ouvrir la fenêtre des paramètres de procédure.</li><li> Dans la liste déroulante sur la face supérieure de la fenêtre, sélectionnez le type &#39;384 de la plaque », selon le fabricant de la plaque. </li><li> Appuyez sur Lire &#39;sur le menu de gauche. </li><li> En ce qui concerne la méthode de détection a choisi &#39;Absorbance&#39;. </li><li> En ce qui concerne le type de lecture choisissez «Point final». </li><li> Écrire 305 nm dans la fenêtre de longueurs d&#39;onde. </li><li> Appuyez sur le bouton «plaque pleine» sur le côté supérieur droit et choisir le bien à mesurer. </li><li> de ok &#39;pour fermer la «Lecture» fenêtre Press. </li><li> Choisissez «start cinétique» sur le menu de gauche. </li><li> Faire le temps d&#39;exécution 10 min. </li><li> Sélectionnez l&#39;option d&#39;intervalle minimum. </li><li> Appuyez sur &quot;OK&quot; pour fermer la fenêtre cinétique. </li><li> Faites glisser la ligne «Lire» dans la mesure cinétique. </li><li> Appuyez sur le bouton «valider», puis sur le bouton «OK». </li><li> Enregistrer l&#39;expérience. </li><li> Appuyez sur le bouton &#39;play&#39;. Une bo dialoguex apparaîtra - appuyez sur le bouton «ok» que lorsque la mesure doit être démarré. </li></ol></li><li> Pour la production de NO mesures utilisent un kit calorimétrique nitrite / nitrate. Dans une plaque de 96 puits d&#39;insérer 50 ul de tampon d&#39;essai dans une rangée, 70 pl de Griess I réactif dans une deuxième rangée, et 70 pi de réactif de Griess II dans une troisième rangée. </li><li> Afin d&#39;effectuer l&#39;essai de triplicats préparer quatre échantillons contenant chacun 4,8 pi de «capteur chimique. Pour échantillonner 1, ajouter 155,2 pi de tampon de dosage; échantillonner 2, ajouter 3,2 pi de GST-M1-1 et 152 pi de tampon de dosage; à l&#39;échantillon 3, ajouter 9,6 pi de PDGF et 145,6 pi de tampon de dosage; et à l&#39;échantillon 4, ajouter 3,2 pi de GST-M1-1, 9,6 pi de PDGF, et 142,4 pi de tampon de dosage. </li><li> Incuber la solution à température ambiante pendant 10 min. </li><li> Dans une plaque de 384 puits-transparent, insérez 50 ul d&#39;échantillon dans chaque puits. Insérez les échantillons uniquement dans le bizarre ou seulement dans lemême les puits de la même ligne pour permettre l&#39;utilisation d&#39;un multi-pipetteur pour l&#39;addition du substrat. </li><li> Ajouter 0,54 pi de JS-K (5 mM dans du DMSO) à chaque puits. </li><li> L&#39;utilisation d&#39;un multi-pipetteur 12 canaux, ajouter rapidement 10 ul de la solution GSH (pré-préparée dans la plaque de 96 puits), mélanger doucement et rapidement pour éviter les bulles. Insérez la plaque dans le lecteur et lancer la mesure cinétique. </li><li> Immédiatement après la mesure cinétique, à l&#39;aide d&#39;un multi-pipetteur 12 canaux, prendre 50 ul de chaque échantillon dans la rangée de tampon de dosage dans la plaque de 96 puits pré-préparés et ajouter rapidement à ce 50 pi de réactif de Griess I et 50 pi de réactif Griess II. Incuber tout en protégeant de la lumière pendant 10 min à température ambiante et mesurer l&#39;absorbance à 550 nm. Note: Le tampon de dosage et les réactifs volumes sont dépendants du protocole de la trousse. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Hunter, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signaling%E2%80%942000+and+Beyond%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Signaling—2000 and Beyond.</a> Cell. 100, 113-127 (2000).</li>
<li>Levitzki, A., Klein, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signal+transduction+therapy+of+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Aspects+Med%22%5BJournal%5D)">Signal transduction therapy of cancer.</a> Mol Aspects Med. 31, 287-329 (2010).</li>
<li>Peri-Naor, R., Motiei, L., Margulies, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Artificial+signal+transduction+therapy%3A+a+futuristic+approach+to+disease+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Future+Med.+Chem%22%5BJournal%5D)">Artificial signal transduction therapy: a futuristic approach to disease treatment.</a> Future Med. Chem. 7, 2091-2093 (2015).</li>
<li>Peri-Naor, R., Ilani, T., Motiei, L., Margulies, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein-Protein+Communication+and+Enzyme+Activation+Mediated+by+a+Synthetic+Chemical+Transducer%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Protein-Protein Communication and Enzyme Activation Mediated by a Synthetic Chemical Transducer.</a> J. Am. Chem. Soc. 137, 9507-9510 (2015).</li>
