Name: Isolement de lipoprotéines de haute densité pour les non-codant petit ARN Quantification (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-28T12:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 39 s
Description: Découvrez l'isolement des lipoprotéines de haute densité pour quantifier les petits ARN non codants. Cette méthode permet d'analyser les signatures d'ARN dans les maladies cardiométaboliques.

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Ce travail a été soutenu par des prix décernés par les National Institutes of Health, le National Heart, Lung and Blood Institute à K.C.V. HL128996, HL113039 et HL116263. Ce travail a également été soutenu par des prix de l’American Heart Association à K.C.V. CSA2066001, D.L.M POST26630003 et R.M.A. POST25710170.

1. La purification HDL (~ 5,5 jours) <ol><li> Densité-Gradient ultracentrifugation (DGUC, ~ 5 jours) <ol><li> Ajouter 90 ul de 100x anti-oxydants à 9 ml de plasma isolé à partir de sang veineux frais. </li><li> Ajuster la densité du plasma avec KBr de 1,006 g / mL à 1,025 g / mL en ajoutant 0,251 g KBr à 9 ml de plasma de l&#39;étape 1.1.1 (0,0278 g / KBr ml de plasma). Rock the plasma jusqu&#39;à ce que tout le sel est dissous à la température ambiante et transfert à ultracentrifugation tubes et faire en sorte que toutes les bulles remontent à la surface. </li><li> Pliez la pointe d&#39;une aiguille de 18 G à 90 ° 1 cm de la pointe, côté conique vers le haut. En utilisant une seringue et l&#39;aiguille de calibre 18, placer soigneusement 3 ml de solution de superposition n ° 1 sur le plasma (tableau 1). REMARQUE: L&#39;aiguille pliée assure tous les VLDL / IDL, LDL et HDL sont éliminés sans mélange avec la superposition. </li><li> Retirer la majorité des bulles dans la partie supérieure, en laissant 2 - 3 mm, l&#39;espace à partir du ménisque à l&#39;extrémité supérieure du tube et savouplacer lly les tubes dans des seaux SW-40Ti. </li><li> Peser chaque godet (avec les bouchons) sur la balance, et d&#39;équilibrer exactement avec le seau opposé (seau + cap): # 1 à # 4, # 2 à # 5 et # 3 à # 6. NOTE: Ces seaux doivent être équilibrés et adapté à tout moment. </li><li> Placez rotor dans ultracentrifugation (Liste des Matériaux). Centrifugeuse à 274.400 xg pendant 24 h à 4 ° C avec un frein intermédiaire n ° 4. </li><li> Retirez soigneusement les seaux de rotor et les tubes des seaux. </li><li> Retirez délicatement 2 mL de la couche supérieure du revêtement à l&#39;aide d&#39;une seringue et une aiguille recourbée. Ce sera la fraction VLDL / IDL qui peut être stocké à 4 -80 ° C ou ° C. </li><li> Après avoir enlevé la fraction VLDL / IDL, recueillir les 7 ml restants de l&#39;échantillon (plasma) et le placer dans un tube de 15 ml conique. Amener le volume de l&#39;échantillon jusqu&#39;à 9 ml avec une solution de revêtement # 2 (Tableau 1). </li><li> Réglez la densité de l&#39;échantillon de 1,025 g / mL à 1,080 g / mL avec KBr en utilisantenviron 0,746 g KBr dans l&#39;échantillon 9 ml ou 0,0828 g / KBr mL d&#39;échantillon. Secouez doucement l&#39;échantillon jusqu&#39;à ce que tout le KBr est dissous (environ 20 min) et transfert à l&#39;ultracentrifugation tube tout en assurant des bulles remontent à la surface. </li><li> Avec une seringue et une aiguille, placer soigneusement 3 ml de solution de recouvrement n ° 3 sur l&#39;échantillon (tableau 1). Laissez 2 - 3 mm d&#39;espace de ménisque à la partie supérieure du tube. </li><li> Retirez la majorité des bulles restantes dans la partie supérieure du tube et placer soigneusement les tubes d&#39;ultracentrifugation remplis dans des seaux SW-40Ti. </li><li> Peser chaque godet (avec les bouchons) sur la balance, et d&#39;équilibrer exactement avec le seau face + bouchon, comme dans 1.1.5. </li><li> Placez rotor dans ultracentrifugation (voir la liste des matériaux). Centrifugeuse à 274.400 xg pendant 24 h à 4 ° C avec un frein intermédiaire n ° 4. </li><li> Retirez soigneusement les seaux de rotor et les tubes des seaux. </li><li> Retirez délicatement 2 mL de la couche supérieure du revêtement à l&#39;aide d&#39;une seringue et d&#39;êtreaiguille nt. Ce sera la fraction LDL qui peut être stocké à 4 -80 ° C ou ° C. </li><li> Après avoir retiré la fraction LDL, recueillir les approximatives restantes 7 ml d&#39;échantillon (plasma) et le placer dans un nouveau tube de 15 ml conique. Amener le volume de l&#39;échantillon (plasma) jusqu&#39;à 9 mL avec 1,080 g / ml de la solution n ° 4 (Tableau 1). </li><li> Réglez la densité de l&#39;échantillon de 1.080 g / mL à 1,30 g / mL avec KBr en utilisant 