Name: Introducteur Electrophorèse Capillaire-Spectrométrie de masse pour Metabolic Profiling des échantillons biologiques (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-10-01T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 46 s
Description: Découvrez l'électrophorèse capillaire couplée à la spectrométrie de masse avec interface sans gaine pour le profilage métabolique d'échantillons biologiques ultra-petits. Cette méthode améliore la sensibilité et la robustesse pour analyser les métabolites hautement polaires et chargés.

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Dr. Rawi Ramautar tient à souligner le soutien financier du programme de subventions Veni de l’Organisation néerlandaise de la recherche scientifique (NWO Veni 722.013.008).

NOTE: Le protocole décrit ici pour l&#39;utilisation de introducteur CE-MS pour les études de profilage métabolique est à usage de laboratoire seulement. Les procédures décrites ci - dessous sont basés sur récemment publié 4,5 de travail. D&#39;autres détails expérimentaux peuvent être trouvés dans ces documents. Avant d&#39;utiliser ce protocole, consulter toutes les fiches de données de sécurité des matériaux pertinents (FS). S&#39;il vous plaît utiliser toutes les procédures de sécurité en laboratoire appropriées, y compris des lunettes de sécurité, blouse de laboratoire et des gants, lors de la conduite des expériences décrites dans ce protocole. 1. Préparation des réactifs et des échantillons Solutions <ol><li> Préparation de l&#39;électrolyte de base (BGE) <ol><li> Préparer une nouvelle solution BGE (10% (v / v) d&#39;acide acétique, pH 2,2) tous les jours. </li><li> Ajouter 9,0 ml d&#39;eau dans un flacon de 10 ml en verre et ajouter 1,0 ml d&#39;acide acétique à l&#39;eau dans une hotte. Mélanger soigneusement la solution à l&#39;aide d&#39;un vortex. </li></ol></li><li> Préparation de métabolite Standard mélange <ol><li> Dissoudre 50 ul d&#39;un mélange standard de 50 uM de cations contenant 60 métabolites cationiques dans 50 pi d&#39;eau et mélanger soigneusement la solution. Conserver à -80 ° C lorsqu&#39;ils ne sont pas en cours d&#39;utilisation. </li><li> Dissoudre 50 pl d&#39;un anion mélange standard 50 uM contenant 30 métabolites anioniques dans 50 pi d&#39;eau et mélanger soigneusement la solution. Conserver cette solution, en aliquotes pour empêcher les cycles de gel / dégel du même mélange standard, à -80 ° C lorsqu&#39;ils ne sont pas en cours d&#39;utilisation. NOTE: Le métabolite mélanges étalons sont stables pendant 3 mois dans des conditions appropriées à -80 ° C. </li></ol></li><li> Préparation des extraits de la lignée de cellules de glioblastome <ol><li> Laver les cellules adhérentes U-87 MG glioblastome humain trois fois avec 1 ml glacée solution à 0,9% de chlorure de sodium 21. </li><li> Ajouter 2 ml d&#39;une solution glacée de méthanol / eau (2/8, v / v) aux cellules adhérentes et racler à l&#39; aide d&#39; un caoutchouc à bout grattoir à cellules 21. </li&gt; <li> Recueillir la solution de méthanol / eau dans un tube et ultrasonicate pendant 2 min. </li><li> Ajouter le chloroforme à la fraction méthanol / eau (rapport finale 8/8/2, v / v / v) et centrifuger l&#39;échantillon pendant 10 minutes à 16.100 xg et 4 ° C. </li><li> Recueillir la phase méthanol / eau et évaporer cette fraction en utilisant un concentrateur sous vide. Reconstituer le matériau séché dans 50 ul d&#39;eau pour analyse par introducteur CE-MS. Lorsqu&#39;ils ne sont pas en cours d&#39;utilisation stocker l&#39;échantillon à -80 ° C. </li></ol></li></ol> 2. Mise en place du CE MS-système introducteur <ol><li> Installation de la cartouche-silice fondue nue avec la pointe émetteur poreuse <ol><li> Placez une nouvelle cartouche de silice fondue nue avec une pointe émetteur poreuse (longueur 30 um diamètre intérieur x 90 cm au total) dans l&#39;instrument de la CE. </li><li> Appliquer un rinçage à l&#39;avant à 50 psi pendant 