Une nouvelle technique de production et d'observation de chimiluminescence en milieu biologique

L’objectif global de ce protocole est de proposer une nouvelle technique d’imagerie chimiluminescente préclinique, interopératoire et capable d’apporter des avantages par rapport aux techniques optiques existantes en termes de rapports signal/bruit et de limites de détection. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés qui n’ont pas été accessibles par les techniques d’imagerie optique traditionnelles dans de nombreux domaines liés aux sciences biologiques. Les principaux avantages de cette technique sont qu’elle a un rapport signal/bruit élevé et qu’elle ne nécessite ni lumière ni rayonnement instantanés.

Nous avons donc constaté que les implications de cette technique s’étendent vraiment à l’imagerie interopératoire de plusieurs états pathologiques, y compris le cancer, en raison des rapports signal/bruit élevés que cette technique a à offrir. Comme la lumière incidente n’est pas nécessaire pour cette technique, il n’y a aucun problème d’absorption de la lumière incidente. De plus, il existe une grande boîte à outils chimiques pour fonctionnaliser la molécule centrale chimiluminescente.

Pour commencer la procédure, préparez des solutions étalons de 100 microlitres de chlorure de tris(bypiridine)ruthénium(II) dans de l’eau d’osmose inverse. Ensuite, combinez chaque étalon avec 100 microlitres d’une solution de 25 millimolaires de nitrate d’ammonium et de cérium dans de l’eau d’osmose inverse sur une lame de microscope. Ouvrez le logiciel d’imagerie du lecteur de bioluminescence et cliquez sur initialiser.

En mode imagerie, assurez-vous que l’luminescent et la photographie sont cochés et que l’fluorescent n’est pas coché. Réglez les paramètres de temps d’exposition luminescente, de binning, de f/stop et de filtre d’émission. Réglez les paramètres de temps d’exposition de la photo, de binning et de f/stop.

Réglez ensuite la hauteur du sujet en fonction de l’échantillon à imager. Réglez le champ de vision sur B pour une distance de 14 centimètres entre la caméra et la platine d’échantillonnage. Couvrez le sol de la chambre d’imagerie du lecteur de bioluminescence dans la phase d’échantillonnage avec du papier de construction noir.

Placez ensuite la première lame avec la gouttelette de mélange standard sur la platine d’échantillon, la gouttelette étant centrée dans le réticule de la boîte lumineuse verte. Ensuite, remplissez le flacon pulvérisateur de trois onces d’un nébuliseur sur mesure avec la solution 1:3 de triéthylamine dans une solution 50/50 d’eau et d’éthanol. Assurez-vous qu’il n’y a pas de bulles d’air dans le tuyau d’aspiration.

Placez l’ensemble du nébuliseur dans la chambre d’imagerie avec la buse de pulvérisation pointée vers la gouttelette à imager sans obstruer la vue de la caméra de la gouttelette. Assurez-vous que l’interrupteur d’alimentation du nébuliseur et le voyant d’alimentation sont allumés, que l’interrupteur à bascule magnétique est éteint et que le nébuliseur d’alimentation et les cordons de la télécommande ne sont pas emmêlés. Couvrez les points chauds tels que les marques sur la diapositive avec de petits morceaux de papier de construction noir.

Placez au moins 40 centimètres du cordon de télécommande du nébuliseur dans la chambre d’imagerie. Fermez doucement la porte de la chambre sans sertir les cordons du nébuliseur. Dans le logiciel de l’instrument, cliquez sur acquérir, activez l’enregistrement automatique et définissez le chemin d’accès au fichier de données.

Lancez la séquence d’imagerie. Lorsque l’obturateur s’ouvre avec un clic audible, basculez trois fois le bouton du nébuliseur pour pulvériser trois rafales de solution de triéthylamine sur l’échantillon. Répétez la procédure avec chaque lame standard pour déterminer la concentration minimale détectable de l’agent d’imagerie au ruthénium.

Pour commencer la procédure d’imagerie in vivo, préparez 100 microlitres d’une solution contenant entre 8 et 33 nanomoles de chlorure de tris(bypiridine)ruthénium(II) dans une solution saline tamponnée au phosphate. Préparez une solution aqueuse de 25 millimolaires de nitrate d’ammonium et de cérium. Ensuite, injectez par voie intraveineuse 100 microlitres de l’agent d’imagerie au ruthénium dans la veine de la queue de souris saines.

