Name: Une nouvelle technique de production et dobservation de chimiluminescence en milieu biologique (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-09T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 57 s
Description: Découvrez une technique d'imagerie chimioluminescente intraopératoire utilisant un complexe de ruthénium pour améliorer le rapport signal/bruit. Cette méthode innovante permet une visualisation claire des tissus cancéreux sans lumière incidente.

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Les auteurs remercient le professeur Jan Grimm et M. Travis Shaffer pour leurs discussions utiles et M. David Gregory pour la révision du manuscrit. Nous remercions chaleureusement les services techniques fournis par la plateforme d’imagerie animale MSK, soutenue en partie par la subvention de soutien P30CA008748-48 du NIH Cancer Center. Les auteurs remercient les NIH (K25 EB016673 et R21 CA191679, T.R. et 4R00CA178205-02, B.M.Z.), le MSK Center for Molecular Imaging and Nanotechnology (T.R.), la Tow Foundation (C.-B.) et la National Science Foundation Integrative Graduate Education and Research Traineeship (IGERT 0965983 at Hunter College for B.C. and T.M.S.) pour leur généreux soutien. La recherche rapportée dans cette publication a été financée par l’Université des sciences et technologies du roi Abdallah.

Déclaration éthique: Tous les in vivo des expérimentations animales décrites ont été réalisées selon un protocole approuvé et selon les directives éthiques du Memorial Sloan Kettering Cancer Center (MSK) Institutional Animal Care et utilisation Commission (IACUC). 1. Construction d&#39;un dispositif de nébulisation <ol><li> Fixer le bois de la partie A (12,5 x 2,5 x 1,8 cm 3) en position verticale dans le centre de la partie B (12,7 x 10,7 x 1,8 cm 3) à l&#39; aide de deux vis (4 x 25 mm 2). Fixer le bois de la partie C (11 × 2,5 × 1,8 cm 3) au milieu de la partie A (12,5 x 2,5 x 1,8 cm 3) à l&#39; aide d&#39; une vis, de telle sorte que la partie C (11 x 2,5 x 1,8 cm 3) peuvent encore être déplacés. Voir Figure 1. </li><li> Percez deux trous à travers l&#39;extrémité inférieure de la gâchette de la bouteille de pulvérisation d&#39;un mini-pulvérisateur 3 oz plastique (D) et pousser une tige en acier inoxydable (10 cm de &quot;acier 1/16) (E) à travers pour former deux boucles, l&#39;une des deux côté de la gâchette. </li&gt; <li> Enveloppez la partie inférieure de la bouteille de pulvérisation avec du ruban adhésif (F) pour empêcher les attaches de câble de glisser. Fixer la bouteille à bois partie C (11 x 2,5 x 1,8 cm 3) en utilisant les deux attaches de câble en plastique (28 cm) (G) de pulvérisation. </li><li> Coupez le moteur 011 d&#39;asservissement (I) et de le reconnecter avec les câbles en vrac de la commande d&#39;asservissement (H). Ensuite, fixez le servo - moteur vers le haut de la partie A du bois (12,5 x 2,5 x 1,8 cm 3) en utilisant du ruban adhésif. </li><li> Fixer un crayon (J) sur le levier de servo-moteur à l&#39;aide du trombone (K). connecter Étroitement les parties les plus externes du crayon pour les boucles de tige en acier à l&#39;aide de fils de torsion en plastique couverte (L) et fixer les extrémités sur le crayon avec du ruban adhésif. </li><li> Coupez le connecteur du câble magnétique de l&#39;unité de commande de servo-moteur (M) et le remettre en place le câble de haut-parleur (N). Ensuite, collez l&#39;unité servo de commande du moteur à bois partie B (12,7 x 10,7 x 1,8 cm 3). Couper un câble w1 avec des connecteurs magnétiques en deux et fixer une partie à l&#39;extrémité libre du cuivre scâble peaker (1 m). Connectez le (magnétique) i2 interrupteur à bascule et la puissance de p1 au câble w1 disponible et une batterie de 9V. </li></ol> 2. Sensibilité Détermination de la méthode <ol><li> Dans un tube de centrifugation de 1,5 mL, préparer des solutions de [Ru (bpy) 3] Cl 2 dans l&#39; eau d&#39;osmose inverse (100 pi) dans des quantités de 260 ug (347 nmol), 52 ug (69 nmol), 26 pg (34 nmol) , 5 ug (6,9 nmol), 3 pg (3,5 nmol), 520 ng (694 pmol), 260 ng (347 pmol), 52 ng (69 pmol), 26 ng (34 pmol), 5 ng (6,9 pmol), et 3 ng (3,5 pmoles). </li><li> Mélanger 100 ul de chaque [Ru (bpy) 3] Cl 2 solution avec 100 ul d&#39;une solution aqueuse de nitrate d&#39; ammonium et de cérium ((NH 4) 2 Ce (NO 3) 6) dans l&#39; eau (25 mM) sur une lame de microscope. </li><li> Mettre en place l&#39;acquisition dans le lecteur de bioluminescence par l&#39; initialisation du logiciel d&#39;imagerie. <ol><li> Connectez-vous au profil de l&#39;utilisateur et recherchez le acquipanneau de contrôle d &#39;opposition. Cliquez sur &quot;Initialiser&quot; et attendre que l&#39;appareil est prêt. </li><li> Recherchez &quot;Mode Imaging&quot; et assurez-vous &quot;luminescent&quot; et &quot;Photo&quot; sont vérifiées et que &quot;Fluorescent&quot; est décochée. </li><li> Change &quot;temps d&#39;exposition&quot; réglage pour &quot;luminescent&quot; à 20 s. Définissez les paramètres restants pour &quot;luminescent&quot; comme suit: &quot;Binning&quot;: Medium; &quot;F / stop&quot;: 1; et &quot;Filtre d&#39;émission&quot;: Open. REMARQUE: Les temps d&#39;exposition pourraient devoir être adaptés en fonction de l&#39;instrumentation et le réglage expérimental utilisé, si différente de la configuration présentée. </li><li> Pour &quot;Photo,&quot; utiliser les paramètres suivants: &quot;Temps d&#39;exposition&quot;: Auto; &quot;Binning&quot;: Medium; et &quot;F / stop&quot;: 8. Réglez le &quot;Sujet Hauteur&quot; selon l&#39;imagerie target.Look pour le menu «Field of View&quot; déroulante. Le réglage initial est &quot;C&quot; Changer à &quot;B&quot; (14 cm de distance entre le cAmera et le stade de l&#39;échantillon). </li></ol></li><li> Mettre en place le nébulisateur en plaçant une lame de microscope sur une feuille de papier noir sur le plancher de la chambre d&#39;imagerie pour la protéger de l&#39;agent oxydant. Mélanger 100 μLdroplet de [Ru (bpy) 3] Cl 2 -solution avec 100 pi d&#39;une solution aqueuse de (NH 4) 2 Ce (NO 3) 6. Observer la boîte réticule vert. <ol><li> Placez le sujet d&#39;imagerie sur le papier de construction noir, de telle sorte que la zone d&#39;intérêt est dans le centre du vert boîte à lumière réticule apparaît sur la scène de l&#39;échantillon. Préparer le nébuliseur en détachant le flacon pulvérisateur en plastique du support en bois. Remplir une solution de triéthylamine (1: 3 dans de l&#39;eau / éthanol) dans son réservoir en matière plastique et le remettre en place sur le support en bois. </li><li> Placez le nébuliseur à l&#39;intérieur du lecteur de bioluminescence et assurez-vous que le cordon d&#39;alimentation est débranché de la corde du nébuliseur. Assurez-vous que l&#39;interrupteur d&#39;alimentationest activée, l&#39;interrupteur à bascule est éteint, et le voyant rouge est allumé Placer le nébuliseur de telle sorte que le débit de pulvérisation est dirigé vers la zone d&#39;intérêt sur le sujet d&#39;imagerie, tout en minimisant l&#39;obstruction de la vue de la caméra vers l&#39;objet d&#39;imagerie par la tête de buse de pulvérisation. </li><li> Placez de petits morceaux de papier noir de construction sur tous les points chauds potentiels (par exemple, des marques blanches sur des lames microscopiques ou des sites d&#39;injection) pour les protéger des embruns. La place d&#39;au moins 40 cm de câble à distance du nébuliseur dans la chambre d&#39;imagerie, de telle sorte qu&#39;elle ne gêne pas le sujet d&#39;imagerie, le nébulisateur, ou le verrou de porte magnétique. Fermez la porte du système d&#39;imagerie. NOTE: Le réticule va changer la taille sur la base du «Field of View&quot; mise en &quot;image vivante;&quot; assurez-vous que cela est réglé sur &quot;B&quot;. </li></ol></li><li> Acquérir une image en lançant la séquence d&#39;imagerie. Cliquez sur &quot;Acquérir&quot; dans le &quot;Panneau de configuration d&#39;acquisition.