Name: Conformations GPCR G Protein-sélectifs mesurée à laide de FRET capteurs dans un Fluorometer Assay de cellules vivantes de suspension (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-10T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 12 s
Description: Découvrez l'assai FRET en cellules vivantes pour évaluer les conformations sélectives des récepteurs couplés aux protéines G (GPCR) sous différents agonistes. Cette méthode modulaire permet d'étudier les interactions GPCR-effeteurs et les effets des médicaments.

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RUM a été financée par l&#39;American Heart Association Fellowship pré-doctoral (14PRE18560010). La recherche a été financée par le développement scientifique Grant American Heart Association (13SDG14270009) et le NIH (1DP2 CA186752-01 &amp; 1-R01-GM-105646-01-A1) SS

1. Préparation de l&#39;ADN <ol><li> capteur de design construit en utilisant un schéma de clonage modulaire. S&#39;il vous plaît référence à la conception du capteur β 2 -AR détaillé précédemment 1. </li><li> Préparer un ADN selon l&#39; une commerciale protocole du kit miniprep et éluer dans une solution 2 mM de Tris-HCl, pH 8, à une concentration ≥ 750 ng / pl, A 260 / A 280 de 1/7 à 1/9, A 260 / A 230 de 2,0 à 2,29. </li></ol> 2. Culture cellulaire Préparation <ol><li> La culture des cellules HEK-293T-Flp-n cellules dans du DMEM contenant 4,5 g / L de D-glucose, supplémenté avec 10% de SVF (inactivé par la chaleur) (v / v), 1% de L-glutamine supplément, HEPES 20 mM, pH 7,5 à 37 ° C dans une atmosphère humidifiée à 5% de CO 2. Manipuler les cellules dans la hotte de sécurité biologique pour les étapes suivantes. </li><li> Laisser les cellules se développent à une monocouche confluentes avant repiquage dans des boîtes à six puits. Temps pour atteindre la confluence dépend de la densité de placage initial. Utiliser des plaques quivenir à la confluence dans 1 - 2 jours de plaquage pour six puits de placage. Un plat confluentes tissu 10 cm culture traitée présente une densité cellulaire d&#39;environ 4 x 10 6 cellules / ml. Voir la figure 1 pour l&#39; image de la croissance de la culture cellulaire. </li><li> Laver les cellules avec 10 ml de PBS, et trypsiniser avec 0,25% de trypsine (voir Discussion, paragraphe 2). Planche 8 x 10 5 cellules / puits dans 2 ml de milieu de culture de tissus traités six plats bien et laissez adhérer pendant 16 - 20 h. </li></ol> 3. Conditions Transfection <ol><li> Décaler transfections pour les constructions qui peuvent nécessiter des quantités différentes de temps pour atteindre une expression optimale (entre 20 - 36 h). Synchroniser les conditions pour un temps d&#39;expérience unifiée. ont également un contrôle non transfectées ainsi à une densité cellulaire équivalente à utiliser pour le bruit de fond et de la diffusion soustraction lors de l&#39;analyse. </li><li> Amener les réactifs de transfection à la température ambiante: les médias sériques réduits, l&#39;ADN, réactif de transfection. </li><li> Dans unhotte de sécurité biologique combiner des réactifs dans un tube à centrifuger stérile dans l&#39;ordre suivant: mélanger 2 pg d&#39;ADN avec 100 pi réduit de médias de sérum. De Spike 6 pi de réactif de transfection dans les médias / ADN mix sans surface du mélange ou du côté du tube toucher. Mettre en place une réaction de transfection par puits. les conditions de transfection peuvent être optimisés (1 - 4 pg d&#39;ADN, 3 - 6 ul de réactif de transfection) pour atteindre des niveaux d&#39;expression compatibles. Voir le tableau 1 pour des rapports plus optimisés. </li><li> Incuber mélange à la température ambiante dans la hotte de sécurité biologique pendant 15 - 30 min. Ne pas utiliser la réaction si on les laisse incuber pendant plus de 30 min. </li><li> Ajouter réaction à des cellules d&#39;une manière