15 min avec le logiciel de commande de l&#39;instrument EC à l&#39;aide de methanol à 100% et de vérifier visuellement si le liquide coule hors du Capilsortie lary au cours de cette étape de rinçage. Également effectuer un rinçage dans le sens opposé à 50 psi pendant 5 min en utilisant la solution BGE pour examiner visuellement si liquide sortant du capillaire conducteur. </li><li> Répétez l&#39;étape 2.1.2 à une pression de 100 psi au cas où aucune formation de gouttes de liquide a été observé à la sortie du capillaire. Installez une nouvelle cartouche de silice fondue nue si aucune formation de gouttes de liquide a été observé au cours de cette étape. </li><li> Rincer le capillaire de séparation avec l&#39;eau à 50 psi pendant 10 min, puis du NaOH 0,1 M à 50 psi pendant 10 min, puis par de l&#39;eau à 50 psi pendant 10 min, et enfin avec BGE à 50 psi pendant 10 min. REMARQUE: Les étapes 2.1.1 jusqu&#39;à 2.1.4 ne sont requis pour l&#39;installation d&#39;une nouvelle cartouche capillaire. </li></ol></li><li> Couplage du capillaire poreux pointe émetteur à ESI-MS REMARQUE: Avant le couplage du capillaire de la CE à MS, faire en sorte que l&#39;instrument a été calibré MS et relié au système CE. Régler la tension ESI0. Monter l&#39;instrument avec une source de nanospray MS. Gaz 1, gaz 2 et la température d&#39;interface de chauffage n&#39;a pas été appliquée comme ESI à des débits très faibles se produit simplement en appliquant la tension de pulvérisation d&#39;ions fixé à 1500 V. Réglez le rideau à 5 psi. <ol><li> Retirer la pointe de pulvérisation de la cartouche en silice fondue à partir du tube de l&#39;eau et l&#39;installer dans l&#39;adaptateur source de nanospray pour coupler à l&#39;instrument MS. Assurez-vous que la hauteur des flacons BGE dans l&#39;instrument de la CE correspond à la hauteur de la pointe du pulvérisateur. </li><li> Vérifier l&#39;écoulement de liquide à travers le capillaire conducteur par un rinçage à l&#39;BGE à 50 psi pendant 5 min. Au cours de cette étape de rinçage avec une formation de gouttes à la base de l&#39;aiguille du pulvérisateur ESI doit être observé. </li><li> Rincer le capillaire de séparation avec BGE à 50 psi pendant 10 min dans la direction vers l&#39;avant. la formation de goutte doit être observée à la pointe de la pointe émetteur poreuse (pointe du pulvérisateur) lors de cette étape. </li><li> Placez la pointe émetteur poreuse à l&#39;entrée de l&#39;entrée MS à une distance de circa 2 à 3 mm. </li><li> Appliquer une tension de 30 kV en utilisant un temps de rampe de 1 min et commencer à acquérir des données MS dans la gamme m / z de 65 à 1000 m / z pour les études de profilage métabolique en utilisant d&#39; abord une tension ESI de 0. NOTE: Le spectre de masse doit être vide de signal, il ne devrait pas être électrospray. </li><li> Régler la tension ESI à 1000 V en poursuivre les données de mesure. Augmenter la tension ESI avec des incréments de 200 V jusqu&#39;à ce qu&#39;un signal de fond constant est observé pendant au moins 15 min. </li><li> Optimiser la position poreuse d&#39;émetteur de la pointe par rapport au centre de l&#39;entrée MS en le déplaçant dans le x, y ou z-direction afin de voir quelle position fournit le maximum et le signal de MS plus stable (électrophérogramme ionique total). </li><li> Après l&#39;optimisation de la position de la pointe émetteur poreux et déterminer la tension optimale ESI, régler la tension ESI à 0 V et de diminuer la tension de la CE de 30 kV à 1 kV en utilisant un temps de rampe de 5 min. </li><li> Créer une méthode MS using la tension optimale ESI et une méthode de CE sur l&#39;instrument de la CE pour l&#39;analyse des normes de métabolites et des échantillons biologiques. </li></ol></li></ol> 3. Analyse des Métabolite normes et des échantillons biologiques <ol><li> L&#39; évaluation des performances du CE-MS système introducteur <ol><li> Transférer 20 ul du métabolite mélange standard