&quot; Sur la première Sequ d&#39;imagerierence, activer la sauvegarde automatique si on le souhaite (recommandé) et choisissez un dossier de données. Ignorer le &quot;Edit Imaging Labels&quot; boîte de dialogue jusqu&#39;à la fin de la séquence. REMARQUE: Le logiciel de contrôle affiche les actions de l&#39;instrument, étape par étape en temps réel. Après la préparation de la mesure et le déplacement du stade de l&#39;échantillon à la bonne position, il ouvre l&#39;obturateur de la caméra et compte le temps de mesure. L&#39;ouverture de l&#39;obturateur peut également être entendu par un bruit de clic généré par la machine. </li><li> Comme l&#39;ouverture de l&#39;obturateur, pulvériser trois salves d&#39;une solution de triéthylamine (1: 3 dans de l&#39;eau / éthanol, 0,24 ± 0,04 ml par pulvérisation rafale) en mettant l&#39;interrupteur à bascule à trois reprises pour générer chimioluminescence. NOTE: L&#39;étape de l&#39;échantillon se déplace pendant la mesure. Laisser un câble suffisamment (minimum 40 cm) à l&#39;intérieur de l&#39;instrument pour permettre cela. Assurez-vous que la solution à pulvériser par le nébuliseur peut être aspiré par le tube ascendant et qu&#39;il n&#39;y a pas de bulles d&#39;air dans le tuyau. Avoir plusieurs batterie de rechanges pour le nébuliseur prêt en cas de besoin. </li></ol> 3. Imagerie in vivo Après injection intraveineuse systémique <ol><li> Dans un microtube de 1,5 ml, la préparation de 100 ul de solution saline tamponnée au phosphate (PBS) , solution contenant entre 8 et 33 nmoles de [Ru (bpy) 3] Cl 2. Préparer une solution aqueuse de (NH 4) 2 Ce (NO 3) 6 dans de l&#39; eau (25 mM) en même temps. </li><li> Intraveineusement injecter 100 pi de [Ru (bpy) 3] Cl 2 dans la veine de la queue des souris en bonne santé (n = 5). </li><li> Euthanasier les souris 10 minutes après l&#39; injection par l&#39; intermédiaire de CO 2 asphyxie. <ol><li> Retirer la peau avec une coupe Y du torse, puis retirez l&#39;arc costal dans une forme en U pour exposer le cœur et les poumons. Perfuser les souris en coupant un orifice de sortie dans l&#39;oreillette droite et en injectant 20 ml de PBS à travers une aiguille de calibre 24 dans le ventricule gauche 18. Découpez soigneusement par le ventrela peau et exposer le rein et le foie. Couper longitudinalement à travers les organes pour créer une coupure visible. </li></ol></li><li> Mettre en place l&#39;acquisition comme décrit dans les étapes 2.3-2.6, avec les modifications suivantes. <ol><li> Après avoir soigneusement lavé le réservoir en plastique nébulisateur, le remplir avec une solution de (NH 4) 2 Ce (NO 3) 6 dans de l&#39; eau (25 mM) au lieu de triéthylamine. NOTE: Il est important de rincer la buse du nébuliseur après chaque utilisation, car cristallisant (NH 4) 2 Ce (NO 3) 6 peut détruire la buse de pulvérisation après plusieurs utilisations. </li></ol></li><li> Utilisez l&#39;ensemble des échantillons d&#39;animaux ou d&#39; organes pour l&#39; imagerie. <ol><li> Pour l&#39;imagerie de l&#39;abdomen entier, positionner la carcasse de la souris avec l&#39;abdomen ouvert face à la caméra et la tête pointant vers l&#39;arrière de l&#39;instrument. Centrer l&#39;organe à imager (par exemple, le foie ou les reins) dans le vert boîte à lumière réticule. </li><li> Fou individu imagerie d&#39;organes et de quantification, retirez la souris de l&#39;instrument d&#39;imagerie et la broche vers le bas. A partir de la cavité du corps déjà ouvert, exciser les organes internes (par exemple, les reins, le foie, les poumons, les muscles, la rate, le cerveau et le cœur). Couper à travers la peau de la patte arrière pour exciser le tissu musculaire. Ouvrez soigneusement le crâne avec un scalpel pour exciser le cerveau. <ol><li> Si l&#39;organe d&#39;intérêt est le foie, les reins ou la rate, couper tous les organes dans la moitié longitudinalement, placer chaque organe sur une boîte de Pétri ou un morceau de papier de construction noir. </li></ol></li><li> Suivez la procédure décrite dans les étapes 2.3-2.6 pour établir l&#39;émission relative du traceur chimiluminescent pour les organes