goutte à goutte à travers bien et secouez doucement six puits pour assurer un mélange complet. Ajouter une réaction par puits. </li><li> Après 20 h d&#39;expression, de surveiller la fluorescence en utilisant la culture de tissus microscope à fluorescence. Évaluer l&#39;expression de la population avec 10X localisation objective et de protéines dans une cellule à 40X. observe pour l&#39;expression de protéine à la membrane plasmique (PM). Si intériorisation substantielle est noté, surveiller la transfection jusqu&#39;à expression significative est détectée au PM. </li></ol> 4. Préparation des réactifs et équipement <ol><li> Préparer 100 mM stocks de médicaments et conserver à -80 ° C: bitartrate isoprotérénol (100 mM dans dH 2 O contenant mM d&#39; acide ascorbique 300). Faire de la glace / dans la chambre froide, et le flash-gel immédiatement. Aliquotes peuvent être fabriqués et utilisés jusqu&#39;à un an. </li><li> Préparer cellule tampon (~ 2 ml / condition) et stocker dans un bain d&#39;eau C 37 °. Faire frais chaque jour. Tableau de référence 2 pour cellulaires constituants tampons. </li><li> Préparer le tampon de drogue (10 ml) et stocker à température ambiante. Tableau de référence 2 pour les constituants tampons médicaments. </li><li> Acid lavage des cuvettes en utilisant du HCl concentré. Neutraliser avec une base faible (1 M KOH), et laver soigneusement avec cuvettes dH 2 O. </li><li> Préparer la station de travail autour de fluoromètre avec plusieursboîtes de 10, 200 et 1000 conseils ul de pipette, une minuterie réglée avec un compte à rebours de 10 min, une ligne de vide accessible avec des conseils pour le nettoyage de la cuvette, lingettes de tâches délicates, et gicler bouteille avec ultrapure H 2 O. </li><li> Chauffer un bain d&#39;eau externe pour fluorimètre et la chaleur bloc à 37 ° C. </li><li> Allumez fluoromètre; définir le programme de collecte de fluorescence pour la collecte de la PCP à l&#39;excitation 430 nm, bande passante 8 nm; plage d&#39;émission de 450 nm - 600 nm, bande passante 4 nm. Pour la collecte YFP seulement comme le contrôle du capteur (voir Discussion) ensemble excitation à 490 nm, bande passante 8 nm, plage d&#39;émission 500 - 600 nm, bande passante 4 nm. paramètres de collecte de la PCP seront utilisés pour acquérir un spectre de FRET dans cette expérience. </li><li> Placer douze 1,5 ml microtubes dans le bloc thermique , comme illustré sur la figure 2 ci - dessous. Ces tubes sont des supports pour tubes aliquotes de cellules (tubes à centrifuger 500 pi.) Placer un petit morceau de tissu dans des supports 1 et 7 pour amortir les cuvettes placées ici. Remarque: Utilisez des cuvettes séparées pour connaître l&#39;état non traité et de l&#39;état de la drogue pour éviter la contamination croisée. </li></ol><img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/54696/54696fig2.jpg" /> Figure 2. Microcentrifugeuse Tube Set Up et position de référence dans la chaleur Bloc Cuve pour les échantillons non traités est en position 1. tubes aliquotes de cellules sont en positions 2 - 6. Cuve pour les échantillons traités par le médicament est en position 7; tubes aliquotes de cellules sont dans des positions 8 - 12. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54696/54696fig2large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <ol start="9"><li> Remplir les porteurs 2 - 6 et 8 - 12 ~ avec 750 ul d&#39;eau pour créer un mini-bain de 37 ° C de l&#39;eau. </li><li> Placez dix 500 microtubes pi pour aliquotes de cellules dans des bains mini-eau (porte 2 - 6, 8 - 12). Chaque tube sera une répétition individuelle de la condition (5 untreated, 5 traité par le médicament). </li><li> Surveiller les cellules d&#39;expression (voir étape 3.6). </li></ol> 5. Expérience et collecte de données <img alt="Figure 3" src="/files/ftp_upload/54696/54696fig3.jpg" /> Figure 3. Schéma expérimental. Un guide étape par étape détaillé expérimental mis en place et de l&#39; exécution. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54696/54696fig3large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <ol><li> Référence Figure 3 pour schéma expérimental. Lorsque les cellules sont prêtes à être récoltées, sur la base de l&#39;expression de protéine détectée avec un microscope à fluorescence (voir Discussion, paragraphe 4): dans la hotte de sécurité biologique, retirez délicatement ~ 1 ml de milieu, remettre les cellules dans leur culture avec un P1,000 et transfert resuspension dans un tube de 1,5 ml. Remarque: Évitez d&#39;utiliser la trypsine comme il peut digérer l&#39;extrémité N-terminale et /ou dans la poche du capteur GPCR liant. </li><li> Compter les cellules pour assurer la densité cellulaire appropriée en resuspension. Optimiser le volume de remise en suspension 4 x 10 6 cellules / ml. </li><li> Spin cellules dans oscillante Centrifugeuse à la température ambiante, 290 g pendant 3 min. Retirer le surnageant après la centrifugation. </li><li> Cellules DOUCEMENT resuspendre dans 1 ml cellule tampon (stocké à 37 ° C) et répétez l&#39; étape 5.3. Au cours du deuxième tour, recueillir 100 mM stock de médicaments aliquote de -80 ° C. Faire dilution 1: 100 dans le tampon de médicaments pour 1 mM de travail et maintenir à température ambiante. </li><li> Après la seconde centrifugation, éliminer le surnageant et remettre en suspension les cellules doucement dans 1 ml de tampon de cellules (4 x 10 6 cellules / ml). Mesurer la DO 600 de l&#39;échantillon dans le spectrophotomètre en utilisant 1 ml de cellules et de 1 ml d&#39; une cellule tampon comme un blanc. Distribuer les cellules dans une cuvette en plastique jetable et transfert à un tube à centrifuger immédiatement après spectrophotométrie. </li><li> Pour une commande de cel non transfectéesl état du spectre, resuspendre délicatement les cellules non transfectées dans 1 ml cellule tampon avec P1,000 pipette, ajouter 90 ul de cellules à cuvette et acquérir le spectre FRET à excitation 430 nm, bande passante 8 nm, émission 450-600 nm, bande passante 4 nm. Collecter 3 - 5 spectres de répétition avec frais de 90 pi de cellules. Gardez stock de cellules à 37 ° C entre les spécifications, resuspendre doucement avec P1,000 entre chaque échantillon aliquote, et rincer avec cuvette ultrapure H 2 O entre les échantillons. </li><li> Pour des conditions expérimentales aliquotes de 90 ul des cellules transfectées à chacun des tubes de 500 ul dans des supports 2 - 6, 8 - 12 dans le bloc thermique. Resuspendre doucement stock de cellules avec P1,000 pipette entre chaque aliquote. </li><li> Après que les cellules sont aliquotées, ajouter 10 ul de tampon de médicaments aux tubes 2 - 6 pour des échantillons d&#39;état non traitées. </li><li> Commencez l&#39;expérience en ajoutant 10 pi de solution de médicament 1 mM dans le tube 8, démarrer la minuterie compte à rebours de 10 min, et doucement le tube mélanger avec P200 pipette. Fermer le tube et le retour à 37° C bloc thermique. </li><li> ramasser immédiatement tube 2, mélanger doucement avec P200 (utiliser une nouvelle pointe), ajouter 90 ul de suspension cellulaire à l&#39;état non traité cuvette, et le placer dans fluoromètre. </li><li> Acquérir spectre FRET à excitation 430 nm, bande passante 8 nm, émission 450-600 nm, bande passante 4 nm. </li><li> A 9 min - 10 sec, spike tube 9 avec 10 pi de solution médicamenteuse 1 mM, mélanger délicatement avec un P200 (utiliser une nouvelle pointe), et le tube pour chauffer le bloc de retour. </li><li> Répétez les étapes 05.10 à 05.11 avec le tube 3 et 5.12 avec le tube 10. </li><li> Répétez les étapes 5,10 à 5,13 à des intervalles de 1 minute (8:10, 7:10, etc.) jusqu&#39;à ce que les spectres sont collectées