<li>Corson, T. W., Aberle, N., Crews, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+and+Applications+of+Bifunctional+Small+Molecules%3A+Why+Two+Heads+Are+Better+Than+One%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chem.+Biol%22%5BJournal%5D)">Design and Applications of Bifunctional Small Molecules: Why Two Heads Are Better Than One.</a> ACS Chem. Biol. 3, 677-692 (2008).</li>
<li>Rutkowska, A., Schultz, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+Tango%3A+The+Toolbox+to+Capture+Interacting+Partners%5BTitle%5D)+AND+%22Angew.+Chem.+Int.+Ed%22%5BJournal%5D)">Protein Tango: The Toolbox to Capture Interacting Partners.</a> Angew. Chem. Int. Ed. 51, 8166-8176 (2012).</li>
<li>Meyer, C., Köhn, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Molecular+T%C3%AAte-%C3%A0-T%C3%AAte+Arranged+by+a+Designed+Adaptor+Protein%5BTitle%5D)+AND+%22Angew.+Chem.+Int.+Ed%22%5BJournal%5D)">A Molecular Tête-à-Tête Arranged by a Designed Adaptor Protein.</a> Angew. Chem. Int. Ed. 51, 8160-8162 (2012).</li>
<li>Klemm, J. D., Schreiber, S. L., Crabtree, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dimerization+as+a+Regulatory+Mechanism+in+Signal+Transduction%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Dimerization as a Regulatory Mechanism in Signal Transduction.</a> Annu. Rev. Immunol. 16, 569-592 (1998).</li>
<li>DeRose, R., Miyamoto, T., Inoue, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Manipulating+signaling+at+will%3A+chemically-inducible+dimerization+%28CID%29+techniques+resolve+problems+in+cell+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Pflugers+Arch%22%5BJournal%5D)">Manipulating signaling at will: chemically-inducible dimerization (CID) techniques resolve problems in cell biology.</a> Pflugers Arch. 465, 409-417 (2013).</li>
<li>Gestwicki, J. E., Marinec, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+control+over+protein-protein+interactions%3A+beyond+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22Comb.+Chem.+High+Throughput.+Screen%22%5BJournal%5D)">Chemical control over protein-protein interactions: beyond inhibitors.</a> Comb. Chem. High Throughput. Screen. 10, 667-675 (2007).</li>
<li>Battle, C., Chu, X., Jayawickramarajah, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oligonucleotide-based+systems+for+input-controlled+and+non-covalently+regulated+protein+binding%5BTitle%5D)+AND+%22Supramol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Oligonucleotide-based systems for input-controlled and non-covalently regulated protein binding.</a> Supramol. Chem. 25, 848-862 (2013).</li>
<li>Diezmann, F., Seitz, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA-guided+display+of+proteins+and+protein+ligands+for+the+interrogation+of+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Soc.+Rev%22%5BJournal%5D)">DNA-guided display of proteins and protein ligands for the interrogation of biology.</a> Chem. Soc. Rev. 40, 5789-5801 (2011).</li>
<li>Röglin, L., Ahmadian, M. R., Seitz, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA-Controlled+Reversible+Switching+of+Peptide+Conformation+and+Bioactivity%5BTitle%5D)+AND+%22Angew.+Chem.+Int.+Ed%22%5BJournal%5D)">DNA-Controlled Reversible Switching of Peptide Conformation and Bioactivity.</a> Angew. Chem. Int. Ed. 46, 2704-2707 (2007).</li>
<li>Röglin, L., Altenbrunn, F., Seitz, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+and+RNA-Controlled+Switching+of+Protein+Kinase+Activity%5BTitle%5D)+AND+%22ChemBioChem%22%5BJournal%5D)">DNA and RNA-Controlled Switching of Protein Kinase Activity.</a> ChemBioChem. 10, 758-765 (2009).</li>
<li>Harris, D. C., Chu, X., Jayawickramarajah, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA-Small+Molecule+Chimera+with+Responsive+Protein-Binding+Ability%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">DNA-Small Molecule Chimera with Responsive Protein-Binding Ability.</a> J. Am. Chem. Soc. 130, 14950-14951 (2008).</li>
<li>Harris, D. C., Saks, B. R., Jayawickramarajah, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein-Binding+Molecular+Switches+via+Host-Guest+Stabilized+DNA+Hairpins%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Protein-Binding Molecular Switches via Host-Guest Stabilized DNA Hairpins.</a> J. Am. Chem. Soc. 133, 7676-7679 (2011).</li>