simples. </li></ol></li></ol> 4. Imagerie in vivo des ganglions lymphatiques <ol><li> Préparer 10 pi d&#39;une solution de PBS contenant 80 nmol de [Ru (bpy) 3] Cl 2. Préparer une solution aqueuse de (NH 4) 2 Ce (NO 3) 6 en water (25 mM) en même temps. </li><li> Injecter 10 ul de la solution sous la peau dans la patte arrière de souris en bonne santé (n = 5). Comme témoin négatif, injecter la patte controlatérale avec 10 pi de pur PBS. Sacrifiez les souris via CO 2 asphyxie 15 min après l&#39;injection. Enlever la peau sur les deux pattes arrière pour exposer les canaux lymphatiques jusqu&#39;aux ganglions lymphatiques poplités. </li><li> Mettre en place l&#39;acquisition telle que décrite à l&#39;étape 3.4. </li><li> Retirer les ganglions lymphatiques poplités des deux pattes arrière, les couper en deux et les pulvériser avec oxydant sur une boîte de Pétri, comme décrit précédemment (étape 3.5.3), aux fins de quantification. </li></ol>

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</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Ici, nous présentons une technologie qui est capable de délimiter le tissu optiquement par l&#39;intermédiaire de l&#39;émission de photons créés par un rapporteur chimioluminescent. Contrairement à d&#39; autres, plus établi, les technologies 4, 5, 6, 7, 8, 9, ce système rapporteur chimioluminescent utilise une sonde d&#39;...

Au cours des dernières décennies, les technologies d&#39;imagerie ont révolutionné la façon dont les médecins à diagnostiquer et de surveiller la maladie. Ces techniques d&#39;imagerie, cependant, ont été largement limitée à des systèmes d&#39;imagerie du corps entier, comme la tomographie par émission de positrons (PET), le photon unique par émission de positrons (SPECT), tomographie assistée par ordinateur (CT) et l&#39;imagerie par résonance magnétique (IRM). Une attention particulière a été accordée au cancer, et des percées technologiques d&#39;imagerie ont grandement amélioré la façon dont cette maladie est diagnostiquée et traitée. Malgré ces progrès, il y a un endroit où ces technologies d&#39;imagerie ne correspondent tout simplement pas: la salle d&#39;opération. Bien que les techniques d&#39;imagerie du corps entier peut aider à la planification chirurgicale, ils manquent généralement des résolutions spatiales suffisamment élevées pour aider les médecins à déterminer en temps réel si tout le tissu tumoral a été enlevé ou de tissu tumoral résiduel reste caché aux marges chirurgicales 1. Faire en sorte que pas infiltrativemarges tumorales sont laissés est l&#39;un des objectifs chirurgicaux les plus importants, et les chirurgiens doivent marcher un corde raide entre la résection des tissus rigoureux et prudent. Si trop est enlevé, les effets secondaires indésirables pour le patient sont exacerbés; si trop peu est enlevé, les taux de récidive sont augmentés de 2, 3. Par conséquent, il est essentiel de définir des marges tumorales précises, et nous croyons que l&#39;imagerie peropératoire chimioluminescent peut aider à améliorer la précision de l&#39;identification des marges tumorales en aidant les chirurgiens de visualiser les tissus malins qui pourraient autrement ne pas être détectés avec des techniques établies. Il existe de nombreuses technologies d&#39;imagerie actuellement étudiés pour leur utilité possible que les systèmes d&#39;imagerie peropératoire. Ceux - ci comprennent des sondes ß et γ-émettant un rayonnement 4, la fluorescence optique 5, Raman spectroscopie 6 </sup&gt;, 7 et Cherenkov luminescence 8, 9. À ce jour, cependant, aucune de ces sont établies comme des outils cliniques standard. l&#39;imagerie de fluorescence optique a jusqu&#39;ici avéré être le plus prometteur de ces techniques et est donc le plus exploré. Bien qu&#39;il ait déjà été révélé être un outil précieux pour de nombreuses applications, il ne va pas sans limitations. En effet, son principal inconvénient est la fluorescence de fond généré par le tissu biologique intrinsèquement autofluorescents. Ce signal de fond