anionique dans un 100 ul microflacon vide (flacon PCR) qui se loge dans un flacon de CE et de mettre cette fiole dans le plateau d&#39;échantillons d&#39;entrée. NOTE: Le volume minimum requis dans le microtube pour une injection fiable est de 2 pl. <ol><li> Démarrer la méthode du mode d&#39;ions négatifs d&#39;acquisition MS créé lors de l&#39;étape 2.2.9 et commencer ensuite la séquence de la CE à l&#39;aide du logiciel de commande de l&#39;instrument de la CE. </li><li> Rincer le capillaire de séparation avec BGE à 50 psi pendant 3 minutes, suivi par une injection de 2,0 psi pendant 60 secondes (20 nl correspondant à 3% du volume capillaire), puis par injection BGE à 1,0 psi pendant 10seconde. NOTE: Par la suite, l&#39;acquisition de données MS est déclenchée. </li><li> Appliquer une tension de -30 kV avec un temps de rampe de 1,0 min avec une pression de 0,5 psi pendant 30 minutes à l&#39;entrée. Après une séparation électrophorétique 30 min, arrêter l&#39;acquisition de données MS et de diminuer la tension de la CE à -1 kV en utilisant un temps de rampe de 5 min (une diminution progressive de la tension de la CE après la séparation électrophorétique améliore la durabilité de la pointe poreuse capillaire émetteur). </li></ol></li><li> Entre injections échantillons, rincer le capillaire avec de l&#39;eau, 0,1 M d&#39;hydroxyde de sodium, eau et BGE chacun à 30 psi pendant 3 min. </li><li> Analyser les données enregistrées par la détermination des temps de migration et l&#39;intensité du signal du mélange métabolite anionique analysé. </li><li> Déterminer si les normes de métabolites anioniques apparaissent dans la zone comprise entre 10 et 28 min. </li><li> Vérifier si trois isomères de structure apparentée, à savoir, le D-glucose-1-phosphate, du D-glucose-6-phosphate et le D-fructose-6-phosphate sontpartiellement séparé, à savoir, la résolution entre les deux premiers pics est vers 0,75 et des deux derniers sommets est circa 0.50 (voir la figure 1). REMARQUE: Une résolution de 1,5 indique une séparation initiale de deux pics adjacents. </li><li> Répétez les étapes 3.1.1 et 3.1.2 pour le mélange de métabolite cationique. Assurez-vous que la détection MS est maintenant en mode d&#39;ions positifs et la tension de la C&#39;est de +30 kV. </li><li> Analyser les données enregistrées par la détermination des temps de migration et l&#39;intensité du signal du mélange métabolite cationique analysé. </li><li> Déterminer si les normes de métabolites cationiques apparaissent dans la zone comprise entre 8 et 22 min. Vérifiez si isoleucine et leucine migrent entre 15 et 15,5 min et déterminer si la résolution est environ 0,5. </li></ol></li><li> L&#39; analyse des échantillons biologiques <ol><li> Répétez les étapes 3.1.1 et 3.1.2 pour le profilage métabolique anionique de l&#39;extrait de la lignée de cellules de glioblastome. NOTE: Le con métaboliqueTente obtenue après prétraitement de l&#39;échantillon correspond à une densité cellulaire d&#39;environ 20 cellules / nl, par conséquent, une injection de 20 nl est l&#39;équivalent de 400 cellules par analyse. . </li><li> Créer un électrophérogramme d&#39;ions extrait pour l&#39;acide lactique métabolite (m / z 89,0243) en utilisant 5 mDa précision de masse et de vérifier si l&#39;intensité du signal est au- dessus de 100.000 points. </li><li> Répétez les étapes 3.1.1 et 3.1.2 pour le profilage métabolique cationique de l&#39;extrait de la lignée de cellules de glioblastome. NOTE: Un électrophérogramme ionique total très riche en information doit être observée pour une injection nl 20 dans ce mode. </li><li> Après les analyses ou lorsqu&#39;ils ne sont pas en cours d&#39;utilisation, rincer le capillaire avec de l&#39;eau à 50 psi pendant 15 minutes et stocker la partie d&#39;entrée du capillaire dans un flacon contenant de l&#39;eau et la section poreuse (partie de sortie) dans un tube contenant aussi de l&#39;eau. </li></ol></li></ol>