<li>Kim, Y., Cao, Z., Tan, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+assembly+for+high-performance+bivalent+nucleic+acid+inhibitor%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Nat.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Molecular assembly for high-performance bivalent nucleic acid inhibitor.</a> Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. 105, 5664-5669 (2008).</li>
<li>Han, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Logical+Molecular+Circuit+for+Programmable+and+Autonomous+Regulation+of+Protein+Activity+Using+DNA+Aptamer-Protein+Interactions%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">A Logical Molecular Circuit for Programmable and Autonomous Regulation of Protein Activity Using DNA Aptamer-Protein Interactions.</a> J. Am. Chem. Soc. 134, 20797-20804 (2012).</li>
<li>Motiei, L., Pode, Z., Koganitsky, A., Margulies, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+Protein+Surface+Sensors+as+a+Tool+for+Analyzing+Small+Populations+of+Proteins+in+Biological+Mixtures%5BTitle%5D)+AND+%22Angew.+Chem.+Int.+Ed%22%5BJournal%5D)">Targeted Protein Surface Sensors as a Tool for Analyzing Small Populations of Proteins in Biological Mixtures.</a> Angew. Chem. Int. Ed. 53, 9289-9293 (2014).</li>
<li>Ranallo, S., Rossetti, M., Plaxco, K. W., Vallée-Bélisle, A., Ricci, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Modular%2C+DNA-Based+Beacon+for+Single-Step+Fluorescence+Detection+of+Antibodies+and+Other+Proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Angew.+Chem.+Int.+Ed%22%5BJournal%5D)">A Modular, DNA-Based Beacon for Single-Step Fluorescence Detection of Antibodies and Other Proteins.</a> Angew. Chem. Int. Ed. 54, 13214-13218 (2015).</li>
<li>Franzini, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+Structure-Activity+Relationships+from+Screening+a+Structurally+Compact+DNA-Encoded+Chemical+Library%5BTitle%5D)+AND+%22Angew.+Chem.+Int.+Ed%22%5BJournal%5D)">Identification of Structure-Activity Relationships from Screening a Structurally Compact DNA-Encoded Chemical Library.</a> Angew. Chem. Int. Ed. 54, 3927-3931 (2015).</li>
<li>Unger-Angel, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+recognition+by+bivalent%2C+%27turn-on%27+fluorescent+molecular+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Sci%22%5BJournal%5D)">Protein recognition by bivalent, 'turn-on' fluorescent molecular probes.</a> Chem. Sci. 6, 5419-5425 (2015).</li>
<li>Nissinkorn, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensing+Protein+Surfaces+with+Targeted+Fluorescent+Receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Eur.+J%22%5BJournal%5D)">Sensing Protein Surfaces with Targeted Fluorescent Receptors.</a> Chem. Eur. J. 21, 15981-15987 (2015).</li>
<li>Huber, C. G., Oefner, P. J., Bonn, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-Resolution+Liquid+Chromatography+of+Oligonucleotides+on+Nonporous+Alkylated+Styrene-Divinylbenzene+Copolymers%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">High-Resolution Liquid Chromatography of Oligonucleotides on Nonporous Alkylated Styrene-Divinylbenzene Copolymers.</a> Anal. Biochem. 212, 351-358 (1993).</li>
<li>Lyon, R. P., Hill, J. J., Atkins, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+class+of+bivalent+glutathione+S-transferase+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Novel class of bivalent glutathione S-transferase inhibitors.</a> Biochemistry. 42, 10418-10428 (2003).</li>
<li>Battle, C., Chu, X., Jayawickramarajah, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oligonucleotide-based+systems+for+input-controlled+and+non-covalently+regulated+protein+binding%5BTitle%5D)+AND+%22Supramol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Oligonucleotide-based systems for input-controlled and non-covalently regulated protein binding.</a> Supramol. Chem. , 1-16 (2013).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Nous avons présenté une méthode de conception et de test d’un « transducteur chimique » capable d’induire une communication artificielle entre deux protéines naturellement non apparentées, GST et PDGF, sans modifier les protéines natives. Les communications non naturelles GST-PDGF ont pu être détectées en temps réel à l’aide de tests enzymatiques qui suivent les changements dans l’activité de GST en présence du « transducteur chimique » et en augmentant les concentrations de PDGF. En plus de détecter l’activation de la G...