autofluorescente est un produit de l&#39;excitation du tissu environnant, en plus du fluorophore, par la source de lumière externe nécessaire pour la production d&#39;un signal fluorescent. Du point de vue pratique, cette autofluorescence peut potentiellement conduire à de faibles rapports signal sur bruit, ce qui peut limiter l&#39;utilité de cette technologie dans la salle d&#39;opération. Le principalavantage de l&#39;imagerie par chimioluminescence sur l&#39;imagerie de fluorescence est qu&#39;aucune lumière d&#39;excitation est nécessaire. Par conséquent, il n&#39;y a pas de fond d&#39;autofluorescence. En imagerie par chimiluminescence, l&#39;énergie d&#39;excitation est générée au lieu chimiquement. Ce procédé ne produit aucun signal de fond non voulue et peut donc entraîner une augmentation des rapports signal sur bruit. Cela pourrait finalement conduire à la détection plus précise et exacte des marges chirurgicales. Assez étonnamment, l&#39;utilité de cette approche comme une technique d&#39;imagerie peropératoire est restée inexplorée 10. En effet, l&#39;exemple le plus proche de cette technique est l&#39;oxydation du luminol par la myéloperoxydase chez les souris 11, 12, 13. imagerie biomédicale chimioluminescente est donc un domaine assez inexploré de la recherche qui pourrait offrir les avantages suivants: (1) autofluorescence minimale résultant en un signal de fond bas avec salutle rapport signal-bruit gher; (2) les longueurs d&#39;onde accordables d&#39;émissions chimioluminescentes allant du visible au proche infrarouge; et (3) complexes chimiluminescents fonctionnalisables qui, lorsqu&#39;il est combiné avec les technologies de liaison et de biomolécules qui existent déjà ciblées, donnent accès à des bibliothèques entières de sondes d&#39;imagerie moléculaire ciblées 14. Cette étude de validation de principe illustre l&#39;utilité potentielle d&#39;imagerie chimioluminescent dans le milieu biomédical à l&#39;aide d&#39;un agent d&#39;imagerie à base de ruthénium. Les propriétés chimioluminescentes de ce composé sont bien étudiés, des enquêtes datant du milieu des années 1960 15. Lors de l&#39; activation chimique, l&#39;agent produit de la lumière à environ 600 nm 16, ce qui est bien adapté à des fins d&#39;imagerie médicale. L&#39;énergie d&#39;activation est fourni par une réaction d&#39;oxydoréduction qui conduit à un état-excité qui a une durée de vie de 650 ns dans l&#39; eau 17 -folldue par la génération de photons lors du relâchement de cet état excité. Grâce à l&#39;utilisation d&#39;un nébulisateur à distance spécialement conçu, nous avons pu détecter le composé à la fois ex vivo et in vivo. Les résultats des premières expériences sont très prometteurs, ce qui suggère une enquête plus approfondie de cette technologie.

<table><tbody><tr><td>Partie A en bois (12,5 &times ; 2,5 &times ; 1,8 cm)</td><td>&nbsp ; Woodcraft</td><td>131404</td><td>Coupé dans une feuille de contreplaqué de bouleau de 3/4 » x 24 » x 30</td></tr> » <tr><td>Partie de bois B (12,7 & fois ; 10,7 & fois ; 1,8 cm)</td><td>Woodcraft</td><td>131404</td><td>Coupé dans une feuille de contreplaqué de bouleau de 3/4 » x 24 » x 30</td></tr> » Partie <tr><td>de bois C (11 &times ; 2,5 & fois ; 1,8 cm)</td><td>Woodcraft</td><td>131404</td><td>Coupé dans un 3/4 » x 24 » x 30& rdquo ; Vis en tôle de contreplaqué de bouleau</td></tr><tr><td>(4 & times ; 25 mm)</td><td>Screwfix</td><td>79939</td><td></td></tr><tr><td>Harmon Face Values Mini pulvérisateur 3 oz</td> Tige en acier inoxydable <td>Bed, Bath and Beyond</td><td></td><td></td></tr><tr><td>(10 cm d’acier 1/16")</td> <td>Metals Depot Int. Inc.</td><td>2192</td><td></td></tr><tr><td>Crayon Classic HB</td><td>Papermate</td><td>58592</td><td></td></tr><tr><td>Trombone</td><td>Office Depot</td><td>221720</td><td></td></tr><tr><td>câble haut-parleur</td><td>RCA Inc.</td><td></td><td></td>AH1650SN</tr><tr><td>Pile alcaline Energizer 9V</td><td>Energizer Holdings Inc.