Sacrifiez les souris 10 minutes après l’injection par asphyxie au dioxyde de carbone. Retirez la peau du torse avec une coupe en Y, puis retirez l’arc costal pour exposer le cœur et les poumons. Coupez une sortie dans l’oreillette droite et injectez 20 millilitres de PBS à travers une aiguille de calibre 24 dans le ventricule gauche.

Coupez la peau du ventre pour exposer les reins et le foie. Si l’organe d’intérêt est le foie, les reins ou la rate, faites une coupe longitudinale visible à travers l’organe. Préparez une nouvelle séquence d’imagerie dans le logiciel du lecteur bioluminescent.

Pour l’imagerie de l’abdomen entier, placez la souris dans la chambre d’imagerie, l’abdomen ouvert face à la caméra et la tête pointant vers l’arrière de l’instrument. Centrez l’organe d’intérêt dans le réticule de la boîte lumineuse verte. Lavez soigneusement le flacon pulvérisateur et la buse du nébuliseur, puis remplissez le flacon avec la solution de nitrate d’ammonium et de cérium.

Placez le nébuliseur dans la chambre d’imagerie avec la buse de pulvérisation dirigée vers le site d’imagerie. Assurez-vous que la caméra n’est pas obstruée, que les cordons ne sont pas emmêlés et qu’au moins 40 centimètres du cordon de la télécommande se trouvent dans la chambre. Fermez la chambre et lancez la séquence d’imagerie.

Lorsque l’obturateur s’ouvre d’un clic, basculez trois fois la bascule pour pulvériser trois rafales de l’agent oxydant sur le site d’imagerie. Après l’imagerie, retirez l’ensemble du nébuliseur et rincez abondamment la buse de pulvérisation pour éviter la cristallisation du nitrate d’ammonium et de cérium. Pour l’imagerie et la quantification ultérieures de chaque organe, retirez la souris de l’instrument et excisez les organes internes en commençant par la cavité corporelle ouverte.

Couper la peau de la patte arrière pour exciser des échantillons de tissu musculaire. Si l’organe d’intérêt est le foie, le rein ou la rate, coupez l’organe en deux longitudinalement. Placez ensuite l’organe sur une boîte de Pétri ou un morceau de papier de construction noir.

Imagez chaque organe de la même manière que l’animal entier, en rinçant la buse de pulvérisation après chaque séquence. Dans cette procédure, des souris ont été injectées avec un agent d’imagerie à base de ruthénium et le tissu d’intérêt a été pulvérisé avec un oxydant pour induire la chimiluminescence. La concentration minimale détectable de l’agent d’imagerie a été déterminée à 6,9 picomoles par centimètre carré dans ces conditions.

Des images de chimiluminescence en lumière blanche des organes d’intérêt ont été obtenues avec un lecteur de bioluminescence. Le signal de chimiluminescence a été principalement observé dans les reins après l’injection intraveineuse, indiquant l’élimination rénale de la tris(bypiridine)ruthénium(II)cation hydrophile. Le rapport signal/bruit de l’agent d’imagerie par rapport au PBS seul était de 27:1 dans les reins et de 21:1 dans le foie.

Les ganglions lymphatiques poplités de souris ont également été évalués par une injection sous-cutanée d’une solution plus concentrée de l’agent d’imagerie à base de ruthénium. Les ganglions lymphatiques contenant l’agent d’imagerie ont montré une radiance significativement plus grande que les ganglions lymphatiques contenant uniquement du PBS. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en deux heures si elle est correctement exécutée.

Lors de cette procédure, il est important de se rappeler d’exclure la lumière ambiante et d’éviter la contamination par le ruthénium tris bpy. Après son développement, cette technique ouvrira la voie aux chercheurs dans le domaine de l’imagerie biomoléculaire pour explorer des états pathologiques tels que le cancer chez la souris. Bien que cette méthode puisse donner un aperçu de questions qui n’étaient pas accessibles par les techniques d’imagerie optique traditionnelles, toute question qui pourrait être étudiée avec des techniques traditionnelles peut potentiellement être abordée par chimiluminescence.