Les voies de transduction du signal jouent un rôle important dans pratiquement tous les processus cellulaire et permettent à la cellule de répondre rapidement à des signaux environnementaux. 1 Ces voies sont souvent déclenchées par la liaison d&#39;une molécule de signalisation à un récepteur extracellulaire, ce qui se traduit par l&#39; activation des enzymes intracellulaires. L&#39;amplification et la propagation de ce signal dans la cellule est médié par la fonction des protéines qui forment un réseau d&#39;interactions protéine-protéine dans lequel les enzymes sont activées de manière réversible avec une spécificité élevée de signalisation. Parce que la dysrégulation de ces réseaux conduit souvent au développement du cancer, il y a eu beaucoup d&#39; intérêt pour l&#39; établissement d&#39;une «thérapie de signal de transduction du cancer &#39;, 2 dans lequel les médicaments sont conçus pour perturber les voies de signalisation malignes. Nous avons récemment proposé une approche alternative pour signaler la thérapie de transduction qui repose sur la capacité des médicaments pour générer anormales des voies de transduction du signal. <sup&gt; 3 En particulier, nous pensons que par la conception d&#39; agents synthétiques qui imitent la fonction des protéines de signalisation, il serait possible de moduler la fonction de la cellule indirectement. Par exemple, ces réseaux artificiels peuvent permettre à des biomarqueurs protéiques pour activer les enzymes qui clivent promédicaments. En variante, ces mimétiques de protéines de signalisation pourraient être en mesure d&#39;activer contre nature des voies de signalisation cellulaire, entraînant des effets thérapeutiques. Pour démontrer la faisabilité de cette approche, nous avons récemment créé un «capteur chimique» synthétique 4 qui permet le facteur de croissance dérivé des plaquettes (PDGF) pour déclencher le clivage d&#39;un promédicament anticancéreux en activant le glutathion-S-transférase (GST), qui est pas son partenaire de liaison naturel. La structure de ce «transducteur» se compose d&#39;un anti-PDGF ADN aptamère qui a été modifié avec un inhibiteur de la TPS bivalent. Par conséquent, cet agent synthétique appartient à une famille de molécules ayant des sites de liaison àprotéines différentes, telles que 5-7 inducteurs chimiques de dimérisation (CID) , 8-10 et aussi pour le groupe de protéines de liants à base de conjugués de molécules d&#39; oligonucléotides synthétiques. 21/11 Les principes généraux sous-jacents à la conception de tels systèmes sont décrits ici et des protocoles détaillés pour la synthèse et le test du fonctionnement de ce «transducteur» avec des dosages enzymatiques classiques sont fournis. Ce travail est destiné à faciliter le développement de «transducteurs» supplémentaires de cette classe, qui peut être utilisé pour la médiation intracellulaire communication protéine-protéine et, par conséquent, pour induire artificiels voies de signalisation cellulaire. La figure 1 décrit schématiquement les principes de fonctionnement des transducteurs «chimiques» synthétiques non naturels qui peuvent médier des communications protéine-protéine. Dans cette illustration, un «transducteur chimique», qui intègre des liants synthétiques pour la proteins I et II (liants I et II), permet la protéine II pour déclencher l&#39;activité catalytique de la protéine I, qui ne fait pas son partenaire de liaison naturel. En l&#39;absence de la protéine II, le transducteur se lie au site catalytique de l&#39;enzyme (protéine I) et inhibe son activité (figure 1, l&#39; état ii). La liaison du «transducteur» à la protéine II, cependant, favorise les interactions entre le liant I et la surface de la protéine II (figure 1, l&#39; état iii), ce qui réduit son affinité envers la protéine I. En conséquence, la concentration efficace du &#39; transducteur libre »dans la solution est réduite, ce qui conduit à la dissociation de la protéine de transduction complexe I et à la réactivation de la protéine I (figure 1, l&#39; état iv). Pris ensemble, ces étapes souligner trois principes fondamentaux qui sous-tendent la conception des «transducteurs» efficaces: (1) un «transducteur» devrait avoir un liant spécifique pour chacune des cibles protéiques, (2) l&#39;betwe d&#39;interactionen liant II et la protéine II devrait être plus forte que l&#39;interaction entre le liant I et la protéine I, et (3) liant je dois être capable d&#39;interagir avec la surface de la protéine II. Ce dernier principe ne requiert pas nécessairement que liant moi seul aurait une grande affinité et sélectivité pour la protéine II. Au lieu de cela, elle est basée sur nos études récentes qui montrent que l&#39; introduction d&#39; une molécule synthétique à proximité d&#39;une protéine est de nature à favoriser les interactions entre cette molécule et la surface de la protéine 19,22,23. <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/54396/54396fig1.jpg" /> Figure 1:. Utilisation des principes de «transducteurs chimiques» Lorsque le «capteur chimique» est ajouté à une protéine active I (état i), il se lie à son site actif par le biais de liant I et inhibe son activité (état ii). En présence de la protéine II, cependant, la non liés &quot;chimique transducer &#39;interagit avec la protéine II liant à travers II, qui favorise les interactions entre le liant I et la surface de la protéine II. Ce liant induit I-protéine interaction II réduit la concentration efficace de liant I, ce qui conduit à la dissociation de la «protéine de transducer&#39; complexe I et de la protéine I réactivation (état iv). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54396/54396fig1large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure .</a>