</td>Micro servomoteur <td>EN22</td><td></td></tr><tr><td>Hitech HS-82MG, couple de sortie de 3,4 kg/cm @ 6V</td><td>Hitech RCD USA Inc.</td><td>32082S</td><td></td></tr><tr><td>Nom</td><td>de l’entreprise</td><td>Numéro de catalogue</td><td>Commentaires Colliers</td></tr> de <tr><td>serrage en plastique de 28 cm</td><td>General Electric Inc.</td><td>50725</td><td></td></tr><tr><td>Ruban adhésif</td><td>3M Inc.</td><td>3939</td><td></td></tr><tr><td>littleBits w1 fil</td><td>littleBits Inc.</td><td>w1 fil</td><td></td></tr><tr><td>littleBits p1 puissance</td><td>littleBits Inc.</td><td>p1 puissance</td><td></td></tr><tr><td>littleBits i2 interrupteur à bascule</td><td>littleBits Inc.</td><td>i2 interrupteur</td><td></td>à bascule</tr><tr><td>littleBits 011 servo</td><td>littleBits Inc.</td><td>011 servo</td><td></td></tr><tr><td>20 cm Fil revêtu de plastique Attaches torsadées</td><td>Four Star Plastics</td><td>71TIE8000</td><td></td></tr><tr><td>Tris(2,2&prime ;-bipyridyl)dichlororuthénium(II) hexahydraté</td><td>Sigma-Aldrich Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr> 224758 <tr><td>Nitrate d’ammonium et de cérium(IV)</td><td>Sigma-Aldrich Inc.</td><td>22249</td><td></td></tr><tr><td>Isofluorane</td><td>Baxter Healthcare</td><td>1001936060</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>PBS1</td><td></td></tr><tr><td>Éthanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>2854</td><td></td></tr><tr><td>Triéthylamine</td><td>Sigma-Aldrich Inc.</td><td>T0886</td><td></td></tr><tr><td>Eau</td><td></td><td></td><td>L’eau a été purifiée à l’aide d’un Milipore Mili-Q (R &ge ; 18 M&Omega ; )</td></tr><tr><td>Souris nues femelles Jackson</td><td>Laboratories</td><td>1929</td><td>5 - 6 semaines</td></tr><tr><td>Souche C57BL/6J&nbsp ; &nbsp ;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>souris mâles NU/J à&nbsp ;</td><td>Jackson Laboratories</td><td>2019</td><td>6 ans &ndash ; 8 semaines</td></tr><tr><td>IVIS 200 lecteur de bioluminescence</td><td>Caliper Live Science</td> Live Image <td></td><td></td></tr><tr><td>4.2 logiciel</td><td>Perkin-Elmer</td><td>128165</td><td></td></tr><tr><td>lames de microscope</td><td>ThermoScientific</td><td>4951PLUS4</td><td></td></tr></tbody></table>

une nouvelle technique de production et d&#39;observation de chimiluminescence en milieu biologique

A Novel Technique for Generating and Observing Chemiluminescence in a Biological Setting

Les techniques d’imagerie peropératoire ont le potentiel de rendre les interventions chirurgicales plus sûres et plus efficaces ; pour ces raisons, ces techniques se répandent rapidement dans la salle d’opération. Nous présentons ici une nouvelle approche qui utilise une technique non encore explorée pour l’imagerie peropératoire : l’imagerie chimiluminescente. Cette méthode utilise un rapporteur chimiluminescent à base de ruthénium ainsi qu’un système de nébulisation sur mesure pour produire des images ex vivo ou in vivo avec des rapports signal/bruit élevés. Le rapporteur à base de ruthénium produit de la lumière après exposition à une solution oxydante aqueuse et une ré-réduction dans les tissus environnants. Cette méthode nous a permis de détecter des concentrations de rapporteurs aussi faibles que 6,9 pmol/cm2. Dans ce travail, nous présentons un guide visuel de nos études in vivo de preuve de concept impliquant des injections sous-cutanées et intraveineuses chez la souris. Les résultats suggèrent que cette technologie est un candidat prometteur pour d’autres recherches précliniques et pourrait éventuellement devenir un outil utile en salle d’opération.

Le système de nébuliseur décrit dans la section 1 du protocole peut être construit à partir de matériaux facilement disponibles à un faible coût. Il est destiné à être un encart pour la télécommande déclenché par pulvérisation du réducteur / agent oxydant à l' intérieur d' un lecteur de bioluminescence (figure 1). Notre conception permet le fonctionnement en toute sécurité du nébuliseur dans le lecteur de bioluminescence à une distance de 14 cm de la lentille. Pas de bué...