3,33 g KBr dans le 9 ml d&#39;échantillon (plasma) ou 0,37 g KBr pour chaque ml d&#39;échantillon. Roche ou légèrement agiter l&#39;échantillon jusqu&#39;à ce que tous les KBr (sel) est dissous et transfert à l&#39;ultracentrifugation tube. </li><li> Avec une seringue et une aiguille, placer soigneusement 3 ml de solution de recouvrement n ° 5 sur l&#39;échantillon (tableau 1). </li><li> Retirez la majorité des bulles restantes dans la partie supérieure du tube, en laissant 2 à 3 mm d&#39;espace de ménisque au sommet du tube et placer soigneusement les tubes d&#39;ultracentrifugation remplis dans des seaux SW-40Ti. </li><li> Peser chaque godet (avec les bouchons) sur la balance, et exactement l&#39;équilibre avec le seau face + bouchon, comme dans 1.1.5. </li><li> Placez rotor dans ultracentrifugation (voir la liste des matériaux). Centrifuger à 274 400 xg pendant 48 h à 4 ° C avec un frein # 4. </li><li> Retirez soigneusement les seaux de rotor et les tubes des seaux. </li><li> Retirez délicatement environ 2 mL de la couche supérieure du revêtement à l&#39;aide d&#39;une seringue et une aiguille recourbée. Ceci est la fraction de HDL, qui peut être stocké à 4 ° C ou -80 ° C. NOTE: Après HDL DGUC peut être dialysée pour éliminer les solutions riches en sel. </li><li> Pour dialyser, placer la fraction HDL recueillie dans un manchon de dialyse étanche (10.000 mw cut-off) et dialyser la nuit dans 1 L 1x PBS. tampon Changement de dialyse (1x PBS) 3 fois plus de 24 h. perturbation douce du PBS avec une barre d&#39;agitation magnétique permettra d&#39;améliorer la dialyse. </li><li> Déterminer la concentration en protéines de la DGUC HDL en utilisant une méthode BCA 8. </li></ol></li><li> Fast Protein Liquid Chrochromatogra- (FPLC) ou Taille-chromatographie d&#39;exclusion (~ 6 h) <ol><li> Filtre 1,2 mg de DGUC-HDL (protéine totale) dans 500 pi à travers un filtre um micro-centrifuge 0,22 (voir la liste des matériaux), immédiatement avant l&#39;injection. NOTE: Un filtrage supplémentaire de l&#39;échantillon DGUC-HDL à travers un filtre um micro-centrifuge avant le filtre de 0,22 um 0,45 peut être nécessaire pour certains échantillons. </li><li> Recueillir l&#39;échantillon DGUC-HDL filtré, charger le FPLC (remplissage) seringue d&#39;injection, et assurer qu&#39;il n&#39;y a pas de bulles dans la seringue avant injection dans la FPLC. </li><li> Réglez le débit FPLC à 0,3 mL / min avec une limite de pression à 2,6 MPa. Equilibrer colonnes avec 0,2 volumes de colonne (environ 15 ml) de tampon, avant l&#39;injection de l&#39;échantillon. Injecter l&#39;échantillon avec 3 ml de tampon dans la FPLC (boucle d&#39;injection) instrument et commencer la course. Recueillir 1,5 ml fractions pour un total de 72 fractions. </li></ol></li></ol> 2. Haut-débit Petit ARNSéquençage (sRNAseq, ~ 9 jours) <ol><li> Isolement de l&#39; ARN (~ 1 jour) <ol><li> Identifier les fractions FPLC correspondant à DGUC-HDL en déterminant les niveaux de cholestérol total en utilisant un kit colorimétrique selon les instructions du fabricant. L&#39;utilisation de ce FPLC set-up, attendre à trouver 6 - 7 fractions FPLC contenant DGUC-HDL. </li><li> Recueillir tout le volume (environ 8 -1 0 ml piscine de 1,45 fraction mL volumes) à partir de fractions DGUC-HDL FPLC et de se concentrer à l&#39;aide de 10 kDa mw unités de filtre centrifuge de coupure à 4000 g pendant 1 h à 4 ° C ou jusqu&#39;à ce que HDL concentré est d&#39;environ 100 pi. </li><li> Recueillir le concentré de cholestérol HDL et de quantifier la concentration totale en protéines HDL en utilisant la méthode BCA 8. </li><li> Déterminer la plus forte concentration de HDL protéine totale, jusqu&#39;à 1 mg, qui peut être aliquote de chaque échantillon dans l&#39;ensemble. Par exemple, isoler l&#39;ARN à partir de la même quantité de protéines totales HDL pour chaque échantillon. </li><li> Effectuer Isolement de l&#39;ARN en utilisantun protocole modifié (voir la liste des matériaux). <ol><li> Ajouter 10x volume de réactif phénol de lyse (voir la liste des matériaux) échantillon et vortex pendant 1 min. </li><li> Incuber à température ambiante pendant 5 min. </li><li> Ajouter le chloroforme (20% du volume de réactif phénol de lyse utilisé dans l&#39;étape 2.1.5.1) et agiter vigoureusement pendant 15 s. </li><li> Incuber à température ambiante pendant 2 - 3 min. </li><li> Centrifuger pendant 15 min à 12 000 xg à 4 ° C dans une centrifugeuse réfrigérée. </li><li> Transférer la phase aqueuse supérieure dans un nouveau tube, évitant l&#39;interphase. </li><li> Ajouter le volume 1,5x de 100% d&#39;éthanol à