<table><tbody><tr><td>1-chloro-2,4-dinitrobenzène</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>237329</td><td></td></tr><tr><td>Acide acétique</td><td>Bio Lab</td><td>01070521</td><td></td></tr><tr><td>Acétnitrile</td><td>J.T.Baker</td><td>9017-03</td><td></td></tr><tr><td>Acide ascorbique</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4544</td><td></td></tr><tr><td>Sulfate de cuivre(II) pentahydraté</td><td>Merck-Millipore</td><td>102790</td><td></td></tr><tr><td>Diméthylsulfoxyde</td><td>Merck-Millipore</td><td>802912</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline</td><td>Biological Industries</td><td>02-023-5A</td><td></td></tr><tr><td>Acide éthacrynique</td><td>Tokyo Chemical Industry Co. Ltd</td><td>E0526</td><td></td></tr><tr><td>Glutathion-s-transférase M1-1</td><td>Israel Structural Proteomics Center (Weizmann Institute of Science, Rehovot, Israël)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>JS-K</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>J4137</td><td></td></tr><tr><td>L-glutathion réduit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G4251</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure de magnésium</td><td>J.T.Baker</td><td>0162</td><td></td></tr><tr><td>nitrate/nitrite kit de dosage colorimétrique</td><td>Cayman Chemical</td><td>780001</td><td></td></tr><tr><td>Oligonucléotides</td><td>W. M. Keck Fondation Biotechnologie à l’Université</td><td></td> de Yale <td>commande personnalisée</td></tr><tr><td>PDGF-BB</td><td>Centre de Protéomique Structurale d’Israël (Weizmann Institute of Science, Rehovot, Israël)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TBTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>678937</td><td></td></tr><tr><td>Triethylamine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T0886</td><td></td></tr><tr><td>Colonne de dessalage</td><td>GE Healthcare</td><td>illustra MicroSpin G-25 Colonnes</td><td></td></tr><tr><td>HPLC</td><td>Waters&nbsp ;</td>Module <td></td><td>de séparation 2695</td></tr><tr><td>Colonne HPLC</td><td>Waters</td><td>XBridgeTM OST C18 colonne (2.5 &mu ; M, 4,6 mm & temps ; 50 mm)</td><td></td></tr><tr><td>Colonne HPLC</td><td>Waters</td><td>XBridgeTM OST C18 (2,5 pouces &mu ; M, 10 mm & temps ; 50 mm)</td><td></td></tr><tr><td>Lecteur de plaques</td><td>BioTek</td><td>synergy H4 hybrid</td><td></td></tr></tbody></table>

