Name: Procédé pour lidentification dinhibiteurs de petites molécules de linteraction protéine-protéine entre HCN1 et TRIP8b (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-11T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 20 s
Description: Découvrez une méthode de polarisation de fluorescence pour identifier des inhibiteurs de petites molécules de l'interaction TRIP8b-HCN1. Cette approche en haut débit vise à développer de nouveaux traitements contre la dépression et la douleur chronique.

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Ce travail a été soutenu par les National Institutes of Health Grant R21MH104471 et R01MH106511 (D.M.C.), Brain Research Foundation SG 2012-01 (D.M.C.), Northwestern University Clinical and Translational Sciences Institute 8UL1TR000150 (Y.H.), Chicago Biomedical Consortium HTS-004 (Y.H. et D.M.C.), et National Institutes of Health Grant 2T32MH067564 (K.L.). Une partie de ce travail a été réalisée par le Medicinal and Synthetic Chemistry Core (ChemCore) de l’Université Northwestern au Center for Molecular Innovation and Drug Discovery (CMIDD), qui est financé par le Chicago Biomedical Consortium avec le soutien des fonds Searle du Chicago Community Trust et de la subvention de soutien P30 du Cancer Center CA060553 du National Cancer Institute attribuée au Robert H. Lurie Comprehensive Cancer Center. Le travail de dépistage à haut débit a été effectué dans le laboratoire d’analyse à haut débit, qui est également une installation centrale du Robert H. Lurie Comprehensive Cancer Center.