la phase aqueuse et vortexer pendant 1 min. </li><li> Conserver les échantillons pendant au moins 1 h ou toute la nuit à -80 ° C. </li><li> Poursuivre le protocole d&#39;isolement d&#39;ARN en utilisant des mini-colonnes fournies. </li><li> Eluer avec 30 H pl de RNase 2 O. Tout d&#39; abord , ajouter 15 pi de H 2 O directement à la fritte, rotation à faible vitesse (2000 xg) pendant 2 min, etpuis tourner à grande vitesse (max) pendant 1 min. Répétez cette étape avec un 15 pi supplémentaires de H 2 O. </li></ol></li><li> procéder immédiatement à la génération ou un magasin bibliothèque ARNs à -80 ° C. </li></ol></li><li> Generation Library (~ 6 h) <ol><li> Préparer des banques d&#39;ADNc ARNs en utilisant le protocole du kit de génération de bibliothèque ARNs, conformément aux instructions du fabricant avec une modification de l&#39;amplification par PCR comme indiqué ci-dessous. <ol><li> Préparer la mastermix PCR sur la glace contenant 0,5 pi de DNase / RNase H 2 O, 15 Mix PCR uL (PML) et Primer (de RP1) par échantillon (y compris 10% supplémentaires pour le pipetage erreur) 1 ul ARN PCR. </li><li> Ajouter 16,5 ul de la PCR se mélangent à chaque (ADNc) échantillon. </li><li> Attribuez un numéro d&#39;index / code à barres pour chaque échantillon pour le multiplexage et ajouter 1 pl PCR Primer Index (au nombre correspondant) à l&#39;échantillon. </li><li> Effectuer une rotation rapide à l&#39;aide de la microcentrifugeuse. NOTE: Le volume total devraitmaintenant 30 pi par échantillon. </li><li> Effectuez les conditions de cycle pour l&#39; amplification par PCR comme indiqué dans les tableaux 2 et 3. </li></ol></li></ol></li><li> Taille Sélectionnez ARNs Library pour supprimer Adapter: adaptateurs (~ 1,5 h) <ol><li> Effectuer bibliothèque taille-sélection en utilisant le sélecteur automatique de la taille de l&#39;ADN selon les instructions du fabricant avec les paramètres de taille suivantes: Cible: 156 pb, Début: 135 pb, End: 177 pb, Drapeau Range: Broad. </li></ol></li><li> DNA Clean Up (~ 0,5 h) <ol><li> Nettoyer la taille sélectionnée ARNs ADNc selon les instructions du fabricant. </li><li> Eluer propre et concentrée ARNs ADNc avec 2 x 7 pi DNase / RNase H 2 O. </li></ol></li><li> Quantifier et évaluer les ARNs bibliothèque d&#39; ADNc rendement et la qualité (~ 1 h) <ol><li> Évaluer la qualité bibliothèque ARNs ADNc et la taille en utilisant une puce à ADN à haute sensibilité sur une Bioanalyseur (Liste des Matériaux) selon manufactles instructions rier. </li><li> Quantifier les concentrations de bibliothèque ARNs d&#39;ADNc individuels en utilisant un test d&#39;ADN à haute sensibilité (Liste des matériaux), selon les instructions du fabricant. NOTE: Il est recommandé d&#39;avoir tous les échantillons avec différents indices être exécutés sur la même voie de la cellule d&#39;écoulement si possible. Si plus d&#39;une voie est nécessaire, mélanger les échantillons de cas et de contrôle de manière appropriée. </li></ol></li><li> Haut-débit ARNs Sequencing (~ 7 jours) <ol><li> Piscine individuelle indexée bibliothèques ARNs en fonction des concentrations équimolaires. </li><li> Écran mis en commun des bibliothèques ARNs pour la qualité en utilisant la puce à ADN à haute sensibilité sur le Bioanalyseur et déterminer la concentration en ADN de la banque comme dans 2.5.1 - 2.5.2. </li><li> Effectuer la PCR quantitative (qPCR) du contenu de l&#39;adaptateur pour assurer la profondeur de séquençage approprié à l&#39;aide de la bibliothèque de séquençage kit qPCR de quantification selon les instructions du fabricant (Liste des Matériaux). </li><li> Effectuer le séquençage en utilisant une seule lecture, 50 bprotocole de p pour atteindre une profondeur d&#39;environ 20 à 25 M lit / échantillon, selon les instructions du fabricant. </li></ol></li></ol> 3. Analyse des données (~ 1 jour) <ol><li> Utilisez bcl2fastq2, selon les instructions de guidage de l&#39;utilisateur, aux fichiers fastq premières prétraiter des échantillons démultiplexés (Liste des Matériaux). </li><li> Utilisez Cutadapt pour couper les adaptateurs 9 et enlever lit &lt;16 nucléotides (nt) de longueur, selon les instructions utilisateur de guidage (Liste des Matériaux). </li><li> Retirer les séquences de contamination présents dans les bibliothèques ARNs, y compris la séquence de solution d&#39;arrêt (STP: CCACGTTCCCGTGG) et adaptateur report (CTACAGTCCGACGATC) en utilisant la fonction removeSequenceInFastq dans le cadre NGSPERL, selon les instructions utilisateur de guidage (Liste des Matériaux). </li><li> Effectuer des mesures de contrôle de la qualité par