Introducteur Electrophorèse Capillaire-Spectrométrie de masse pour Metabolic Profiling des échantillons biologiques

L’objectif général de cette procédure est de démontrer comment l’électrophorèse capillaire-spectrométrie de masse, ou CE-MS, utilisant une interface sans gaine et à pointe poreuse, peut être utilisée pour l’analyse de métabolites hautement polaires et chargés. En supposant qu’aucun métabolite ne peut être souvent chargé, et qu’ils peuvent être cationiques ou anioniques, et pour les séparer, des séparations électrolitiques comme l’électrophorèse capillaire, est la méthode la plus appropriée. Cependant, ces dernières années, la sensibilité n’était pas assez bonne.

Cela était dû à l’interfaçage et la méthode n’était pas non plus robuste. Mais je pense que nous avons bien résolu les deux problèmes en utilisant une gaine comme interface libre et en utilisant ce nouveau protocole. L’électrophorèse capillaire couplée à la spectrométrie de masse utilisant une nouvelle interface d’embout poreux sans gaine peut être utilisée pour répondre à des questions cliniques clés dans le domaine de la métabolomique.

Par exemple, le profilage de métabolites hautement polaires peut être facilement réalisé avec cette technologie. Composites S séparés sur la base du rapport charge/taille. Le plus souvent, cette technique est très adaptée pour le profilage de ce type de composés marqués en volume sur des échantillons biologiques.

Une caractéristique unique de la méthodologie CE-MS sans gaine proposée est qu’elle peut être utilisée pour le profilage des métabolites anioniques et cationiques en commutant uniquement la polarité de tension CE et la polarité de détection MS. En général, les personnes qui ne connaissent pas cette méthode auront du mal car la CE-MS est considérée comme une technique relativement nouvelle et compliquée. Pour commencer cette procédure, placez une nouvelle cartouche de silice fondue nue avec un émetteur à pointe poreuse dans la zone capillaire, l’électrophorèse ou l’instrument CE.

Appliquez un rinçage au méthanol à 50 psi pendant 15 minutes avec le logiciel contrôlant l’instrument CE. Et vérifiez visuellement si du liquide s’écoule de la sortie capillaire. Ensuite, effectuez un rinçage dans la direction opposée à 50 psi pendant cinq minutes à l’aide de l’électrolite de fond, ou solution BGE, pour examiner visuellement si du liquide s’écoule du capillaire conducteur.

Répétez l’étape précédente à une pression de 100 psi si aucun liquide n’a été observé s’écoulant de la sortie capillaire. Ensuite, rincez le capillaire de séparation avec de l’eau à 50 psi pendant 10 minutes, puis avec de l’hydroxyde de sodium 0,1 molaire à 50 psi pendant 10 minutes, de l’eau à 50 psi pendant 10 minutes et une solution BGE à 50 psi pendant 10 minutes. Ensuite, retirez l’embout du pulvérisateur de la cartouche de silice fondue du tube d’eau et installez-le dans l’adaptateur de source de nanopulvérisation pour le couplage à l’instrument MS.

Assurez-vous que la hauteur des flacons de solution BGE dans l’instrument CE correspond à la hauteur de la pointe du pulvérisateur. Vérifiez l’écoulement du liquide à travers le capillaire conducteur en rinçant avec une solution BGE à 50 psi pendant cinq minutes. Lors de cette étape de rinçage, une goutte de liquide à la base de l’aiguille de pulvérisation par ionisation par électronébulisation, ou ESI, doit être observée.

Après le rinçage, rincez le capillaire de séparation avec une solution BGE à 50 psi pendant 10 minutes dans le sens avant. Une goutte de liquide doit être observée à l’extrémité de l’émetteur de pointe poreuse lors de cette étape. Maintenant, positionnez l’émetteur de pointe poreuse à l’entrée de l’entrée MS à une distance approximative de deux à trois mm.

Appliquez une tension de 30 kV en utilisant un temps de rampe d’une minute et commencez à acquérir des données MS dans la plage masse/charge de 65 à 1000 pour les études de profilage métabolique en utilisant d’abord une tension ESI de zéro. Réglez la tension ESI sur 1000 V pendant la mesure des données. Augmentez la tension ESI par incréments de 200 V jusqu’à ce qu’un signal de fond constant soit observé pendant au moins 15 minutes.

Transférez 20 microlitres d’un mélange étalon de métabolite anionique préalablement préparé dans un microflacon vide de 100 microlitres. Placez le microflacon dans un flacon CE et placez le flacon CE dans le plateau d’échantillon d’entrée. Démarrez une méthode d’acquisition en mode d’ions négatifs précédemment créée, puis démarrez la séquence CE à l’aide du logiciel contrôlant l’instrument CE.

Ensuite, rincez le capillaire de séparation avec une solution BGE à 50 psi pendant trois minutes, suivi d’injections à deux psi pendant 60 secondes et un psi pendant 10 secondes. Appliquez une tension de 30 kV avec un temps de rampe d’une minute et une pression de 0,5 psi pendant 30 minutes à l’entrée. Après une séparation électrophorétique de 30 minutes, arrêtez l’acquisition de données MS et diminuez la tension CE à 1 kV en utilisant un temps de rampe de cinq minutes.

Entre les injections d’échantillons, rincez le capillaire de séparation avec de l’eau, de l’hydroxyde de sodium 0,1 molaire, de l’eau et une solution BGE à 30 psi pendant trois minutes. Une fois les cycles terminés, analysez les données enregistrées en déterminant les temps de migration et l’intensité du signal du mélange de métabolites anioniques analytique. Évaluez si les étalons de métabolites anioniques apparaissent dans la région entre 10 et 28 minutes.

Ensuite, vérifiez si les trois isomères structurellement apparentés, le D-glucose 1-phosphate, le D-glucose 6-phosphate et le D-fructose 6-phosphate, sont partiellement séparés. Les performances de séparation de la méthode CE-MS sans gaine pour l’analyse des métabolites anioniques hautement polaires sont démontrées pour trois isomères de phosphate de sucre structurellement apparentés. Bien qu’une séparation de base n’ait pas été obtenue pour ces trois analytes, une séparation partielle est suffisante pour permettre leur détection sélective par MS, car ces analytes ont exactement la même masse.

Lors de l’analyse d’échantillons biologiques, avec cette méthodologie CE-MS sans gaine, il est important de vérifier régulièrement les performances analytiques au fil du temps en utilisant des normes académiques. Dans l’ensemble, la méthodologie sans gaine permet de profiler ce type de composés dans des échantillons biologiques ultra-petits, ouvrant ainsi de nombreuses possibilités d’analyse de ce type d’échantillons dans les domaines des sciences biomédicales, de la chimie bioanalytique et des domaines de recherche extérieurs. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de coupler l’EC à la MS via une interface poreuse sans gaine pour le profilage des métabolites hautement polaires et chargés.