1. La purification du TRIP8b (241-602) Protéines <ol><li> Transformer le plasmide contenant TRIP8b (241-602) dans la bactérienne expression de la protéine vecteur pGS21 3 dans E. compétente coli pour l&#39; expression de la protéine selon les instructions du fabricant. Plaque 300 ul de la culture sur bouillon de Luria (LB) -agar avec 5 ug / ml de chloramphenicol et à l&#39;ampicilline. Incuber la plaque à 37 ° C pendant 16 heures. </li><li> Le lendemain, choisir une seule colonie à inoculer 50 ml LB avec 50 pg / ml de chloramphénicol et ampicilline. Incuber la culture à 37 ° C pendant 16 heures (avec agitation). </li><li> Ajouter 50 ml de la culture à 1 litre de milieu LB avec 50 ug / ml d&#39;ampicilline. Incuber à 37 ° C sous agitation. </li><li> Une fois que la culture a atteint une DO 600 de 0,8 à 1,2 lecture, de modifier la température de l&#39;incubateur à 18 ° C et on ajoute de l&#39; IPTG (isopropyl-bêta-D-thiogalactoside) jusqu&#39;à une concentration finale de 1 mM. Permettre l&#39;expression des protéines de procéder pendant 16 heures. </li><li> Spin sur le E. coli à 6000 g pendant 15 min à 4 ° C pour sédimenter les bactéries. Après avoir enlevé les tubes de la centrifugeuse, maintenir les bactéries sur de la glace pour le reste de la procédure. Remettre en suspension les bactéries dans 36 ml de tampon A avec 0,25 mM de fluorure de phénylméthanesulfonyle (PMSF). </li><li> Soniquer les bactéries remises en suspension sur la glace à l&#39;aide d&#39;un boulon plat pendant 5-10 minutes, alternant entre 30 sec &#39;on&#39; et 30 sec &#39;off&#39; à haute puissance. </li><li> Centrifugeuse à 12.000 xg pendant 15 min à 4 ° C. Centrifuger pendant 15 minutes supplémentaires si le surnageant est pas encore clair. </li><li> Appliquer le surnageant sur une colonne de 2 ml de billes de Ni-NTA. Incuber pendant 60 min à 4 ° C avec doux balancement. </li><li> Permettre à la matière non liée à l&#39;écoulement à travers la colonne et laver avec 500 ml de tampon A. </li><li> Laver la colonne avec 250 ml de tampon B. </li><li> Laver la colonne avec 125 ml de tampon A additionné de 5 mM d&#39;imidazole. </li><li> Eluer la protéine from de la colonne avec 20 ml de tampon d&#39;élution. </li><li> Ajouter la protéine éluée à une cassette de dialyse (coupure de poids moléculaire - 10 kDa) à l&#39;aide d&#39;une seringue. Dialyser la protéine pendant 60 minutes à 4 L de phosphate froid Buffered Saline (PBS) à 4 ° C. </li><li> Déplacer la cassette de dialyse dans une nouvelle 4 L seau de PBS froid. Dialyser protéines pendant 16 heures à 4 ° C </li><li> Le lendemain matin, vérifier la concentration en protéine en utilisant un kit d&#39;essai de protéines Coomassie, en suivant les instructions du fabricant. Concentrer la protéine en utilisant un concentrateur de protéines, en suivant les instructions du fabricant, si une concentration inférieure à 40 um est observée. Aliquoter et congeler à -80 ° C pour le stockage. </li></ol> 2. Small Scale Fluorescence Polarisation Assay pour caractériser l&#39;interaction des deux fragments de protéines <ol><li> Décongeler 200 pi de 40 uM TRIP8b (241-602) et l&#39;ajouter à un tube de 1,5 ml. Ajouter 100 pi de PBS à 11 tubes de 1,5 ml supplémentaires. </li><li> Effectuer des dilutions successives par transfert de 100 ul de TRIP8b (241-602) à partir du tube d&#39;origine dans le tube suivant dans la série, pipetage de haut en bas, et en répétant le processus. Ceci va produire une série de 12 points de dilutions de 2 fois de TRIP8b (241-602) allant de 0,01 à 40 uM. </li><li> Préparer un mélange maître 650 pi de 0,1 uM HCN1 FITC (6,5 pi d&#39;une partie aliquote de 10 uM) et mM dithiothréitol 2 (DTT) dans du PBS. Remarque: Le mélange maître est 2x. </li><li> Mettre en place 12 nouveaux tubes de 1,5 ml. Ajouter 50 ul du mélange maître contenant HCN1 FITC à chaque tube, puis ajouter 50 pi de chacune des 12 dilutions en série. Note: Ceci générera 12 tubes, chacun contenant 0,05 uM HCN1 FITC et la moitié de la concentration TRIP8b (241-602) à partir de la dilution en série d&#39; origine. </li><li> Ajouter la série de dilutions d&#39;une plaque d&#39;essai, 30 ul par puits, en triple. Utilisez un solide plaque de 384 puits à faible liaison noir. </li><li> Faites tourner la plaque fou 2 min à 900 xg à température ambiante. </li><li> Lire la plaque en utilisant un lecteur de microplaques, en suivant les instructions du fabricant. Mesurer la polarisation de fluorescence en utilisant les paramètres de mesure suivants: excitation 485 nm, émission 530 nm, 505 nm, un miroir dichroïque 