Ce protocole décrit une nouvelle technique d’imagerie peropératoire qui utilise un complexe de ruthénium comme source d’émission de lumière chimiluminescente, produisant ainsi des rapports signal/bruit élevés lors de l’imagerie in vivo. L’imagerie peropératoire est un domaine en pleine expansion qui pourrait révolutionner la façon dont les procédures chirurgicales sont effectuées.

Une nouvelle technique de production et d&#39;observation de chimiluminescence en milieu biologique

Intraoperative imaging techniques have the potential to make surgical interventions safer and more effective; for these reasons, such techniques are ...

L’objectif global de ce protocole est de proposer une nouvelle technique d’imagerie chimiluminescente préclinique, interopératoire et capable d’apporter des avantages par rapport aux techniques optiques existantes en termes de rapports signal/bruit et de limites de détection. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés qui n’ont pas été accessibles par les techniques d’imagerie optique traditionnelles dans de nombreux domaines liés aux sciences biologiques. Les principaux avantages de cette technique sont qu’elle a un rapport signal/bruit élevé et qu’elle ne nécessite ni lumière ni rayonnement instantanés.Nous avons donc constaté que les implications de cette technique s’étendent vraiment à l’imagerie interopératoire de plusieurs états pathologiques, y compris le cancer, en raison des rapports signal/bruit élevés que cette technique a à offrir. Comme la lumière incidente n’est pas nécessaire pour cette technique, il n’y a aucun problème d’absorption de la lumière incidente. De plus, il existe une grande boîte à outils chimiques pour fonctionnaliser la molécule centrale chimiluminescente.Pour commencer la procédure, préparez des solutions étalons de 100 microlitres de chlorure de tris(bypiridine)ruthénium(II) dans de l’eau d’osmose inverse. Ensuite, combinez chaque étalon avec 100 microlitres d’une solution de 25 millimolaires de nitrate d’ammonium et de cérium dans de l’eau d’osmose inverse sur une lame de microscope. Ouvrez le logiciel d’imagerie du lecteur de bioluminescence et cliquez sur initialiser.En mode imagerie, assurez-vous que l’luminescent et la photographie sont cochés et que l’fluorescent n’est pas coché. Réglez les paramètres de temps d’exposition luminescente, de binning, de f/stop et de filtre d’émission. Réglez les paramètres de temps d’exposition de la photo, de binning et de f/stop.Réglez ensuite la hauteur du sujet en fonction de l’échantillon à imager. Réglez le champ de vision sur B pour une distance de 14 centimètres entre la caméra et la platine d’échantillonnage. Couvrez le sol de la chambre d’imagerie du lecteur de bioluminescence dans la phase d’échantillonnage avec du papier de construction noir.Placez ensuite la première lame avec la gouttelette de mélange standard sur la platine d’échantillon, la gouttelette étant centrée dans le réticule de la boîte lumineuse verte. Ensuite, remplissez le flacon pulvérisateur de trois onces d’un nébuliseur sur mesure avec la solution 1:3 de triéthylamine dans une solution 50/50 d’eau et d’éthanol. Assurez-vous qu’il n’y a pas de bulles d’air dans le tuyau d’aspiration.Placez l’ensemble du nébuliseur dans la chambre d’imagerie avec la buse de pulvérisation pointée vers la gouttelette à imager sans obstruer la vue de la caméra de la gouttelette. Assurez-vous que l’interrupteur d’alimentation du nébuliseur et le voyant d’alimentation sont allumés, que l’interrupteur à bascule magnétique est éteint et que le nébuliseur d’alimentation et les cordons de la télécommande ne sont pas emmêlés. Couvrez les points chauds tels que les marques sur la diapositive avec de petits morceaux de papier de construction noir.Placez au moins 40 centimètres du cordon de télécommande du nébuliseur dans la chambre d’imagerie. Fermez doucement la porte de la chambre sans sertir les cordons du nébuliseur. Dans le logiciel de l’instrument, cliquez sur acquérir, activez l’enregistrement automatique et définissez le chemin d’accès au fichier de données.Lancez la séquence d’imagerie. Lorsque l’obturateur s’ouvre avec un clic audible, basculez trois fois le bouton du nébuliseur pour pulvériser trois rafales de solution de triéthylamine sur l’échantillon. Répétez la procédure avec chaque lame standard pour déterminer la concentration minimale détectable de l’agent d’imagerie au ruthénium.Pour commencer la procédure d’imagerie