Isolement de lipoprotéines de haute densité pour les non-codant petit ARN Quantification

L’objectif global de ce protocole est de quantifier de petits ARN non codants sur des lipoprotéines purifiées. Ce protocole peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine des lipoprotéines, telles que la définition des signatures de petits ARN des lipoprotéines dans la santé et la maladie, ainsi que la promotion des petits ARN des lipoprotéines en tant que biomarqueurs de maladies ou messages de cellule à cellule. Le principal avantage de cette technique est qu’il est possible d’analyser des lipoprotéines très pures à la recherche de petits changements d’ARN dans des conditions pathologiques ou expérimentales.

Les implications de cette technique s’étendent au traitement des maladies cardiométaboliques, car les ARN extracellulaires sont une nouvelle classe de biomarqueurs de la maladie et les petits ARN des lipoprotéines ont un potentiel intéressant en tant que cibles médicamenteuses dans les études futures. Bien que cette méthode soit conçue pour les petits ARN HDL, elle peut également être adaptée pour les petits ARN lipoprotéiques de très faible densité et de faible densité. En général, les personnes qui ne connaissent pas cette méthode peuvent éprouver des difficultés en raison du manque d’équipement approprié et d’expertise dans la préparation des échantillons pour l’ultracentrifugation à gradient de densité.

Ce protocole est composé de méthodes établies reliées entre elles pour la quantification de petits ARN sur des HDL hautement purs, en utilisant le séquençage à haut débit, ou la PCR en temps réel. Cette vidéo traite de la purification du HDL. Ce protocole va être démontré par mon assistant, Evan Shadari.

Pour commencer, ajoutez 90 microlitres d’antioxydants 100x à neuf millilitres de plasma. Ensuite, ajustez la densité du plasma à 1,025 gramme par millilitre, en ajoutant 0,251 gramme de bromure de potassium pour neuf millilitres de plasma. Secouez le plasma à température ambiante, jusqu’à ce que tout le sel soit dissous.

Ensuite, transférez le plasma dans des tubes à ultra-centrifugeuse et assurez-vous d’avoir une couche de bulles en haut. Il ne doit pas y avoir d’air emprisonné sous le plasma. Ensuite, préparez une aiguille de calibre 18 en ajoutant une courbure à 90 degrés à un centimètre de la pointe, avec le côté biseauté vers le haut.

Ensuite, à l’aide d’une seringue et de l’aiguille pliée, placez soigneusement trois millilitres de solution de recouvrement numéro un sur le plasma. Retirez la majorité des bulles à la surface et laissez deux à trois millimètres entre le ménisque et le bord du tube. Ensuite, placez soigneusement les tubes dans des godets SW 40 Ti.

Pesez chaque seau avec les bouchons et équilibrez exactement les seaux qui occuperont des positions opposées dans la centrifugeuse. Ensuite, placez le rotor dans l’ultra-centrifugeuse et faites-le fonctionner à 274, 400 fois G pendant 24 heures à quatre degrés Celsius, avec la rupture réglée intermédiaire à une valeur de quatre. Le lendemain, retirez soigneusement les godets du rotor et soulevez les tubes des godets.

Ensuite, retirez lentement deux millilitres de la couche supérieure du revêtement, à l’aide d’une seringue et d’une aiguille pliée. Il s’agit de la fraction IDL VLDL. Ensuite, récupérez les sept millilitres de plasma restants et transférez-les dans un tube conique de 15 millilitres.

Portez le volume du plasma à neuf millilitres en ajoutant la solution de superposition numéro deux. Ensuite, ajustez la densité à 1,080 gramme par millilitre en ajoutant 0,746 gramme de bromure de potassium. Ensuite, secouez doucement l’échantillon pour dissoudre le sel, ce qui prendra environ 20 minutes.

Ensuite, transférez l’échantillon dans un tube ultra-centrifuge sans emprisonner d’air. Assurez-vous qu’une couche de bulles est faite en haut. À l’aide de l’aiguille pliée, superposez soigneusement trois millilitres de solution de recouvrement numéro trois.

Ensuite, retirez la majorité des bulles et chargez soigneusement les tubes dans un seau SW 40 Ti. Équilibrez-les et faites-les tourner, comme décrit précédemment, pendant 24 heures. Le lendemain, retirez soigneusement deux millilitres de la couche supérieure de la superposition à l’aide de l’aiguille pliée.

Il s’agit de la fraction LDL. Ensuite, transférez l’échantillon restant dans un nouveau tube conique de 15 millilitres et portez le volume à neuf millilitres avec la solution numéro quatre. Ajustez maintenant la densité à 1,30 gramme par millilitre en ajoutant environ 3,33 grammes de bromure de potassium et en secouant l’échantillon jusqu’à ce que le sel se dissolve.