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Nous n’avons rien à divulguer.

Une méthode CE-MS introducteur utilisant une pointe émetteur poreuse a été présenté pour l&#39;analyse des métabolites hautement polaires et chargés. Une caractéristique unique de cette approche est que les métabolites anioniques ou cationiques peuvent être profilées que par commutation de la détection et de la tension de la CE polarité MS. Une large gamme de métabolites hautement polaires et chargés dans des échantillons biologiques peut être analysé avec un rendement de séparation élevé, ce qui est crucial pour les métabolites structurellement similaires, et avec des limites de détection dans la (faible) gamme nanomolaire. Le protocole présenté axé sur l&#39;utilisation de introducteur CE-MS pour le profilage métabolique des extraits cellulaires afin d&#39;illustrer l&#39;utilité de la méthode pour le profilage métabolique d&#39;un échantillon biologique. L&#39;approche décrite ici peut également être utilisé pour le profilage métabolique d&#39;autres types d&#39;échantillons biologiques, tels que l&#39; urine humaine 5, étant donné qu&#39;une procédure appropriée échantillon de pré - traitement est utilisé. Le introducteur CE-MS méthod est basé sur un émetteur de pointe poreuse qui permet l&#39;utilisation de la propriété intrinsèque à faible débit de CE. Dans ce contexte, un signal ESI stable est une condition préalable pour des études de profilage métabolique reproductibles. Par conséquent, il est important que la pointe de pulvérisation est correctement placé en face de l&#39;entrée de MS. Dans cette configuration, le processus ESI dépend principalement de la nature de la BGE et donc, l&#39;optimisation BGE est critique. La configuration de introducteur est moins polyvalent par rapport à la gaine-liquide Systèmes CE-MS où toutes sortes de compositions de gaine-liquide peuvent être ajoutés pour améliorer l&#39;efficacité d&#39;ionisation. L&#39;aiguille introducteur du pulvérisateur ESI doit être complètement rempli de liquide conducteur (ie, solution BGE). ESI un signal instable peut résulter d&#39;un capillaire partiellement ou totalement obturée. Rinçage à des pressions élevées avec BGE peut résoudre ce problème. Sinon, le capillaire de séparation doit être remplacée. Avant l&#39;évaluation de la performance analytique, un signal de fond stable ESIdevrait être générée première qui est cohérente d&#39;un jour à l&#39;autre. La performance analytique du introducteur méthode pour les études de profilage métabolique CE-MS doit être vérifié tous les jours en utilisant des mélanges standard de métabolites. Dans les mêmes conditions expérimentales, les durées de migration cohérentes, soit une variation inférieure à 3% pour intra-jour (n = 10) et entre les jours (n = 5) en utilisant une 20 injection nl d&#39;un mélange standard de métabolite (12,5 pM), le pic hauteurs / zones (variation inférieure à 15%) et les numéros de plaque (variant entre 60.000 et 400.000) devraient être obtenus. Les limites de détection doivent être dans la gamme nanomolaire pour la plupart des normes de métabolites. Seulement lorsque ces critères sont respectés est la méthode prête pour le profilage métabolique des échantillons biologiques. Si non, l&#39;instrument MS doit être réglé et ré-étalonné ou poreux émetteur pointe capillaire doit être changé. Une étape de rinçage efficace entre CE-MS analyse est d&#39;une grande importance, non seulement pouréviter toute contamination potentielle mais aussi pour maintenir les performances de séparation. report potentiel peut être causée par des flacons contaminés BGE avec l&#39;échantillon et par conséquent résolu par le remplacement par de nouveaux flacons BGE. Lorsque le procédé CE-MS introducteur ne sont pas en cours d&#39;utilisation, il est important de déconnecter le capillaire de séparation, et pour stocker le côté d&#39;entrée du capillaire dans l&#39;eau et l&#39;extérieur immergé avec la douille de protection dans un tube contenant de l&#39;eau pour prolonger capillaire vie. En résumé, la méthode introducteur CE-MS proposé montre un fort potentiel pour le profilage métabolique des échantillons biologiques lorsqu&#39;ils sont utilisés conformément aux procédures indiquées dans ce protocole. A ce stade, les données de comparaison inter-laboratoires sont absolument nécessaires pour introducteur CE-MS afin d&#39;évaluer le (long terme) la reproductibilité et la robustesse de cette approche pour la métabolomique. Ce protocole peut stimuler une telle étude. Divers défis analytiques doivent encore être pris en considération. Pour perf optimaleORMANCE, le courant de la CE doit être maintenue de préférence inférieure à 5 uA et à ce stade, les capillaires poreux émetteurs de pointe sont fournis uniquement à une longueur de 91 cm qui peut entraver le développement de tests à haut débit. En outre, un tampon de séparation à basse pH a été utilisé pour le profilage métabolique anionique qui peut ne pas être la plus optimale pour parvenir à une séparation de ligne de base de phosphates de sucre structurellement apparentées. Il est également important que seuls les métabolites anioniques peuvent être analysés qui sont (partiellement) chargé négativement dans les conditions de séparation utilisées. L&#39;étape suivante consiste à évaluer l&#39;utilité de la méthode CE-MS introducteur pour les études de profilage métabolique cliniques actuellement, un seul émetteur poreuse pointe capillaire ne peut être utilisé pour l&#39;analyse de jusqu&#39;à 100 échantillons biologiques. Dans l&#39; ensemble, la poursuite du développement dans l&#39;approche introducteur CE-MS va ouvrir une nouvelle direction dans le domaine de la métabolomique, à savoir, vers une meilleure compréhension des fonctions biologiques en scas d&#39;amples restrictions.

