Procédé pour l'identification d'inhibiteurs de petites molécules de l'interaction protéine-protéine entre HCN1 et TRIP8b

L’objectif global de cette procédure est d’identifier de petites molécules capables de perturber l’interaction entre les canaux TRIP8b et HCN. Cette méthode identifie des molécules candidates qui pourraient être développées dans de nouveaux traitements pour la dépression. Le principal avantage de cette technique est qu’elle peut être réalisée à haut débit.

Cette technique a des implications pour le développement d’un nouveau traitement pour le trouble dépressif majeur, car notre laboratoire a montré que la perturbation de la liaison de TRIP8b au HCN peut être bénéfique sur le plan thérapeutique. Bien que cette méthode ait été développée en tenant compte de la dépression, la perturbation de l’interaction entre TRIP8b et HCN peut être bénéfique sur le plan thérapeutique dans d’autres troubles tels que la douleur chronique. La démonstration visuelle de ce protocole est importante car elle illustre les avantages de l’utilisation d’instruments automatisés à haut débit pour faire progresser la recherche fondamentale et translationnelle dans des installations ouvertes comme le laboratoire d’analyse à haut débit de l’Université Northwestern.

Après avoir purifié le fragment de protéine TRIP8b 241-602 et examiné les interactions protéiques avec un contrôle positif selon le protocole de texte, décongeler les aliquotes de TRIP8b et HCN1-FITC et les maintenir sur glace. Utilisez FP Buffer pour préparer 20 millilitres de 2 micromolaires TRIP8b et 50 nanomolaires HCN1-FITC. Ensuite, versez 25 microlitres du mélange dans chaque puits d’une plaque de microtitration noire de 384 puits à faible liaison.

Pour le criblage en banque, utilisez un manipulateur de liquide acoustique pour distribuer 100 nanolitres de composés dans chaque puits des colonnes 3 à 22 pour une concentration finale de 40 micromoles. Distribuez 100 nanolitres de DMSO dans chaque puits des colonnes 1 et 23 en tant que témoins négatifs. Distribuer 100 nanolitres de peptide HCN1 non marqué dans chaque puits des colonnes 2 et 24 en tant que témoins positifs avec une concentration finale de 10 micromoles.

Incuber les plaques à température ambiante pendant deux heures. À l’aide d’un lecteur de plaques, mesurez la polarisation de fluorescence. Alternativement, les plaques peuvent être stockées pendant 16 heures à 4 degrés Celsius avant la lecture.

À l’aide de l’équation suivante, calculez le pourcentage d’inhibition où XN est le pourcentage normalisé d’inhibition correspondant au signal X.X positif est le signal moyen des puits de contrôle positifs et X négatif est le signal moyen des puits de contrôle négatifs. Pour valider les résultats avec une inhibition de plus de 50 %, préparez un mélange maître de 20 millilitres de 2 micromolaires TRIP8b et de 50 nanomolaires HCN1 TAMRA dans un tampon FP. Distribuez 25 microlitres du mélange principal dans chaque puits d’une plaque de microtitration noire de 384 puits.

Ajoutez ensuite 100 nanolitres de composés à partir d’une plaque contenant des dilutions en série doubles de chaque composé actif dans les puits respectifs. Pour les puits de contrôle négatifs, ajoutez 100 nanolitres de DMSO. Pour un contrôle positif, ajoutez 100 nanolitres de peptide HCN1 non marqué dilué en série avec des concentrations finales allant de 200 micromoles à 0,1 micromoles.

Incuber la plaque à température ambiante pendant deux heures, ou à 4 degrés Celsius pendant 16 heures. À l’aide d’un lecteur de plaques, mesurez la polarisation de fluorescence. Calculez les valeurs CI50 en ajustant les données FP dépendantes de la concentration de chaque composé à l’aide d’un modèle de régression non linéaire à 4 paramètres.

Décongelez une aliquote de chacune des protéines de fusion HCN1 marquées HIS TRIP8b et GST et conservez-les sur la glace. Préparez 1 millilitre de 200 nanomolaires de HIS TRIP8b et 20 nanomoles de GST-HCN1C40 dans un tampon de dosage pour chaque composé à tester. À l’aide d’une pipette à 16 canaux, ajoutez 7 microlitres du mélange HIS-TRIP8b GST-HCN1C40 à trois puits par rangée de rangées A à N afin de tester chaque composé en trois exemplaires.