in vivo, préparez 100 microlitres d’une solution contenant entre 8 et 33 nanomoles de chlorure de tris(bypiridine)ruthénium(II) dans une solution saline tamponnée au phosphate. Préparez une solution aqueuse de 25 millimolaires de nitrate d’ammonium et de cérium. Ensuite, injectez par voie intraveineuse 100 microlitres de l’agent d’imagerie au ruthénium dans la veine de la queue de souris saines.Sacrifiez les souris 10 minutes après l’injection par asphyxie au dioxyde de carbone. Retirez la peau du torse avec une coupe en Y, puis retirez l’arc costal pour exposer le cœur et les poumons. Coupez une sortie dans l’oreillette droite et injectez 20 millilitres de PBS à travers une aiguille de calibre 24 dans le ventricule gauche.Coupez la peau du ventre pour exposer les reins et le foie. Si l’organe d’intérêt est le foie, les reins ou la rate, faites une coupe longitudinale visible à travers l’organe. Préparez une nouvelle séquence d’imagerie dans le logiciel du lecteur bioluminescent.Pour l’imagerie de l’abdomen entier, placez la souris dans la chambre d’imagerie, l’abdomen ouvert face à la caméra et la tête pointant vers l’arrière de l’instrument. Centrez l’organe d’intérêt dans le réticule de la boîte lumineuse verte. Lavez soigneusement le flacon pulvérisateur et la buse du nébuliseur, puis remplissez le flacon avec la solution de nitrate d’ammonium et de cérium.Placez le nébuliseur dans la chambre d’imagerie avec la buse de pulvérisation dirigée vers le site d’imagerie. Assurez-vous que la caméra n’est pas obstruée, que les cordons ne sont pas emmêlés et qu’au moins 40 centimètres du cordon de la télécommande se trouvent dans la chambre. Fermez la chambre et lancez la séquence d’imagerie.Lorsque l’obturateur s’ouvre d’un clic, basculez trois fois la bascule pour pulvériser trois rafales de l’agent oxydant sur le site d’imagerie. Après l’imagerie, retirez l’ensemble du nébuliseur et rincez abondamment la buse de pulvérisation pour éviter la cristallisation du nitrate d’ammonium et de cérium. Pour l’imagerie et la quantification ultérieures de chaque organe, retirez la souris de l’instrument et excisez les organes internes en commençant par la cavité corporelle ouverte.Couper la peau de la patte arrière pour exciser des échantillons de tissu musculaire. Si l’organe d’intérêt est le foie, le rein ou la rate, coupez l’organe en deux longitudinalement. Placez ensuite l’organe sur une boîte de Pétri ou un morceau de papier de construction noir.Imagez chaque organe de la même manière que l’animal entier, en rinçant la buse de pulvérisation après chaque séquence. Dans cette procédure, des souris ont été injectées avec un agent d’imagerie à base de ruthénium et le tissu d’intérêt a été pulvérisé avec un oxydant pour induire la chimiluminescence. La concentration minimale détectable de l’agent d’imagerie a été déterminée à 6,9 picomoles par centimètre carré dans ces conditions.Des images de chimiluminescence en lumière blanche des organes d’intérêt ont été obtenues avec un lecteur de bioluminescence. Le signal de chimiluminescence a été principalement observé dans les reins après l’injection intraveineuse, indiquant l’élimination rénale de la tris(bypiridine)ruthénium(II)cation hydrophile. Le rapport signal/bruit de l’agent d’imagerie par rapport au PBS seul était de 27:1 dans les reins et de 21:1 dans le foie.Les ganglions lymphatiques poplités de souris ont également été évalués par une injection sous-cutanée d’une solution plus concentrée de l’agent d’imagerie à base de ruthénium. Les ganglions lymphatiques contenant l’agent d’imagerie ont montré une radiance significativement plus grande que les ganglions lymphatiques contenant uniquement du PBS. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en deux heures si elle est correctement exécutée.Lors de cette procédure, il est important de se rappeler d’exclure la lumière ambiante et d’éviter la contamination par le ruthénium tris bpy. Après son développement, cette technique ouvrira la voie aux chercheurs dans le domaine de l’imagerie biomoléculaire pour explorer des états pathologiques tels que le cancer chez la souris. Bien que cette méthode puisse donner un aperçu de questions qui n’étaient pas accessibles par les techniques d’imagerie optique traditionnelles, toute question qui pourrait être étudiée avec des techniques traditionnelles peut potentiellement être abordée par chimiluminescence.

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