pour tous les échantillons de condition non traités, et le médicament a été ajouté à tous les échantillons de l&#39; état ​​des médicaments. Utilisez une nouvelle astuce pour chaque étape de la pipette pour éviter la contamination croisée. </li><li> A 5 min - 10 sec, commencer à mélanger tube 8 (condition de la drogue) doucement avec P200 pipette, ajouter 90 ul de suspension cellulaire à cuvette séparée pour la drogue échantillon traité et dans fluoromètre. </li><li> Acquérir Fspectre de RET (voir l&#39;étape 5.11 pour les réglages). </li><li> Répétez les étapes 05.15 à 05.16 à des intervalles de 1 minute (4:10, 3:10, etc.) pour encore état ​​de drogue échantillons (tubes 9 - 12). </li><li> Après la fin de l&#39; expérience, enregistrer des fichiers de projet, laver à fond avec cuvettes ultrapure H 2 O, et repeupler tubes pour connaître l&#39; état ​​suivant. Prenez soin d&#39;éviter la contamination croisée dans l&#39;étape de lavage. Changer la pointe de la O bouteille H 2 ainsi que sur la ligne de vide entre les lavages. </li></ol> Analyse 6. Données <ol><li> Sauvegardez et fichiers de données d&#39;exportation dans la CPS format à utiliser pour l&#39;analyse. programmes d&#39;analyse sont disponibles pour téléchargement à partir du site publication Sivaramakrishnan Lab. </li><li> Créer des fichiers de chemin d&#39;accès pour le logiciel d&#39;analyse qui comprennent les programmes d&#39;analyse (v9, v15), les fichiers échantillons non transfectées (voir étape 5.6 pour la collecte du spectre de cellules non transfectées), fichier de données de sortie, et les valeurs séparées par des virgules fichiers (CSV) pour la saisie des données. </li><li> Entrez les informations suivantesdans un fichier CSV (voir exemple dans le tableau 3) et désigner les conditions respectives pour chaque échantillon, y compris: Nom du fichier - fichiers graphiques SPC individuels Récepteur - désigné qui GPCR construction a été testée (par exemple, Β2) Liant - qui désignent la variante de peptide de la construction a été testée (par exemple, S) Agonist - désigner non traitée (N) ou traités par le médicament (D) conditions De noms - le dossier de chemin dans lequel les fichiers SPC sont enregistrés, généralement organisés par date OD - enregistrée densité optique de l&#39;échantillon de spectrophotomètre </li><li> Entrez les noms de fichiers pour les échantillons non transfectées (étape 5.6) pour soustraire le tampon et le bruit de diffusion à partir d&#39;échantillons. </li><li> Entrez les conditions dans le programme d&#39;analyse. </li><li> Exécuter des programmes pour analyser des échantillons à l&#39;intérieur des conditions individuelles (v9) et à travers des conditions (v15). </li><li> Exclure les fichiers échantillons qui sont aberrantes apparentes dans l&#39;ensemble de données, ou d&#39;ajuster pour la soustraction en augmentant ou en diminuant la valeur de DO de individouble fichiers. </li><li> Exporter des données vers le fichier de sortie pour l&#39;accès à calculer FRET rapports (525 nm / 475 nm). </li><li> Calculer ΔFRET en soustrayant le taux de FRET moyen pour connaître l&#39;état non traité à partir des rapports de FRET individuels pour traités conditions (de drogue). </li></ol>

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</ol>

Les auteurs déclarent qu&#39;ils ont aucun conflit d&#39;intérêts.

La gamme dynamique étroite de mesures FRET dans ce système renforce la nécessité d&#39;un contrôle de qualité sensible à chaque étape de ce protocole. Les étapes les plus importantes pour assurer une expérience réussie FRET sont 1) la culture cellulaire, 2) la transfection 3) d&#39;expression de protéines et 4), en temps opportun, une coordination précise lors de l&#39;exécution du test. la santé cellulaire et la qualité d&#39;entretien / de placage peuvent avoir un impact significatif sur l...