Centrifugez brièvement la plaque pour vous assurer que les liquides sont au fond de chaque puits et pour éliminer les bulles. Ensuite, distribuez les composés Hit à tester dans la plaque pour obtenir une concentration finale de 200 micromoles dans la rangée A et en terminant par 0,1 micromole dans la rangée L.Ajoutez le même volume de DMSO dans la rangée M.Ensuite, distribuez le peptide HCN1 non marqué jusqu’à une concentration finale de 10 micromoles dans la rangée N.Agitez la plaque pendant deux minutes et incubez pendant 2,5 heures à température ambiante. À l’aide du tampon de dosage, diluez les billes d’accepteur anti-GST 1 à 50.

Avec une pipette à 16 canaux, ajoutez 3,5 microlitres de billes d’accepteur diluées dans chaque puits de la plaque et mélangez en pipetant doucement pour éviter de créer des bulles. Incuber l’assiette dans l’obscurité à température ambiante pendant une heure. Diluez les billes donneuses de chélate de nickel 1 à 50 avec un tampon de dosage sans exposer le mélange à la lumière.

Ajoutez 3,5 microlitres de billes donneuses diluées dans chaque puits de la plaque et mélangez doucement, en évitant les bulles d’air. Fermez la plaque et incubez-la dans l’obscurité à température ambiante pendant 1,5 heure. Ensuite, utilisez un lecteur de plaque pour lire la plaque avec les paramètres de mesure indiqués ici.

Enfin, calculez les valeurs de la CI50 en ajustant les données de chaque composé à l’aide d’un modèle de régression non linéaire à 4 paramètres. Pour évaluer l’interaction avec HCN1, TAMRA TRIP8b a été titré à une concentration fixe de HCN1 TAMRA. Ce graphique montre que plus la concentration de TRIP8b augmente, plus les molécules de HCN1 TAMRA se lient et la polarisation augmente.

Dans cette expérience, lorsque HCN1 non marqué a été titré en une concentration fixe de TRIP8b et HCN1 TAMRA, le peptide marqué a été déplacé et le signal a diminué. Un criblage à haut débit montre le pourcentage d’inhibition de chaque composé représenté par des points uniques sur le graphique. Les résultats de ce criblage sont tracés avec des contrôles positifs et négatifs, et le pourcentage moyen d’inhibition de chaque composé sur deux cycles de l’essai.

Les composés présentant une inhibition supérieure à 50 % ont ensuite été validés dans cette expérience. Les coordonnées X et Y ont été déterminées par le pourcentage d’inhibition dans deux cycles de l’essai. Dans cette expérience, HCN1C40 contient une balise GST terminale d’extrémité qui lie les billes d’accepteur.

L’interaction des domaines TPR de TRIP8b et du tripeptide terminal C de HCN1 excite la bille donneuse avec une lumière de longueur d’onde de 680 nanomètres pour produire de l’oxygène singulet. Enfin, comme le montre ce graphique, le titrage des concentrations croissantes du composé NUCC-5953 en une concentration fixe de TRIP8b et HCN1C40 a augmenté l’inhibition de l’interaction TRIP8b HCN1. Avant de commencer le criblage à haut débit, valider la préparation des protéines et la polarisation de fluorescence dans des tests de proximité basés sur des billes.

Assurez-vous que la protéine est de haute pureté. Aliquote la protéine pour éviter plusieurs cycles de congélation et de dégel. Il est important d’utiliser des réactifs de haute qualité, y compris du DMSO frais et du Triton.

N’oubliez pas que travailler avec le DMSO peut être dangereux et que des précautions telles que le port d’un équipement de protection individuelle approprié doivent toujours être prises lors de l’exécution de cette procédure. Suite à cette procédure, d’autres méthodes telles que l’électrophysiologie et la cytométrie en flux peuvent être effectuées afin de déterminer si les composés touchés ont une activité dans les cellules. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’effectuer un criblage à haut débit avec un test basé sur la polarisation de fluorescence.