imitant la fonction des protéines de signalisation: vers artificial signal therapy transduction

Mimicking the Function of Signaling Proteins: Toward Artificial Signal Transduction Therapy

Les voies de transduction du signal, qui contrôlent la réponse des cellules à divers signaux environnementaux, sont médiées par la fonction des protéines de signalisation qui interagissent les unes avec les autres et s’activent mutuellement avec une spécificité élevée. Des agents synthétiques qui imitent la fonction de ces protéines pourraient donc être utilisés pour générer des étapes de transduction de signal non naturelles et, par conséquent, modifier la fonction de la cellule. Nous présentons des lignes directrices pour la conception de « transducteurs chimiques » capables d’induire une communication artificielle entre les protéines natives. De plus, nous présentons des protocoles détaillés pour synthétiser et tester un « transducteur » spécifique, qui peut induire la communication entre deux protéines non apparentées : le facteur de croissance dérivé des plaquettes (PDGF) et la glutathion-S-transférase (GST). La manière dont cette communication non naturelle PDGF-GST pourrait être utilisée pour contrôler le clivage d’un promédicament anticancéreux est également présentée, indiquant le potentiel d’utilisation de tels systèmes dans la « thérapie de transduction de signal artificiel ». Ce travail vise à faciliter le développement de « transducteurs » supplémentaires de cette classe, qui peuvent être utilisés pour médier la communication protéine-protéine intracellulaire et, par conséquent, pour induire des voies de signalisation cellulaire artificielles.

La conception, la synthèse et le mécanisme d&#39;action d&#39;un «capteur chimique» qui peut induire la communication artificielle entre PDGF et la TPS sont présentés dans la figure 2. La structure du «transducteur» intègre un aptamère PDGF ADN et un amide bis-éthacrynique (Bea ), qui est un inhibiteur connu de la GST (figure 2a). 19 Ces liants permettent le «transducteur» pour se lier à la fois le PDGF et GST avec des affinités différentes, à...

Nous présentons des lignes directrices pour le développement de 'transducteurs chimiques' synthétiques capables d’induire la communication entre des protéines naturellement non apparentées. De plus, des protocoles détaillés sont présentés pour synthétiser et tester un « transducteur » spécifique qui permet à un facteur de croissance d’activer une enzyme détoxifiante et, par conséquent, de réguler le clivage d’un promédicament anticancéreux.

Imitant la fonction des protéines de signalisation: Vers Artificial Signal Therapy transduction

Signal transduction pathways, which control the response of cells to various environmental signals, are mediated by the function of signaling proteins ...

L'objectif général de cette expérience est de suivre spectroscopiquement la communication artificielle entre deux protéines induite par un transducteur chimique synthétique. Cela démontrera la possibilité de développer des analogues synthétiques de protéines de signalisation capables d'effectuer des voies de transduction de signal inexistantes dans la nature. La capacité de suivre la communication artificielle entre protéines à l'aide d'un spectrophotomètre courant pourrait aider à concevoir et améliorer la fonction de transducteurs chimiques artificiels, nous rapprochant ainsi d'une thérapie de transduction de signal artificielle.Le transducteur chimique est composé d'un aptamère de facteur de croissance dérivé des plaquettes, ou PDGF, d'un inhibiteur bivalent de la GST, l'amide d'éthacrynique, d'un fluorophore et d'un inhibiteur de fluorescence. La synthèse du transducteur chimique ne sera pas démontrée dans cette vidéo.Mais est décrit dans le protocole textuel. Les principes de fonctionnement du transducteur chimique sont illustrés ici. Le transducteur chimique inhibe l'activité enzymatique de la GST lorsque les deux groupes EA se lient aux sites actifs de l'enzyme.L'ajout de PD

mimicking-function-signaling-proteins-toward-artificial-signal

Research

Recherche

JoVE Journal

Biochemistry

Biochimie

Activation persistante des inhibiteurs G récepteurs couplés aux protéines résultats dans la sensibilisation de la signalisation de l'adénylcyclase. Pour identifier les voies moléculaires essentiels, les approches non biaisée sont nécessaires, mais, cette stratégie nécessite le développement d'un test AMPc de sensibilisation à base de cellules évolutive. Ici, nous décrivons un test de sensibilisation pour une petite molécule et le dépistage siRNA.

Sensibilisation à la drogue induit des adénylylcyclase: Rationalisation de dosage et la miniaturisation des petites molécules et siARN préalable Applications

La méthode décrite ici est utilisée pour induire la cascade de signalisation apoptotique à des étapes définies afin de disséquer l’activité d’une protéine effectrice bactérienne anti-apoptotique. Cette méthode peut également être utilisée pour l’expression inductible de protéines pro-apoptotiques ou toxiques, ou pour disséquer l’interférence avec d’autres voies de signalisation.