FastQC l&#39;aide du Centre pour les sciences quantitatives (CQS) outils, selon les instructions utilisateur de guidage (Liste des Matériaux). </li><li> Générer liste non redondante de «identique» lit (effondrement redundant lit) et le nombre de copies d&#39;enregistrement en utilisant CQSTools, selon les instructions utilisateur de guidage (Liste des Matériaux). </li><li> Alignez lit à génome humain en utilisant Bowtie1.1.2 permettant 1 mismatch (options: -a -m 100 --best --strata -v 1), selon les instructions utilisateur de guidage (Liste des Matériaux). </li><li> Effectuer lire l&#39;alignement, le comptage, et entraîner des tâches de récapitulation en utilisant NGSPERL, selon les instructions de guidage de l&#39;utilisateur. </li><li> Convertir table de comptage exporté vers un fichier tableur. </li><li> Normaliser lit d&#39;une classe spécifique (par exemple, miARN) au nombre total de lectures pour cette classe (par exemple, le nombre total de miARN lectures) et des signaux de rapport en tant Reads miRNA Per mappé (de RPMM). (Par exemple, RPMM = (miR-X / Nombre total de miRNA lectures) * 1000000). </li><li> Entrée normalisée table de comptage que la technologie de couleur unique générique dans le logiciel pour le niveau bas et différencié de haut niveau des analyses selon les instructions utilisateur de guidage (Liste des Matériaux). NOTE: Actuellement, il y a des gènes de ménage pas bien caractérisées / SRNEn ce qui concerne le HDL-ARNs. Un contrôle de pic-in peut être utilisé, mais peut être problématique. Normaliser HDL entrée de la protéine ou le volume total est conseillé. Plus important encore, il est recommandé de valider les résultats de séquençage par l&#39;une des différentes stratégies pour quantifier miARN et ARNs en utilisant PCR en temps réel ou PCR quantitative. </li></ol>

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<li>Chen, S. Y., Wang, Y., Telen, M. J., Chi, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genomic+analysis+of+erythrocyte+microRNA+expression+in+sickle+cell+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">The genomic analysis of erythrocyte microRNA expression in sickle cell diseases.</a> PLoS One. 3, e2360(2008).</li>
<li>Balzano, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((miRNA+Stability+in+Frozen+Plasma+Samples%5BTitle%5D)+AND+%22Molecules%22%5BJournal%5D)">miRNA Stability in Frozen Plasma Samples.</a> Molecules. 20, 19030-19040 (2015).</li>
<li>Redgrave, T. G., Roberts, D. C., West, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Separation+of+plasma+lipoproteins+by+density-gradient+ultracentrifugation%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Separation of plasma lipoproteins by density-gradient ultracentrifugation.</a> Anal Biochem. 65, 42-49 (1975).</li>
<li>Cheung, M. C., Wolf, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+effect+of+ultracentrifugation+on+apolipoprotein+A-I-containing+lipoprotein+subpopulations%5BTitle%5D)+AND+%22J+Lipid+Res%22%5BJournal%5D)">Differential effect of ultracentrifugation on apolipoprotein A-I-containing lipoprotein subpopulations.</a> J Lipid Res. 29, 15-25 (1988).</li>
<li>Kunitake, S. T., Kane, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Factors+affecting+the+integrity+of+high+density+lipoproteins+in+the+ultracentrifuge%5BTitle%5D)+AND+%22J+Lipid+Res%22%5BJournal%5D)">Factors affecting the integrity of high density lipoproteins in the ultracentrifuge.</a> J Lipid Res. 23, 936-940 (1982).</li>
<li>Laurent, L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Meeting+report%3A+discussions+and+preliminary+findings+on+extracellular+RNA+measurement+methods+from+laboratories+in+the+NIH+Extracellular+RNA+Communication+Consortium%5BTitle%5D)+AND+%22J+Extracell+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Meeting report: discussions and preliminary findings on extracellular RNA measurement methods from laboratories in the NIH Extracellular RNA Communication Consortium.</a> J Extracell Vesicles. 4, 26533(2015).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Ce protocole est conçu pour quantifier miARN et d&#39;autres ARNs par séquençage à haut débit ou PCR en temps réel sur le HDL très pur. Comme pour toute approche, des considérations particulières devraient être données à chaque étape du processus de purification de HDL et de l&#39;ARN, puis quantifier ARNs. Ce protocole est conçu pour des projets commençant par ≥ 2 mL de plasma. Néanmoins, des analyses d&#39;ARN de haute qualité peuvent être complétés avec succès HDL purifié à partir d&#39;aussi peu que 80 pi de plasma ...