Dans métabolomique contemporains, haut de gamme des techniques de séparation analytique sont utilisées pour analyser un large éventail de classes de métabolites afin d&#39;obtenir un représentant en lecture sur l&#39;état physiologique d&#39;un organisme 1. L&#39;objectif ultime d&#39;une étude de la métabolomique est d&#39;obtenir une réponse à une question biologique / clinique donnée. À l&#39; heure actuelle, la base de données du métabolome humain est composé de plus de 40.000 entrées de métabolites représentant des composés à la fois endogènes et exogènes (ce dernier provenant de nutriments, microbiote, des médicaments et d&#39; autres sources) 2. Compte tenu de la grande diversité des propriétés physico-chimiques et la gamme de concentration de ces métabolites, des techniques d&#39;analyse multiples avec des mécanismes de séparation différents doivent être utilisés conjointement afin de profiler comme de nombreux métabolites que possible dans un échantillon biologique donné. Par exemple, Psychogios et al. , Utilise une combinaison de cinq techniques de séparation analytique pour le prof métaboliqueIling de sérum humain résultant de la détection de plus de 4000 chimiquement divers métabolites 3. Dans cet article, l&#39; attention sera portée aux stratégies CE-MS récemment mis au point pour le profilage métabolique des échantillons biologiques 4,5. Dans le CE, électrophorèse plus particulièrement capillaire de zone (CZE, habituellement dénommé CE), les composés sont séparés sur la base de leur rapport charge à la taille et, par conséquent, cette technique d&#39;analyse est très adapté pour l&#39;analyse des métabolites polaires et chargés. Le mécanisme de séparation de C&#39;est fondamentalement différent des techniques basées sur chromatographiques, fournissant ainsi une information complémentaire sur la composition métabolique des échantillons biologiques 6-8. Soga et ses collègues ont été les premiers à montrer l&#39;utilité de CE-MS pour le profilage global des métabolites dans des échantillons biologiques 9,10. Jusqu&#39;à présent, la faisabilité et l&#39; utilité des CE-MS pour métabolomique a été largement démontré 11-15.C&#39;est généralement couplée à MS via une gaine liquide interfaçage technique 16,17; cependant, en raison de la dilution de l&#39;effluent du capillaire par la gaine-liquide, la sensibilité de détection est intrinsèquement compromise. Récemment, il a été démontré que l&#39;utilisation d&#39;une interface sans introducteur a considérablement amélioré la couverture de détection de métabolites présents dans divers échantillons biologiques , par rapport à CE-MS en utilisant une interface gaine-liquide classique 5,18,19. Par exemple, circa 900 caractéristiques moléculaires ont été détectés dans l&#39; urine humaine par introducteur CE-MS alors que près de 300 caractéristiques moléculaires ont été observées avec gaine-liquide CE-MS 5. L&#39;interface introducteur utilisée était basée sur une pointe émetteur poreuse, qui a été inventé par Moini 20, permettant l&#39;utilisation efficace de la propriété intrinsèque à faible débit de CE en combinaison avec nano-ESI-MS. Afin de stimuler l&#39;utilisation de introducteur CE-MS dans le domaine de la métabolomique,un protocole décrivant la façon dont est présentée cette approche peut être utilisée pour l&#39;analyse des métabolites hautement polaires dans des échantillons biologiques, comme le montre l&#39;analyse des extraits de la lignée de cellules de glioblastome. Il est montré que la méthode CE-MS introducteur pour le profilage des métabolites cationiques peuvent également être utilisés pour le profilage de metabolites anioniques en utilisant exactement les mêmes capillaires et de séparation des conditions, ce qui réduit le temps d&#39;analyse et de fournir une plate-forme d&#39;analyse unique pour le profilage global de métabolites chargés. Le protocole décrit également une stratégie pour l&#39;alignement efficace de l&#39;introducteur poreuse pointe émetteur avec l&#39;instrument MS.