100 msec de temps d&#39;intégration. </li><li> Tracer les valeurs de polarisation (mP) par rapport à la TRIP8b (241-602) la concentration sur une échelle logarithmique. Monter les données avec l&#39;équation de Hill pour déterminer l&#39;affinité (K d) de TRIP8b (241-602) pour le peptide HCN1 marqué. Remarque: Pour la préparation des dilutions en série, d&#39;une plaque multi-puits peut également être utilisé à la place de tubes. </li></ol> 3. Examiner l&#39;interaction protéine-protéine Utilisation d&#39;un contrôle positif <ol><li> Ajouter 200 ul de peptide non marqué HCN1 (200 uM) dans un tube de 1,5 ml. Ajouter 100 pi de PBS à 11 tubes de 1,5 ml supplémentaires. Effectuer des dilutions successives par transfert de 100 ul du tube contenant 200 ul de peptide au premier tubede 100 ul de PBS. Répétez le processus pour générer 12 tubes avec 2 dilutions d&#39;un facteur non marqué peptide HCN1. </li><li> Préparer un mélange maître 650 pi de 0,2 uM HCN1 FITC et 4 uM TRIP8b (241-602). Note: Ceci est une solution 2x. </li><li> Ajouter 50 pi de mélange maître à 12 nouveaux tubes de 1,5 ml. </li><li> Ajouter 50 ul de chaque dilution en série dans un tube de 1,5 ml. </li><li> Chargez le 384 puits plaque de microtitration noire en triple exemplaire, en ajoutant 30 pi par puits. </li><li> Centrifuger la plaque pendant 2 min à 900 xg à température ambiante. </li><li> Lire la plaque en utilisant un lecteur de microplaques capable de FP. Utilisez les mêmes paramètres que décrit dans l&#39;étape 2.7. </li><li> Calculer l&#39;affinité du peptide non marqué pour TRIP8b (241-602) en utilisant l&#39;équation de Cheng-Prusoff: K 1 = d IC50 / (1 + [L] / Kd 2), où Kd 1 représente l&#39;affinité de la non marquée peptide pour TRIP8b (241-602), l&#39; IC 50 est déterminée à l&#39;étape précédenteet représente la capacité du ligand non marqué pour déplacer le ligand marqué, [L] est la concentration du ligand marqué à l&#39; étape 3.2, et K d 2 est l&#39;affinité de TRIPb (241-602) pour le ligand marqué. </li></ol> 4. Évaluer Assay Performance (Calculer le facteur Z) <ol><li> Préparer un mélange maître en faisant une solution de tampon FP 12 ml avec 2 uM TRIP8b (241-602), 50 nM HCN1 FITC, et 1 mM de DTT dans FP Buffer. Remarque: Il faudra 60 pi de 40 uM TRIP8b (241-602), 60 pl de 10 uM HCN1 FITC, et 1.080 pi de FP Buffer. </li><li> Ajouter 30 ul du mélange maître à chaque puits d&#39;un 384 puits plaque de microtitration noire. </li><li> Ajouter 1 pi de 1 mM de peptide non marqué HCN1 à 192 puits pour servir de contrôle positif. </li><li> Ajouter 1 pi de tampon FP à 192 puits pour servir de témoin négatif. </li><li> Centrifuger la plaque pendant 2 min à 900 xg à température ambiante. </li><li> Lire la plaque à l&#39;aide d&#39;une milecteur croplate. </li><li> Calculer le facteur de Z pour le dosage en utilisant la formule suivante: Z = 1-3 * (σ pos -σ neg) / (μ neg -μ pos) où σ pos et σ neg sont les écarts - types des puits témoins positifs et négatifs et pos μ et neg μ représentent les signaux de moyenne dans les puits témoins positifs et négatifs. </li></ol> Écran 5. High Throughput <ol><li> Décongeler aliquotes de TRIP8b (241-602) et HCN1 FITC et les garder sur la glace. </li><li> Préparer 10 ml de TRIP8b (2 uM) et HCN1 FITC (50 nM) dans un tampon FP. </li><li> Distribuer 25 pi du mélange dans chaque puits d&#39;une liaison de 384 puits plaque de microtitrage noire à l&#39;aide d&#39;une pipette faible. </li><li> Pour le criblage de banques, ajouter des composés dans chaque puits de colonnes 3 à 22 (40 pM concentration finale pour chaque) en utilisant un manipulateur de liquide acoustique. Remarque: En raison de la relativeltaux de succès faible y observée avec ce test, deux composés différents ont été regroupées en un seul puits. Les deux composés de chaque puits actifs ont ensuite été testés individuellement pour identifier qui a conféré l&#39;activité. </li><li> Ajouter 100 nl de diméthylsulfoxide (DMSO) dans chaque puits des colonnes 1 et 23 de chaque plaque comme témoins négatifs. </li><li> Ajouter peptide non marqué de HCN1 dans chaque puits des colonnes 2 et 24 de chaque plaque de contrôles positifs. </li><li> Incuber les plaques à température ambiante pendant 2 h. Lire plaques ou incuber à 4 ° C pendant 16 h avant la lecture. </li><li> Mesurer la polarisation de fluorescence sur un lecteur de plaque. Utilisez les mêmes paramètres que décrit dans l&#39;étape 2.7. </li><li> Calculer l&#39;inhibition pour cent en normalisant les signaux en utilisant les contrôles positifs et négatifs moyennes de