Extracellulaires non codantes petits ARN (ARNs) représentent une nouvelle classe de biomarqueurs de la maladie et des cibles thérapeutiques potentielles et susceptibles de faciliter la cellule à cellule communication 1. Le type le plus largement étudié des ARNs sont microARN (miARN) qui sont environ 22 nts de longueur et sont traités de plus longues formes précurseurs et transcrits primaires 2. miARN a été démontré que la post-transcriptionnel réguler l&#39; expression génique par la suppression de la conversion des protéines et de l&#39; induction de la dégradation de l&#39; ARNm 2. Néanmoins, les miARN sont juste un des nombreux types de ARNs; comme ARNs peuvent être clivés de ARNt mères (des ARNs ARNt dérivés, TDR), petits ARN nucléaires (ARNs ARNs dérivés, sndRNA), petits ARN nucléolaires (des ARNs snoRNA dérivés, snARN), ARNs ribosomiques (ARNs, rdr ARNr dérivé ), Y (ARN ydr) et d&#39; autres divers ARNs 1. Quelques exemples de ces nouveaux ARNs ont été rapportés à fonction similaire à celle miARN; cependant, le fu biologiquenctions de beaucoup de ces ARNs reste à déterminer, bien que les rôles dans la régulation des gènes sont susceptibles 3-6. Le plus intéressant, et d&#39;autres miARN ARNs sont présents de manière stable dans les fluides extra-cellulaires, y compris la salive, le plasma, l&#39;urine et la bile. ARNs extracellulaires sont probablement protégés de RNases par leur association avec des vésicules extracellulaires (EV), les lipoprotéines, et / ou complexes de ribonucléoprotéines extracellulaires. Auparavant, nous avons signalé que les lipoprotéines, à savoir les lipoprotéines de haute densité (HDL), miARN de transport dans le plasma 7. Dans cette étude, les HDL ont été isolés à l&#39;aide d&#39;un procédé séquentiel d&#39;une ultracentrifugation en gradient de densité (DGUC), la chromatographie liquide rapide de protéines (par exclusion de taille sur gel de chromatographie de filtration, FPLC) et la Chromatographie d&#39;affinité (AI anti- apolipoprotéine (apoA-I) immunoprécipitation ) 7. En utilisant les deux en temps réel basés sur la PCR des réseaux à faible densité et des essais de miARN individuels, les niveaux de miARN ont été quantifiés sur HDL isolés de guérirton et les sujets hypercholestérolémiques 7. En utilisant cette approche, nous avons pu le profil de miARN et quantifier miARN spécifiques dans des préparations de HDL très pures. Depuis 2011, nous avons déterminé que, bien que la chromatographie d&#39;affinité améliore la pureté de HDL, la saturation des anticorps limite fortement le rendement, et peut être un coût prohibitif. Actuellement, notre protocole recommande une méthode tandem séquentielle en deux étapes de DGUC suivie par FPLC, qui produit également des échantillons de HDL de haute qualité pour l&#39;isolement en aval de l&#39;ARN et ARNs quantification. En raison des récents progrès dans le séquençage à haut débit de ARNs (sRNAseq), par exemple, miARN et la prise de conscience accrue des autres classes non-miARN ARNs, sRNAseq est l&#39;état actuel de la technique dans miRNA et ARNs profilage. En tant que tel, notre protocole recommande miARN quantifier et d&#39;autres ARNs sur des échantillons HDL utilisant sRNAseq. Néanmoins, l&#39;ARN total isolé de HDL peut également être utilisé pour quantifier les miARN individuels et d&#39;autres ARNs ou de valider les résultats de sRNAseq en utilisant PCR en temps réel unepproches. Ici, nous décrivons en détail un protocole pour la collecte, la purification, la quantification, l&#39;analyse des données, et la validation de haute pureté HDL-ARNs. L&#39;objectif global de cet article est de démontrer la faisabilité et le processus de ARNs quantification dans HDL très pur isolé du plasma humain.