<table><tbody><tr><td>Instrument CESI 8000</td><td>Adaptateur Sciex</td><td>A98089</td><td>OptiMS requis pour coupler CESI à MS</td></tr><tr><td>OptiMS Cartouche de silice fondue, 30&nbsp ; &mu ; m ID x 90&nbsp ; cm longueur totale</td><td>Sciex</td><td>B07367</td><td></td></tr><tr><td>OptiMS Adaptateur pour source Sciex Nanospray III</td><td>Sciex</td><td>B07363</td><td></td></tr><tr><td>Flacons CESI</td><td>Sciex</td><td>B11648</td><td></td></tr><tr><td>Micro flacons</td><td>Sciex</td><td>144709</td><td></td></tr><tr><td>Acide acétique glacial</td><td>Sigma</td><td>A6283</td><td>Utilisation dans la hotte</td></tr><tr><td>Mélange de métabolites cationiques</td><td>Technologies du métabolome</td> <td>humainH3304-3034</td><td></td></tr><tr><td>Mélange de métabolites anioniques</td><td>Human Metabolome Technologies</td><td>H3304-1031</td><td></td></tr><tr><td>Méthanol (LC-MS Ultra Chromasolv)</td><td>Sigma</td><td>14262</td><td>Utilisation dans une hotte</td></tr><tr><td>Solution d’hydroxyde de sodium</td><td>Sigma</td><td>72079</td><td>0,1 M</td></tr><tr><td>U-87 MG Glioblastome Lignée cellulaire</td><td>Sigma</td><td>89081402</td> Chloroform Sigma 650498 <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>Toxique ; utilisation dans une hotte</td></tr></tbody></table>

introducteur electrophorèse capillaire-spectrométrie de masse pour metabolic profiling des échantillons biologiques

Sheathless Capillary Electrophoresis&#8211;Mass Spectrometry for Metabolic Profiling of Biological Samples

Dans la métabolomique, un large éventail de techniques d&#39;analyse est utilisé pour le profilage global de (endogènes) métabolites dans des échantillons complexes. Dans cet article, un protocole est présenté pour l&#39;analyse des métabolites anioniques et cationiques dans des échantillons biologiques par électrophorèse capillaire-spectrométrie de masse (CE-MS). C&#39;est bien adapté pour l&#39;analyse des métabolites hautement polaires et chargés en tant que composés sont séparés sur la base de leur rapport charge-size. Un introducteur interfaçage conception récemment mis au point, à savoir, une interface de pointe poreuse, est utilisé pour le couplage CE à ionisation par électronébulisation (ESI) MS. Cette approche permet l&#39;interfaçage de l&#39;utilisation efficace de la propriété intrinsèque à faible débit de la CE en combinaison avec MS, ce qui entraîne des limites de détection nanomolaires pour un large éventail de classes de métabolites polaires. Le protocole présenté ici est basé sur l&#39;emploi d&#39;un capillaire de silice fondue nue avec une pointe émetteur poreuse dans des conditions de séparation à faible pH pour l&#39;analyse d&#39;unlarge éventail de classes de métabolites dans des échantillons biologiques. Il est démontré que le même procédé introducteur CE-MS peut être utilisée pour établir le profil des métabolites cationiques, y compris des acides aminés, des nucléosides et des petits peptides, ou de ses métabolites actifs anioniques, y compris les phosphates de sucre, des nucléotides et des acides organiques, que par commutation de la détection MS et séparation polarité de la tension. le profil métabolique très riches en informations dans divers échantillons biologiques, tels que l&#39;urine, du liquide et des extraits de la lignée de cellules de glioblastome céphalorachidien peuvent être obtenus par ce protocole, en moins de 1 h d&#39;analyse CE-MS.