chaque plaque de 100%. Utiliser l&#39;équation xn = 100% * ((X nég - X) / (X nég - X pos)) où X N est le pour cent d&#39; inhibition normalisée correspondant au signal X, X pos </sub&gt; Est le signal moyen provenant des puits témoins positifs et X est nég le signal provenant des puits témoins négatifs. </li></ol> 6. Confirmation de hits Utilisation TAMRA-tagged HCN Peptide <ol><li> Valider frappe avec plus de 50% d&#39; inhibition à l&#39; aide peptide HCN1 TAMRA marqué (HCN1 TAMRA). <ol><li> Préparer un mélange maître de 12 ml de 2 uM TRIP8b (241-602) et 50 nM HCN1 TAMRA dans FP tampon. </li><li> Distribuer 25 ul du mélange maître dans chaque puits d&#39;un 384 puits plaque de microtitration noire. </li><li> Transférer des dilutions en série de chacun des composés actifs dans les puits respectifs. Réaliser deux dilutions de telle sorte que la concentration de chaque frappe est comprise entre 0,2 pm à 200 pm. </li><li> Pour les réactions de contrôle négatif, transférer 100 nl de DMSO dans chaque puits. Pour le contrôle positif ajouter 100 nl de dilution en série peptide HCN1 non marqué avec une concentration finale allant de 200 uM à 0,1 uM. </li><li> Incuber la plaque à température ambiantependant 2 heures. Lire plaques ou incuber pendant 16 h à 4 ° C avant la lecture. </li><li> Mesurer la polarisation de fluorescence (PF) en utilisant les paramètres de mesure suivants: 535 nm d&#39;excitation; 580 nm, émission; 535 miroir dichroïque nm, 20 temps d&#39;intégration msec. </li><li> Calculer des valeurs de CI50 en ajustant les données FP dépendant de la concentration de chaque composé en utilisant un modèle de régression non linéaire à quatre paramètres 23. </li></ol></li></ol> 7. dose-réponse Validation du dosage de proximité à base de perles <ol><li> Décongeler 1 aliquote de TRIP8b marquée par His (241-602) (His-TRIP8b) et HCN1 TPS-étiqueté (GST HCN1 C40) des protéines de fusion et de les garder sur la glace. </li><li> Combiner His- TRIP8b avec GST-C40 HCN1 dans le tampon d&#39;essai à des concentrations de 400 nM de His-TRIP8b et 40 nM TPS HCN1 C40. Préparer 300 ul du mélange pour chaque composé à tester. Note: Les composés sont en triple à 11 concentrations différentes, plus un DMSO témoin (sans composé). </li><li> Pour les puits témoins, préparer 30 pl de His-TRIP8b (200 nM) sans GST-HCN1C40 et préparer ensuite séparément 30 pi de GST-HCN1C40 (20 nM) sans His-TRIP8b dans un tampon de dosage. </li><li> Pour chaque composé à tester, ajouter 7 ul de la His-TRIP8b mélange de GST-C40 HCN1 (préparé à l&#39; étape 7.2 ci - dessus) à 36 puits d&#39;une plaque à l&#39; aide d&#39; une pipette 16 canaux. Pour tester un composé unique, disposer les 12 concentrations différentes dans les lignes AL et les trois répétitions dans les colonnes 1-3. Ajouter 7 pi de la solution His-TRIP8b (préparé en 7.3) aux colonnes 1-3 de la ligne M et 7 pi de solution GST-HCN1 C40 (préparé en 7.3) aux colonnes 1-3 de rang N. centrifuger brièvement la plaque assurer que les liquides sont au fond de chaque puits et d&#39;éliminer toutes les bulles. </li><li> Distribuer les composés de succès à tester dans la plaque de telle sorte que la concentration de chaque frappe varie de 200 uM (dans la ligne A) jusqu&#39;à 0,1 uM (dans la rangée K). Distribuer un volume deDMSO dans les lignes LN qui correspond à la quantité de composé distribué dans des rangées AK. </li><li> Agiter la plaque pendant 2 min et incuber pendant 2,5 h à la température ambiante. </li><li> Diluer les billes accepteurs anti-GST 1:50 avec du tampon de dosage. </li><li> Ajouter 3,5 pi des perles accepteurs dilué à chaque puits de la plaque avec une pipette 16 canaux et mélanger par pipetage doucement pour éviter de créer des bulles. </li><li> Incuber la plaque pendant 1 heure à température ambiante dans l&#39;obscurité. </li><li> Diluer les perles donateurs Nickel Chelate 1:50 avec un tampon d&#39;essai. Ne pas exposer le mélange à la lumière. </li><li> Ajouter 3,5 pi des perles de donateurs dilué à chaque puits de la plaque avec une pipette 16 canaux et mélanger par pipetage doucement pour éviter de créer des bulles. </li><li> Incuber la plaque pendant 1,5 heure à température ambiante dans l&#39;obscurité. </li><li> Lire sur un lecteur de plaque. Utilisez un lecteur de plaque avec les paramètres de mesure suivants: 40 msec excitation temps, 100 temps d&#39;émission msec, 0,1 mm hauteur de détection. </li><li> Calculer CI 50 par ajustement des données pour each composé en utilisant un modèle de régression non linéaire à quatre paramètres 23. </li></ol>