Ensuite, transférez l’échantillon dans un tube ultra-centrifuge et versez soigneusement trois millilitres de la solution numéro cinq. Maintenant, ultra-centrifugez l’échantillon comme avant, mais pendant 48 heures. Deux jours plus tard, prélevez les deux premiers millilitres de la superposition à l’aide d’une seringue et d’une aiguille pliée.

C’est ce qui constitue la fraction HDL. Pour éliminer les solutions à haute teneur en sel, transférez la fraction HDL dans un manchon de dialyse humide avec une coupure de 10 000 poids moléculaires. Ensuite, dialysez-le pendant 24 heures dans un litre d’un XPBS en agitant doucement à quatre degrés Celsius.

Remplacez la solution PBS trois fois au cours de la période de 24 heures. Plus tard, déterminez la concentration protéique de la fraction HDL à l’aide d’une méthode BCA. Les vésicules extracellulaires, ou exosomes, ont une densité similaire à celle des petits HDL et pourraient donc être présentes dans la même fraction de densité que le HDL.

Ainsi, la fraction HDL nécessite une purification supplémentaire par FPLC. Immédiatement avant d’utiliser le FPLC, faites passer 1,2 milligramme de la fraction HDL DGUC dans 500 microlitres de solution à travers un filtre centrifuge de 0,22 micron. Prélevez l’échantillon filtré dans une seringue d’injection FDLC, en veillant à ce qu’aucune bulle d’air ne soit piégée.

Ensuite, réglez le débit FPLC à 0,3 millilitre par minute avec une limite de pression à 2,6 mégapascals. Ensuite, équilibrez les colonnes avec 0,2 volume de colonne de tampon. Injectez maintenant l’échantillon avec trois millilitres de tampon dans l’instrument FPLC et commencez le cycle.

Collectez des fractions de 1,5 millilitre pour un total de 72 fractions. Identifier les fractions FPLC correspondant à DGUC HDL en déterminant le taux de cholestérol total à l’aide d’un kit colorimétrique selon les instructions du fabricant. Attendez-vous à trouver six à sept fractions FPLC contenant du DGUC HDL.

Regroupez toutes les fractions contenant du HDL et concentrez-les à l’aide d’un filtre centrifuge de coupure de 10 kilodaltons à 4 000 fois G pendant une heure à quatre degrés Celsius, ou jusqu’à ce que le concentré de HDL atteigne environ 100 microlitres. Ensuite, prélevez le concentré HDL et quantifiez la protéine à l’aide de la méthode BCA. Plus tard, utilisez la même quantité de protéine totale HDL pour isoler l’ARN.

Le plasma humain a été fractionné par FPLC sans utilisation de séparation par gradient de densité. Six fractions correspondaient à des HDL et six à des lipoprotéines de très basse densité. Les lipides en noir, le cholestérol en rouge et les protéines en bleu ont tous été mesurés par des kits colorimétriques.

En comparaison, l’utilisation de l’ultra-centrifugation à gradient de densité avant la FPLC a permis de trouver des protéines lipidiques et du cholestérol presque exclusivement dans les fractions HDL. À partir de HDL prélevés sur quatre donneurs de plasma sains, l’ARN total a été isolé et séquencé à l’aide d’un protocole de 50 paires de bases à lecture unique. La distribution des lectures normalisées illustre un enrichissement de petits ARN autour de 21 et 34 nucléotides.

L’analyse de la bibliothèque a montré que 38 % des lectures étaient des micro-ARN et 37 % étaient dérivées d’ARNT. Divers ARN, ARN ribosomiques, petits ARN, petits ARN nucléolaires et longs ARN non codants étaient également présents. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée dans un délai de dix jours, lorsqu’elle est bien faite.

Lors de la tentative de cette procédure, il est important de se rappeler de valider les petits changements d’ARN HDL observés avec le séquençage à haut débit avec une autre méthode, telle que la PCR ou le transfert de Northern. À la suite de cette procédure, d’autres méthodes, telles que la capacité d’acceptation du flux électronique du cholestérol HDL et les SA anti-inflammatoires HDL, peuvent être effectuées pendant les étapes d’isolement de l’ARN et les étapes de préparation du séquençage pour répondre à des questions supplémentaires, comme la détermination de la corrélation entre les modifications de l’ARN du HDL et la fonction du HDL. Après son développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans les domaines des lipides et des lipoprotéines, pour étudier les cargaisons non cholestéroliques, en particulier les acides nucléiques et les maladies métaboliques, par exemple l’hypercholestérolémie ou le diabète.

Et n’oubliez pas que travailler avec du plasma humain peut être extrêmement dangereux, et qu’il faut avoir une formation appropriée sur les agents pathogènes transmissibles par le sang, et un équipement de protection individuelle approprié doit être porté lors de l’exécution de cette technique.