Le procédé introducteur CE-MS proposé est capable de fournir très efficace, à savoir les numéros de plaque allant de 60 000 à 400 000, le profil des métabolites actifs anioniques et cationiques , dans des limites de détection nanomolaires à l&#39; aide d&#39; acide acétique à 10% (pH 2,2) en tant que BGE. Les performances de séparation de la méthode pour l&#39;analyse des métabolites actifs anioniques fortement polaires est démontrée pour les trois isomères du phosphate de sucre structurellement apparentées (figure 1). Bien que la séparation de base n&#39;a pas été obtenue pour ces trois analytes, une séparation partielle est suffisante pour permettre leur détection sélective par MS comme ces analytes ont la même masse exacte. Le potentiel du procédé CE-MS introducteur pour le profilage métabolique du nombre limité de cellules, à savoir une injection nl 20 correspond à 400 cellules (densité cellulaire est environ 20 cellules / nl), est démontrée par l&#39;analyse des métabolites cationiques dans un extrait de la lignée de cellules de glioblastome (La figure 2), dans laquelle plus de 300 caractéristiques moléculaires ont été détectés au- dessus d&#39; un rapport S / N ratio ≥ 5. <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/54535/54535fig1.jpg" /> Figure 1. Analyse des isomères du phosphate de sucre par introducteur CE-MS. Électrophérogramme d&#39;ions extraites pour les trois isomères de phosphate de sucre (25 pM) obtenus avec introducteur CE-MS en mode ion négatif. Conditions expérimentales: BGE, de l&#39;acide acétique à 10% (pH 2,2); Tension de séparation, -30 kV (0,5 livres par pouce carré appliqué à l&#39;entrée du capillaire CE); injection de l&#39;échantillon, 2,0 psi pendant 60 secondes. Reproduit avec la permission 4. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54535/54535fig1large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/54535/54535fig2.jpg" /> Figure 2. Analyse de l&#39; isoleucine et la Leucine par introducteur CE-MS. Extrait électrophérogramme d&#39;ions de deux isomères d&#39;acides aminés (25 uM) obtenus avec introducteur CE-MS en mode ion positif. Conditions expérimentales: BGE, de l&#39;acide acétique à 10% (pH 2,2); Tension de séparation, 30 kV; injection de l&#39; échantillon, 2,0 psi pendant 60 secondes. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54535/54535fig2large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <img alt="Figure 3" src="/files/ftp_upload/54535/54535fig3.jpg" /> Figure 3. Potentiel d&#39;introducteur CE-MS pour le profilage des métabolites cationiques dans un extrait de lignée cellulaire. Profil métabolique (électrophérogramme ionique total) observée dans un extrait d&#39;une lignée de cellules de glioblastome avec introducteur CE-MS en mode d&#39;ions positifs. Conditions expérimentales: BGE, de l&#39;acide acétique à 10% (pH 2,2); Tension de séparation, 30 kV; injection de l&#39;échantillon, 2,0 psi pendant 60 secondes. Reproduit avec la permission 4 </sup&gt;. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54535/54535fig3large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a>

Un protocole pour le profilage métabolique des échantillons biologiques par électrophorèse capillaire et spectrométrie de masse en utilisant une conception d&#39;interface de pointe poreuse introducteur est présenté.

Introducteur Electrophorèse Capillaire-Spectrométrie de masse pour Metabolic Profiling des échantillons biologiques

In metabolomics, a wide range of analytical techniques is used for the global profiling of (endogenous) metabolites in complex samples. In this paper, a ...