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</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

En raison de son potentiel en tant que cible thérapeutique dans 24 CDEM, il y a eu un intérêt considérable dans les approches pharmacologiques qui contrarient la fonction du canal HCN dans le système nerveux central 4. Cependant, ces efforts ont été bloquées par le rôle important des canaux HCN dans pacemaker cardiaque et le risque d&#39;arythmie 25. Nous avons pensé que perturber l&#39;interaction entre HCN et sa sous - unité auxiliaire spécifique du cerveau, TRIP8b 8, pourra...

(HCN) canaux de nucleotide cyclique hyperpolarisation activé sont exprimés dans le cœur et le système nerveux central où ils jouent un rôle important dans la régulation de l&#39; excitabilité membrane 1. Canaux HCN ont été impliqués dans la pathogenèse du trouble dépressif majeur (MDD) 2, ce qui a conduit plusieurs groupes de proposer que la limitation de HCN fonction du canal pharmacologiquement peut être efficace comme un nouveau traitement pour CDEM 3. Cependant, ciblant directement les canaux HCN est pas viable en raison de leur rôle important dans le potentiel d&#39;action cardiaque 4. Ivabradine, le seul approuvé par la FDA antagoniste des canaux HCN, est utilisé pour le traitement de l&#39; insuffisance cardiaque pour produire un effet bradycardie 5. En tant que tel, il existe un besoin pour des agents pharmacologiques qui limitent la fonction des canaux HCN exclusivement dans le système nerveux central. Tétratricopeptide répéter contenant Rab8b interacting protein (TRIP8b) est une spécificité du cerveaufic sous - unité auxiliaire des canaux HCN qui contrôle l&#39;expression de surface et la localisation des canaux HCN 6,7. KO génétique des TRIP8b provoque une diminution du cerveau canaux HCN 7 sans affecter l&#39; expression de HCN au cœur 8. Fait intéressant, les souris knock - out TRIP8b passent moins de temps immobile sur la tâche de la tâche de la nage forcée et la queue suspension 7, deux tests de dépistage couramment utilisés pour l&#39; efficacité antidépressive 9-11. Ces résultats suggèrent que plutôt que de cibler directement les canaux HCN avec une petite molécule antagoniste fonction du canal HCN, perturbant l&#39;interaction entre TRIP8b et HCN peut être suffisante pour produire un comportement antidépresseur. TRIP8b se lie à HCN à deux sites de liaison distincts. Le domaine de liaison des nucléotides cycliques (CNBD) de HCN interagit avec un domaine conservé de la borne N TRIP8b situé aux domaines de TPR de TRIP8b 12,13. Bien que les résidus du CNBD qui sont impliqués dans cetteinteraction ont été cartographiés 14, la région de TRIP8b qui est impliqué n&#39;a pas été réduite au - delà de fragment d&#39;acide an-80-amino 13. Une seconde interaction se produit entre les domaines de répétition tétratricopeptide (TPR) de TRIP8b et la C tripeptide terminale de HCN ( «SNL» dans HCN1, HCN2 et HCN4, mais &#39;ANM&#39; dans HCN3) 3,12. La structure cristalline a récemment résolu 15 de cette C queue interaction a révélé une similarité structurale importante à l&#39;interaction entre le récepteur à l&#39;importation des peroxysomes, Peroxin 5 (PEX5), et ses partenaires d&#39; interaction, contenant de type 1 peroxysomaux ciblant des séquences (PTS1) 16. Bien que les deux sites d&#39;interaction sont nécessaires pour le fonctionnement des canaux HCN, l&#39;interaction entre les domaines TPR de TRIP8b et la borne C du tripeptide HCN1 sert de site de liaison dominant et régule l&#39;expression de surface de HCN. Par conséquent, cette interaction a été choisi comme site de ciblage dans cette étude.Pour le reste du manuscrit, lorsqu&#39;il est fait référence à l&#39;interaction entre TRIP8b et de HCN, il est que cette interaction est fait référence. Cette interaction est récapitulée