<table><tbody><tr><td>Ultracentrifugeuse&nbsp ;</td><td>Beckman Coulter</td><td>A99839</td><td>Optima XPN-80</td></tr><tr><td>Rotor d’ultracentrifugeuse</td><td>Beckman Coulter</td><td>331362</td><td>SW-41Ti</td></tr><tr><td>AKTA Pure FPLC Système</td><td>GE Healthcare</td><td>29018224</td><td></td></tr><tr><td>3x FPLC Superdex 200 Colonnes d’augmentation en ligne</td><td>GE Healthcare</td><td>28990944</td><td>10/300 gl</td></tr><tr><td>SynergyMx</td><td>BioTek Instruments</td><td>7191000</td><td></td></tr><tr><td>Tabletop centrifugeuse</td><td>Thermo Scientific</td><td>75004525</td><td>Sorvall ST40R</td></tr><tr><td>Centrifugeuse réfrigérée</td><td>Eppendorf</td><td>22629867</td><td>5417R (achetée auprès de USA Scientific)</td></tr><tr><td>Microfuge&nbsp ;</td><td>USA Scientific</td><td>2631-0006</td><td></td></tr><tr><td>Bioanalyseur PippenPrep</td><td>Sage Science</td><td>PIP0001</td><td></td></tr><tr><td>2100&nbsp ;</td><td>Agilent</td><td>G2938B</td><td></td></tr><tr><td>Dosage de l’ADN haute sensibilité</td><td>Agilent</td><td>5067-4626</td><td></td></tr><tr><td>Bibliothèque de séquençage Kit de quantification qPCR</td><td>Illumina</td><td>SY-930-1010</td><td></td></tr><tr><td>ProFlex Thermal Cycler</td><td>Applied Biosystems</td><td>4484073</td><td></td></tr><tr><td>QuantStudio 12k Flex</td><td>Applied Biosystems</td><td>4471134</td><td></td></tr><tr><td>EpMotion Robot Eppendorf</td><td></td><td>960000111</td><td>5070</td></tr><tr><td>Tubes à centrifuger ultra-clairs</td><td>Beckman Coulter</td><td>344059</td><td></td></tr><tr><td>Bromure de potassium</td><td>Fisher Chemicals</td><td>P205-500</td><td></td></tr><tr><td>Tube conique 15 mL</td><td>Thermo Scientific</td><td>339650</td><td></td></tr><tr><td>Filtres micro-centrifuges 0,45 & micro ; m</td><td>Millipore</td><td>UFC30HV00</td><td></td></tr><tr><td>Filtres micro-centrifuges 0,22 & micro ; m</td><td>Millipore</td><td>UFC30GV00</td><td></td></tr><tr><td>miRNAEasy Total RNA Isolation Kits</td><td>Qiagen</td><td>217004</td><td></td></tr><tr><td>Total Cholesterol colormetric</td><td>kit Cliniqa (Raichem)</td><td>R80035</td><td></td></tr><tr><td>10 000 m.w. filtre de centrifugation à coupure</td><td>Amicon</td><td>UFC801024</td><td>acheté via Millipore</td></tr><tr><td>PCR Tubes de bandelettes</td><td>Axygen</td><td>PCR-0208-C</td><td>acheté via Fisher</td></tr><tr><td>microARN Kit RT</td><td>Life Technologies</td><td>4366597</td><td>Pour 1000 réactions</td></tr><tr><td>PCR Master mix</td><td>Life Technologies</td><td>4440041</td><td>Flacon de 50 mL</td></tr><tr><td>Kit Pierce BCA</td><td>Thermo Scientific</td><td>23225</td><td></td></tr><tr><td>Kit de nettoyage et de concentration</td><td>Zymo</td><td>D4014</td><td></td></tr><tr><td>Tubulure de dialyse</td><td>Spectrum Labs</td><td>132118</td><td>acheté auprès de Fisher</td></tr><tr><td>bcl2fastq2</td><td>Illumina</td><td>n/a</td><td>Software</td></tr><tr><td>Cutadapt</td><td>https://github.com/marcelm/cutadapt</td><td>n/a</td><td>Software</td></tr><tr><td>NGSPERL</td><td>github.com/shengqh/ngsperl</td><td>n/a</td><td>Software</td></tr><tr><td>CQSTools</td><td>github.com/shengqh/CQS.Tools</td><td>n/a</td><td>Software</td></tr><tr><td>Bowtie 1.1.2&nbsp ;</td><td>http://bowtie-bio.sourceforge.net</td><td>n/a</td><td>Logiciel</td></tr><tr><td>GeneSpringGX13.1.1</td><td>Agilent</td><td>n/a</td><td>Logiciel</td></tr></tbody></table>

isolement de lipoprotéines de haute densité pour les non-codant petit arn quantification

Isolation of High-density Lipoproteins for Non-coding Small RNA Quantification

La diversité des petits ARN non codants (ARNs) est en pleine expansion et leur rôle dans les processus biologiques, y compris la régulation des gènes, sont en train d&#39;émerger. Le plus intéressant, ARNs sont également trouvés à l&#39;extérieur des cellules et sont présents de manière stable dans tous les fluides biologiques. En tant que tel, ARNs extracellulaires représentent une nouvelle classe de biomarqueurs de la maladie et sont probablement impliqués dans la signalisation cellulaire et les réseaux de communication intercellulaire. Pour évaluer leur potentiel en tant que biomarqueurs, ARNs peuvent être quantifiés dans le plasma, l&#39;urine et d&#39;autres fluides. Néanmoins, pour comprendre pleinement l&#39;impact des ARNs extracellulaires comme des signaux endocriniens, il est important de déterminer quels transporteurs transportent et de les protéger dans les fluides biologiques (par exemple, plasma), dont les cellules et les tissus contribuent à des pools de ARNs extracellulaires, et les cellules et les tissus capables d&#39;accepter et d&#39;utiliser extracellulaire ARNs. Pour atteindre ces objectifs, il est essentiel d&#39;isoler des populations très pures des transporteurs extracellulairesARNs pour le profilage et la quantification. Nous avons déjà démontré que les lipoprotéines, en particulier les lipoprotéines de haute densité (HDL), le transport de microARN (miARN fonctionnels) entre les cellules et HDL-miARN sont significativement altérées dans la maladie. Ici, nous détaillons un nouveau protocole qui utilise tandem isolement HDL avec gradient de densité ultracentrifugation (DGUC) et rapide aux protéines chromatographie liquide (FPLC) pour obtenir HDL très pur pour le profilage aval et la quantification de tous les ARNs, y compris miARN, utilisant à la fois haute Le séquençage -throughput et des approches de PCR en temps réel. Ce protocole sera une ressource précieuse pour l&#39;étude des ARNs sur HDL.