L'objectif général de cette procédure est de montrer comment l'électrophorèse capillaire couplée à la spectrométrie de masse, ou CE-MS, en utilisant une interface sans gaine à embout poreux, peut être utilisée pour l'analyse de métabolites fortement polaires et chargés. Étant donné que de nombreux métabolites sont souvent chargés, pouvant être cationiques ou anioniques, les séparations électrolytiques telles que l'électrophorèse capillaire constituent la méthode la plus appropriée. Toutefois, ces dernières années, la sensibilité n'était pas suffisamment élevée.Cela était dû à l'interface et la méthode n'était pas non plus robuste. Mais je pense que nous avons résolu de manière satisfaisante les deux problèmes en utilisant une gaine comme interface libre et en appliquant ce nouveau protocole. L'électrophorèse capillaire couplée à la spectrométrie de masse, en utilisant une interface nouvelle à embout poreux sans gaine, peut être utilisée pour répondre à des questions cliniques essentielles dans le domaine de la métabolomique.Par exemple, le profilage des métabolites chargés très polaires peut être facilement réalisé à l'aide de cette technologie. Les composés S sont séparés selon leur rapport charge sur taille. Très souvent, cette technique convient particulièrement bien au profilage de ce type de composés présents en faible volume dans les échantillons biologiques.Une caractéristique unique de la méthodologie CE-MS sans gaine proposée est qu'elle peut être utilisée pour le profilage des métabolites anioniques et cationiques en inversant simplement la polarité de la tension de CE et la polarité de détection du spectromètre de masse. Généralement, les personnes novices dans cette méthode éprouvent des difficultés car la CE-MS est considérée comme une technique relativement nouvelle et complexe. Pour commencer cette procédure, placez une nouvelle cartouche en silice fondue nue équipée d'un émetteur à embout poreux dans l'instrument d'électrophorèse capillaire en zone, ou CE.Appliquez un rinçage avant avec du méthanol à 50 psi pendant 15 minutes à l’aide du logiciel contrôlant l’instrument d’électrophorèse capillaire. Vérifiez visuellement si un liquide s’écoule de la sortie du capillaire. Ensuite, effectuez un rinçage dans le sens opposé à 50 psi pendant cinq minutes en utilisant l’électrolyte de fond, ou solution BGE, afin d’examiner visuellement si un liquide s’écoule du capillaire conducteur.Répétez l'étape précédente à une pression de 100 psi au cas où aucun liquide n'aurait été observé en sortie du capillaire. Ensuite, rincez le capillaire de séparation avec de l'eau à 50 psi pendant 10 minutes, puis avec une solution d'hydroxyde de sodium 0,1 molaire à 50 psi pendant 10 minutes, de l'eau à 50 psi pendant 10 minutes, et enfin la solution de BGE à 50 psi pendant 10 minutes. Après cela, retirez l'embout pulvérisateur de la cartouche en silice fondue du tube d'eau et installez-le dans l'adaptateur de source de nanospray pour le coupler à l'instrument de spectrométrie de masse.Veillez à ce que la hauteur des flacons de solution de BGE dans l'instrument de CE corresponde à celle de l'embout du pulvérisateur. Vérifiez l'écoulement du liquide à travers le capillaire conducteur en rinçant avec la solution de BGE à 50 psi pendant cinq minutes. Pendant cette étape de rinçage, une goutte de liquide doit être observée à la base de l'aiguille du pulvérisateur d'ionisation par électrospray, ou ESI.Après le rinçage, rincez le capillaire de séparation avec la solution de BGE à 50 psi pendant 10 minutes dans le sens direct. Une goutte de liquide doit être observée à l'extrémité de l'émetteur à embout poreux pendant cette étape. Placez maintenant l'émetteur à embout poreux à l'entrée de l'admission du spectromètre de masse à une distance approximative de deux à trois mm.Appliquer une tension de 30 kV en utilisant un temps de rampe d'une minute et commencer l'acquisition des données de spectrométrie de masse dans la plage de rapport masse/charge de 65 à 1000 pour des études de profilage métabolique, en utilisant d'abord une tension ESI de zéro. Régler la tension ESI à 1000 V pendant la mesure des données. Augmenter la tension ESI par incréments de 200 V jusqu'à ce qu'un signal de fond constant soit observé pendant au moins 15 minutes.Transférez 20 microlitres d’un mélange standard de métabolites anioniques préparé au préalable dans un microflacon vide de 100 microlitres. Placez le microflacon dans un flacon CE, puis insérez le flacon CE dans le plateau d’échantillonnage d’entrée. Lancez une méthode d’acquisition en mode ions négatifs MS créée précédemment, puis démarrez la séquence CE à l’aide du logiciel de contrôle de l’instrument CE.Après cela, rincez le capillaire de séparation avec la solution de BGE à 50 psi pendant trois minutes, puis effectuez des injections à 2 psi pendant 60 secondes et à 1 psi pendant 10 secondes. Appliquez une tension de 30 kV avec un temps de rampe d'une minute et une pression de 0,5 psi pendant 30 minutes à l'entrée. Après une séparation électrophorétique de 30 minutes, arrêtez l'acquisition des données de spectrométrie de masse et réduisez la tension de CE à 1 kV en utilisant un temps de rampe de cinq minutes.Entre chaque injection d'échantillon, rincez le capillaire de séparation avec de l'eau, de l'hydroxyde de sodium 0,1 molaire, de l'eau et de la solution de BGE à 30 psi pendant trois minutes. Une fois les analyses terminées, analysez les données enregistrées en déterminant les temps de migration et l'intensité du signal du mélange d'analytes métabolites anioniques. Évaluez si les étalons de métabolites anioniques apparaissent dans la région comprise entre 10 et 28 minutes.Ensuite, vérifier si les trois isomères structurellement apparentés, le D-glucose 1-phosphate, le D-glucose 6-phosphate et le D-fructose 6-phosphate, sont partiellement séparés. Les performances de séparation de la méthode CE-MS sans gaine pour l'analyse de métabolites anioniques hautement polaires sont illustrées à l'aide de trois isomères de phosphate de sucre structurellement apparentés. Bien qu'une séparation de base n'ait pas été obtenue pour ces trois analytes, une séparation partielle suffit pour permettre leur détection sélective par spectrométrie de masse (MS), puisque ces analytes possèdent la même masse exacte.Lors de l'analyse d'échantillons biologiques à l'aide de cette méthodologie CE-MS sans gaine, il est important de vérifier régulièrement les performances analytiques au fil du temps en utilisant des étalons académiques. Dans l'ensemble, la méthodologie sans gaine permet le profilage de ce type de composés dans des échantillons biologiques ultra faibles, ouvrant ainsi de nombreuses possibilités pour l'analyse de ce type d'échantillons dans les domaines des sciences biomédicales, de la chimie bioanalytique, ainsi que dans d'autres domaines de recherche. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière de coupler la CE à la MS au moyen d'une interface poreuse sans gaine pour le profilage de métabolites fortement polaires et chargés.

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