par un fragment hautement soluble de TRIP8b correspondant à son terminal conservé C contenant les domaines TPR requis pour la liaison C queue terminale de HCN (résidus 241-602 de 1a-4 isoformes de TRIP8b) 3. Afin de développer un écran à haut débit pour identifier des petites molécules capables de perturber cette interaction, une polarisation de fluorescence (FP) à base de test a été utilisé 17. La polarisation de fluorescence est basée sur l&#39;excitation d&#39;un ligand marquée par un fluorophore avec une lumière polarisée, et à mesurer le degré de polarisation de la fluorescence émise 18. En présence d&#39;un partenaire de liaison, le mouvement du ligand fluorescent de rotation est limitée et la lumière polarisée est émis 19. En l&#39;absence d&#39;un partenaire de liaison, til mouvement du ligand de rotation conduit à l&#39;émission de lumière dépolarisée. Dans le protocole ci-joint, un procédé pour la purification de N tagged terminal (6xHis) TRIP8b (241-602) en utilisant de l&#39;acide nickel-nitrilotriacétique (Ni-NTA) des billes est présenté. Un protocole similaire a été utilisée pour purifier le glutathion-S-transférase (GST) -tagged C terminaux 40 acides aminés de HCN1 (HCN1 c40) utilisé dans l&#39; étape 7 du protocole. Pour des considérations d&#39;espace, une description détaillée de cette procédure a été omise. Dans les étapes 2 à 7 du protocole, un dépistage flux de travail à haut débit est présenté (voir Figure 1). Les interactions protéine-protéine sont une cible notoirement difficile pour le criblage à haut débit et les lecteurs sont invités à rechercher des ressources supplémentaires sur le sujet 20. Les étapes 2 et 3 de la procédure de caractériser l&#39;affinité in vitro du TRIP8b purifié (241-602) construire fora isothiocyanate de fluorescéine (FITC) -tagged onze peptide d&#39;acides aminés correspondant à l&#39; extrémité C terminale de la queue HCN1 (HCN1 FITC). Sur la base de la structure cristalline du complexe HCN TRIP8b-15, ce segment d&#39;acides aminés onze est suffisante pour produire la liaison avec TRIP8b (241-602). Dans l&#39; étape 2, la valeur de Kd de l&#39;interaction est mesurée par titrage TRIP8b (241-602) en une concentration fixe de HCN1 FITC. À l&#39; étape 3, une version non marquée du peptide HCN utilisé dans l&#39; étape 2 est titré en une concentration fixe de deux TRIP8b (241-602) et HCN1 FITC pour examiner si la balise FITC interfère avec la liaison. Ces expériences sont essentielles pour le choix des concentrations appropriées de TRIP8b (241-602) et HCN1 FITC utilisés dans le criblage à haut débit. La prémisse de l&#39;écran à haut débit est qu&#39;une petite molécule capable de perturber l&#39;interaction entre TRIP8b (241-602) et HCN1 FITC produira un décembrerease en lumière polarisée. A l&#39; étape 4, le facteur Z de l&#39;essai est calculée 21 pour une concentration donnée de TRIP8b (241-602) et HCN1 FITC pour garantir que l&#39;essai est approprié pour le criblage à haut débit (étape 5). Les étapes 6 et 7 sont des essais de validation pour confirmer que les résultats identifiés dans l&#39;écran à haut débit primaire agissent en perturbant l&#39;interaction entre TRIP8b (241-602) et HCN1 FITC plutôt que par un mécanisme non spécifique. Dans l&#39; étape 6, carboxytétraméthylrhodamine (TAMRA) marqué au HCN1 peptide (HCN1 TAMRA) est utilisé dans un essai de polarisation de fluorescence par ailleurs identique à filtrer des composés fluorescents qui compromettent le dosage FP utilisant le tag FITC. Etape 7 utilise un plus grand HCN1 fragment C terminal (HCN1 C40) et emploie une analyse de proximité à base de billes, qui est basé sur le «tunnel» d&#39;un oxygène singulet à partir d&#39; un cordon de donneur à un bourrelet d&#39;accepteur amené à proximité les uns des autres par des protéines qui interagissent 22.