Ce protocole est une série de méthodes établies reliées entre elles pour permettre la quantification des HDL sur les ARNs de haute pureté par séquençage à haut débit ou PCR en temps réel (figure 1). Pour démontrer la faisabilité et l&#39;impact de ce protocole, HDL a été purifié à partir de plasma humain par le tandem DGUC et FPLC méthode. Les fractions recueillies FPLC correspondant aux HDL (par la distribution du cholestérol) ont été concentrées et l&#39;ARN total a ét...

Ce protocole décrit l’isolement et la quantification des petits ARN des lipoprotéines de haute densité.

Isolement de lipoprotéines de haute densité pour les non-codant petit ARN Quantification

The diversity of small non-coding RNAs (sRNA) is rapidly expanding and their roles in biological processes, including gene regulation, are emerging. Most ...

L'objectif général de ce protocole est de quantifier les ARN non codants de petite taille sur des lipoprotéines purifiées. Ce protocole peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine des lipoprotéines, telles que la définition des signatures en ARN petits des lipoprotéines dans l'état sain et en pathologie, ainsi que le développement des ARN petits des lipoprotéines en tant que biomarqueurs de maladies ou messages intercellulaires. Le principal avantage de cette technique est qu'elle permet d'analyser des lipoprotéines hautement purifiées afin de détecter des modifications des ARN petits dans des conditions pathologiques ou expérimentales.Les implications de cette technique s'étendent à la thérapie des maladies cardiométaboliques, car les ARN extracellulaires constituent une nouvelle classe de biomarqueurs de maladies et les petits ARN des lipoprotéines présentent un potentiel prometteur comme cibles thérapeutiques dans les études futures. Bien que cette méthode soit conçue pour les petits ARN des HDL, elle peut également être adaptée aux petits ARN des lipoprotéines de très basse densité et de basse densité. En général, les personnes novices dans cette méthode peuvent éprouver des difficultés en raison du manque d'équipement adéquat et d'expertise dans la préparation des échantillons pour l'ultracentrifugation en gradient de densité.Ce protocole repose sur des méthodes éprouvées combinées afin de quantifier les ARN petits présents sur des HDL hautement purifiées, par séquençage à haut débit ou par PCR en temps réel. Cette vidéo traite de la purification des HDL. Ce protocole sera démontré par mon assistant, Evan Shadari.Pour commencer, ajoutez 90 microlitres d'antioxydants à 100x à neuf millilitres de plasma. Ensuite, ajustez la densité du plasma à 1,025 gramme par millilitre en ajoutant 0,251 gramme de bromure de potassium à chaque neuf millilitres de plasma. Agitez doucement le plasma à température ambiante jusqu'à ce que tout le sel soit dissous.Ensuite, transférez le plasma dans des tubes d'ultracentrifugation et veillez à former une couche de bulles en surface. Aucun air ne doit être emprisonné sous le plasma. Préparez ensuite une aiguille de calibre 18 en y ajoutant un coude à 90 degrés à un centimètre de l'extrémité, le côté biseauté étant orienté vers le haut.Ensuite, à l’aide d’une seringue et de l’aiguille courbée, déposer soigneusement trois millilitres de la solution de recouvrement numéro un sur le plasma. Éliminer la majorité des bulles présentes à la surface et laisser un espace de deux à trois millimètres entre le ménisque et le bord du tube. Puis, placer délicatement les tubes dans les godets du rotor SW 40 Ti.Peser chaque godet avec ses bouchons, puis équilibrer précisément les godets qui occuperont des positions opposées dans la centrifugeuse. Ensuite, placer le rotor dans la centrifugeuse ultracentrifuge et faire tourner à 274 400 fois G pendant 24 heures à quatre degrés Celsius, avec le frein réglé à mi-course, à une valeur de quatre. Le lendemain, retirer soigneusement les godets du rotor, puis sortir les tubes des godets.Ensuite, retirez lentement deux millilitres de la couche supérieure de la superposition, à l’aide d’une seringue et d’une aiguille courbée. Il s’agit de la fraction VLDL IDL. Puis, récupérez les sept millilitres restants de plasma et transférez-les dans un tube conique de 15 millilitres.Amener le volume du plasma à neuf millilitres en ajoutant la solution de recouvrement numéro deux. Ensuite, ajuster la densité à 1,080 gramme par millilitre en ajoutant 0,746 gramme de bromure de potassium. Puis, agiter doucement l'échantillon pour dissoudre le sel, ce qui prendra environ 20 minutes.Ensuite, transférez l'échantillon dans un tube d'ultracentrifugation sans emprisonner d'air. Veillez à former une couche de bulles en haut. À l'aide de l'aiguille courbée, superposez soigneusement trois millilitres de la solution de recouvrement numéro trois.Ensuite, éliminez la majeure partie des bulles et chargez soigneusement les tubes dans le godet SW 40 Ti. Équilibrez-les et faites-les centrifuger, comme décrit précédemment, pendant 24 heures. Le jour suivant, retirez délicatement deux millilitres de la couche supérieure de la surcouche à l’aide de l’aiguille courbée.Il s'agit de la fraction LDL. Ensuite, transférez l'échantillon restant dans un nouveau tube conique de 15 millilitres et