L&#39;application d&#39;un système d&#39;expression inductible pour étudier les interférences de facteurs de virulence bactérienne avec signalisation intracellulaire

Ce protocole décrit une stratégie opto-génétique pour moduler l'activité de la protéine kinase activée par mitogène (MAPK) pendant la différenciation cellulaire et le développement embryonnaire de Xenopus . Cette méthode permet l'activation réversible de la voie de signalisation MAPK dans la culture de cellules de mammifères et dans les organismes vivants multicellulaires, comme les embryons de Xenopus , avec une résolution spatiale et temporelle élevée.

Modulation réversible médiée par la lumière du pathogène protéinique Kinase activé par Mitogen pendant la différenciation cellulaire et<em&gt; Xenopus</em&gt; Développement embryonnaire

Nous présentons ici un protocole pour les alignements d’anticorps identifier les altérations dans les voies de signalisation dans divers modèles cellulaires. Ces changements, causées par les médicaments/hypoxie/ultra-ultra-violet lumière/rayonnement, ou par surexpression/régulation/débouchures, sont importants pour les différents modèles de la maladie et peuvent indiquer si une thérapie sera efficace ou peut identifier des mécanismes de médicaments résistance.

Évaluation de la résistance aux inhibiteurs de Tyrosine Kinase par un interrogatoire des voies de Transduction de Signal par les alignements d’anticorps

Décrit ici est un protocole pour caractériser des modules des miRNAs biologiquement synergiques et de leur assemblage en transgènes courts, qui permet la surexpression simultanée pour des applications de thérapie génique.

Caractérisation des miARN fonctionnellement associés dans le Glioblastoma et leur ingénierie en grappes artificielles pour la thérapie génique

La manipulation optogénétique des voies de signalisation peut être une stratégie puissante pour étudier comment la signalisation est décodée dans le développement, la régénération, l’homéostasie et la maladie. Ce protocole fournit des directives pratiques pour l’utilisation d’activateurs de signalisation nodaux et de protéines morphogéniques osseuses (BMP) basés sur le domaine de détection lumière-oxygène-tension dans l’embryon précoce du poisson-zèbre.

Activation de la signalisation optogénétique chez les embryons de poisson-zèbre

La liaison à la guanosine triphosphate (GTP) est l'un des premiers événements dans l'activation du récepteur couplé aux protéines G (GPCR). Ce protocole décrit comment caractériser pharmacologiquement des interactions spécifiques de GPCR-ligand en surveillant la liaison de l'analogue GTP radio-marqué, [ 35 S] guanosine-5'-O- (3-thio) triphosphate ([ 35 S] GTPγS), en Réponse à un ligand d'intérêt.

Mesure de la signalisation des récepteurs couplés à la protéine G via liaison GTP radiomarquée

La composition protéique de la valvule mitrale humaine est encore partiellement inconnue, car son analyse est compliquée par une faible cellularité et donc par une faible biosynthèse des protéines. Ce travail fournit un protocole pour extraire efficacement les protéines pour l'analyse du protéome de la valvule mitrale.

Protocole optimisé pour l&#39;extraction de protéines à partir de la soupape mitrale humaine

Cette méthode décrit le clonage, expression et purification de Nsa1 recombinant pour détermination structurale par diffraction des rayons x et la diffusion des rayons x de petits angles (SAXS) et est applicable pour l’analyse structurale de l’hybride d’autres protéines contenant à la fois ordonnée et désordonnée des domaines.

Combinant la diffractométrie de rayons x avec la diffusion des rayons x petit Angle pour modéliser des régions non structurées de Nsa1 de S. Cerevisiae

Nous démontrons une nouvelle méthode pour la construction d’une single-cell-based 3 Dimensions (3D) l’Assemblée sans un échafaudage artificiel.

Manipulation de cellules vivantes pour construire Stable Assemblée cellulaire 3D sans échafaudage artificiel

Découvrez la conception de transducteurs chimiques synthétiques pour activer une communication protéique artificielle entre le PDGF et la GST. Cette méthode spectroscopique ouvre la voie à de nouvelles stratégies thérapeutiques en transduction du signal.

Imitant la fonction des protéines de signalisation: Vers Artificial Signal Therapy transduction

Explorer plus de vidéos