<table><tbody><tr><td>Agarose Ni-NTA&nbsp ;</td><td>Qiagen</td><td>30210</td><td></td></tr><tr><td>Cassette de dialyse&nbsp ;</td><td>ThermoFisher</td><td>66456</td><td></td></tr><tr><td>Isopropyle b-D-1-thiogalactopyranoside&nbsp ;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I5502 - 1 gr</td><td></td></tr><tr><td>384-Well Plaque noire&nbsp ;</td><td>Corning</td><td>3820</td><td></td></tr><tr><td>Proxiplate&nbsp ;</td><td>Perkin-Elmer&nbsp ;</td><td></td><td></td>6008289</tr><tr><td>Perles d’accepteur anti-GST&nbsp ;</td><td>Perkin-Elmer&nbsp ;</td><td>6760603C</td><td></td></tr><tr><td>NiChelate</td><td>Perkin-Elmer&nbsp ;</td><td>AS101D</td><td></td></tr><tr><td>pGS21-a</td><td>Genscript</td><td>SD0121</td><td></td></tr><tr><td>PMSF</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10837091001</td><td></td></tr><tr><td>Coomassie Kit</td><td>ThermoFisher</td><td>23200</td><td></td></tr><tr><td>Concentrateur de protéines</td><td>ThermoFisher</td><td>88527</td><td></td></tr><tr><td>Perkin Elmer Enspire Lecteur de plaques</td><td>multimode Perkin-Elmer&nbsp ;</td><td>#2300-001M</td><td></td></tr><tr><td>BL21 (DE3) Cellules Compétentes</td><td>Agilent</td><td>200131</td><td></td></tr></tbody></table>