complétez le volume à neuf millilitres avec la solution numéro quatre. Ajustez ensuite la densité à 1,30 gramme par millilitre en ajoutant environ 3,33 grammes de bromure de potassium et en agitant doucement l'échantillon jusqu'à ce que le sel soit complètement dissous.Ensuite, transférez l'échantillon dans un tube d'ultracentrifugation et recouvrez soigneusement trois millilitres de la solution numéro cinq. Procédez maintenant à l'ultracentrifugation de l'échantillon comme précédemment, mais pendant 48 heures. Deux jours plus tard, prélèvez les deux millilitres supérieurs de la phase superposée à l'aide d'une seringue et d'une aiguille courbée.Ceci constitue la fraction HDL. Pour éliminer les solutions à haute teneur en sel, transférez la fraction HDL dans une poche de dialyse humide ayant une limite de coupure de 10 000 de poids moléculaire. Ensuite, effectuez une dialyse pendant 24 heures dans un litre de PBS 1X avec agitation douce à quatre degrés Celsius.Remplacer la solution de PBS trois fois au cours de la période de 24 heures. Ensuite, déterminer la concentration en protéines de la fraction HDL à l'aide d'une méthode BCA. Les vésicules extracellulaires, ou exosomes, ont une densité similaire à celle des HDL de petite taille et pourraient donc être présentes dans la même fraction de densité que les HDL.Ainsi, la fraction HDL nécessite une purification supplémentaire par FPLC. Juste avant d'utiliser la FPLC, faire passer 1,2 milligramme de la fraction HDL provenant de la DGUC, en solution dans 500 microlitres, à travers un filtre centrifuge de 0,22 micron. Recueillir l'échantillon filtré dans une seringue d'injection FDLC, en veillant à ce qu'aucune bulle d'air ne soit piégée.Ensuite, régler le débit de la FPLC à 0,3 millilitre par minute avec une limite de pression de 2,6 mégapascals. Puis, équilibrer les colonnes avec 0,2 volume de colonne de tampon. Injecter maintenant l'échantillon avec trois millilitres de tampon dans l'appareil de FPLC, et démarrer la course.Collecter des fractions de 1,5 millilitre pour un total de 72 fractions. Identifier les fractions de FPLC correspondant aux HDL purifiées par DGUC en déterminant les taux de cholestérol total à l’aide d’un kit colorimétrique, conformément aux instructions du fabricant. Prévoir de trouver six à sept fractions de FPLC contenant les HDL purifiées par DGUC.Rassembler toutes les fractions contenant les HDL et les concentrer à l’aide d’un filtre centrifuge à coupure de 10 kilodaltons à 4 000 ×g pendant une heure à quatre degrés Celsius, ou jusqu’à ce que le concentré d’HDL atteigne environ 100 microlitres. Ensuite, récupérer le concentré d’HDL et quantifier les protéines par la méthode BCA. Par la suite, utiliser la même quantité de protéine totale d’HDL pour isoler l’ARN.Le plasma humain a été fractionné par FPLC sans utiliser de séparation en gradient de densité. Six fractions correspondaient aux HDL et six aux lipoprotéines de très basse densité. Les lipides en noir, le cholestérol en rouge et les protéines en bleu ont tous été mesurés à l'aide de kits colorimétriques.En comparaison, l'utilisation d'une ultracentrifugation en gradient de densité avant la FPLC a permis de constater que les protéines lipidiques et le cholestérol se retrouvaient presque exclusivement dans les fractions de HDL. À partir de HDL provenant de quatre donneurs plasmatiques sains, l'ARN total a été isolé et séquencé à l'aide d'un protocole en lecture simple de 50 paires de bases. La répartition des lectures normalisées illustre un enrichissement en petits ARN aux alentours de 21 et 34 nucléotides.L'analyse de la bibliothèque a montré que 38 pour cent des lectures étaient des microARN, et 37 pour cent provenaient de tARN. Divers ARN, des ARN ribosomiques, des petits ARN, des ARN nucléolaires petits et des ARN non codants longs étaient également présents. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en dix jours, lorsqu'elle est effectuée correctement.Lors de la mise en œuvre de cette procédure, il est important de se rappeler de valider les modifications observées dans les ARN petits des HDL à l’aide du séquençage à haut débit par une autre méthode, telle que la PCR ou le dot-blot Northern. Après cette procédure, d'autres méthodes, comme la capacité d'acceptation du cholestérol HDL ou les activités anti-inflammatoires des HDL, peuvent être réalisées pendant les étapes d'isolement des ARN et de préparation au séquençage afin de répondre à des questions supplémentaires, par exemple déterminer la corrélation entre les modifications des ARN petits des HDL et la fonction des HDL. Après son développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans les domaines des lipides et des lipoprotéines pour étudier les cargaisons non liées au cholestérol, en particulier les acides nucléiques et les maladies métaboliques, comme l'hypercholestérolémie ou le diabète.Et n'oubliez pas que le travail avec le plasma humain peut être extrêmement dangereux ; une formation adéquate sur les agents pathogènes transmissibles par le sang est nécessaire, et des équipements de protection individuelle appropriés doivent être portés lors de l'exécution de cette technique.

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