procédé pour l&#39;identification d&#39;inhibiteurs de petites molécules de l&#39;interaction protéine-protéine entre hcn1 et trip8b

Method for Identifying Small Molecule Inhibitors of the Protein-protein Interaction Between HCN1 and TRIP8b

(HCN) canaux de nucleotide cyclique activé par hyperpolarisation sont exprimés de façon ubiquitaire dans le cerveau, où ils fonctionnent pour réguler l&#39;excitabilité des neurones. La distribution subcellulaire de ces canaux dans les neurones pyramidaux de la zone hippocampique CA1 est régulée par tétratricopeptide Rab8b contenant des protéines de répétition interagissant (TRIP8b), une sous-unité auxiliaire. KO génétique de HCN formation de pores sous-unités ou TRIP8b, à la fois conduire à une augmentation des comportements antidépresseur, ce qui suggère que la limitation de la fonction des canaux HCN peut être utile en tant que traitement du trouble dépressif majeur (TDM). Malgré l&#39;intérêt thérapeutique significatif, les canaux HCN sont également exprimés dans le cœur, où ils régulent la rythmicité. Pour contourner les problèmes hors-cible associés aux bloquant les canaux HCN cardiaques, notre laboratoire a récemment proposé le ciblage de l&#39;interaction protéine-protéine entre HCN et TRIP8b afin de perturber spécifiquement la fonction du canal HCN dans le cerveau.TRIP8b se lie à HCN pore formant des sous-unités à deux sites d&#39;interaction distincts, bien qu&#39;ici l&#39;accent est mis sur l&#39;interaction entre la répétition de tétratricopeptide (TPR) domaines de TRIP8b et la C queue terminale de HCN1. Dans ce protocole, une description plus détaillée d&#39;un procédé de purification TRIP8b et l&#39;exécution d&#39;un écran à haut débit pour identifier les petites molécules inhibitrices de l&#39;interaction entre HCN et TRIP8b, est décrit. Le procédé de criblage à haut débit utilise une polarisation de fluorescence (FP) à base de test pour surveiller la liaison d&#39;un grand fragment de TRIP8b à un onze fluorophores marqués aminés peptide acide correspondant à la queue terminale HCN1 C. Cette méthode permet de composés «hit» d&#39;être identifiés sur la base de la variation de la polarisation de la lumière émise. tests de validation sont ensuite effectués pour veiller à ce que «hit» composés ne sont pas artifactual.

Pour éviter les problèmes de droits d&#39;auteur avec notre précédente publication, une sonde TAMRA-étiqueté HCN1 TAMRA a été utilisé pour générer des figures 2 et 3. Notez que cette substitution n&#39;a pas fait une différence appréciable dans les résultats, et les protocoles sont identiques à celles décrites ci - dessus avec HCN1 FITC. Pour évaluer l&#39;interaction avec HCN1 TAMRA, TRIP8b (241-602) a été titré en une c...

L&#39;interaction entre les canaux HCN et leur sous-unité auxiliaire a été identifié comme une cible thérapeutique dans le trouble dépressif majeur. Ici, une méthode basée sur la polarisation de fluorescence pour identifier les petites molécules inhibitrices de cette interaction protéine-protéine, est présentée.

Procédé pour l&#39;identification d&#39;inhibiteurs de petites molécules de l&#39;interaction protéine-protéine entre HCN1 et TRIP8b

Hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated (HCN) channels are expressed ubiquitously throughout the brain, where they function to regulate the ...

L'objectif général de cette procédure est d'identifier des petites molécules capables de perturber l'interaction entre TRIP8b et les canaux HCN. Cette méthode permet d'identifier des molécules candidates qui pourraient être développées en de nouveaux traitements contre la dépression. Le principal avantage de cette technique est qu'elle peut être réalisée de manière haut débit.Cette technique a des implications pour le développement d'un traitement innovant du trouble dépressif majeur, car notre laboratoire a montré que l'interférence de la liaison entre TRIP8b et HCN pourrait présenter un intérêt thérapeutique. Bien que cette méthode ait été conçue en pensant à la dépression, la perturbation de l'interaction entre TRIP8b et HCN pourrait également être bénéfique dans d'autres affections telles que la douleur chronique. La démonstration visuelle de ce protocole est importante car elle illustre les avantages liés à l'utilisation d'instruments automatisés à haut débit pour faire progresser la recherche fondamentale et translationnelle dans des installations ouvertes comme le laboratoire d'analyse à haut débit de l'Université Northwestern.Après avoir purifié le fragment protéique TRIP8b

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