G récepteurs couplés aux protéines (RCPG) sont des récepteurs à sept domaines transmembranaires. Le génome humain contient environ 800 seuls les gènes codant pour des GPCR, qui sont activés par une variété de ligands, y compris la lumière, des agents odorants, des hormones, des peptides, des médicaments et d&#39;autres petites molécules. Près de 30% de tous les produits pharmaceutiques actuellement sur ​​les RCPG cibles du marché , car ils jouent un rôle important dans de nombreux états pathologiques 2. Malgré des décennies de travail considérable effectué sur cette famille de récepteurs, il reste des questions en suspens importantes dans le domaine, en particulier en ce qui concerne les mécanismes moléculaires qui conduisent les interactions GPCR-effectrices. À ce jour, une seule structure cristalline à haute résolution a été publiée, donnant un aperçu de l&#39;interaction entre le β 2 adrénergiques (β 2 -AR) et la protéine Gs 3. En collaboration avec des recherches approfondies au cours des trois dernières décennies, il réitère une composante structurelle spécifique qui est essentiel dans cel&#39;interaction: la sous-unité Ga C-terminale. Cette structure est importante tant pour activation des protéines G par le GPCR 4 et G sélection de protéines 5-6. Par conséquent, le Ga C-terminale fournit un lien essentiel entre la stimulation du ligand de GPCR et l&#39;activation de la protéine G sélective. Recherche au cours de la dernière décennie suggère que les GPCR peuplent un vaste paysage conformationnel, avec la liaison ligand-stabilisation des sous-ensembles de conformations GPCR. Bien que plusieurs techniques, incluant la cristallographie, la RMN et la spectroscopie de fluorescence, la spectrométrie de masse sont disponibles pour examiner le paysage conformationnel GPCR, il existe peu d&#39;approches pour élucider leur signification fonctionnelle dans le choix des effecteurs 7. Ici, nous décrivons un Fӧrster transfert d&#39;énergie par résonance (FRET) approche à base de détecter G conformations GPCR protéine-sélective. FRET repose sur la proximité et de l&#39;orientation parallèle de deux fluorophores avec chevauchement des émissions (donneur) ae excitation (accepteur) spectres 8. Étant donné que les fluorophores donneur et accepteur sont rapprochés à la suite de chaque changement conformationnel dans la protéine ou une interaction protéine-protéine, le FRET entre eux augmente, et peut être mesurée en utilisant une variété de méthodes 8. Biocapteurs FRET ont été utilisés largement dans le domaine GPCR 9. Ils ont été utilisés pour sonder des changements de conformation dans le GPCR en insérant le donneur et accepteur dans la troisième boucle intracellulaire et RCPG extrémité C-terminale; les capteurs sont conçus pour sonder le GPCR et les interactions effectrices par marquage séparément le GPCR et effecteur (G sous - unités protéiques / arrestine) avec une paire de FRET 10; certains capteurs détectent également les changements conformationnels dans la protéine G 11. Ces biocapteurs ont permis le terrain pour poser une multitude de questions en suspens , y compris des changements conformationnels dans le GPCR et effecteur, GPCR-effectrices cinétiques d&#39;interaction, et les ligands allostériques 12. Notre groupea été particulièrement intéressé par la création d&#39;un biocapteur capable de détecter G conformations GPCR spécifiques de la protéine dans des conditions conduit agoniste. Ce biocapteur repose sur une technologie développée récemment nommée SPASM (systématique force modulation des protéines d&#39;affinité) 13. SPASM implique tethering interagissant domaines protéiques en utilisant un ER / K lieur, qui contrôle leurs concentrations efficaces. Débordement l&#39;éditeur de liens avec une paire de fluorophores FRET crée un outil qui peut signaler l&#39;état de l&#39;interaction entre les protéines 12. Auparavant 1 le module SPASM a été utilisé pour attacher le Ga C-terminale à un GPCR et de surveiller leurs interactions avec les fluorophores FRET, mCitrine (appelé dans ce protocole par sa variante communément connu, Jaune Fluorescent Protein (YFP), excitation / pic d&#39;émission à 490/525 nm) et mCerulean (dénommé dans le présent protocole par sa variante communément appelé Cyan fluorescent Protein (PCP), excitation / pic d&#39;émission 430/475 nm). A partir de N- à C-terminale, tson polypeptide unique codé génétiquement contient: une pleine longueur GPCR, FRET accepteur (mCitrine / YFP), 10 nm ER / K linker, donneur de FRET (mCerulean / CFP), et le peptide Ga C-terminale. Dans cette étude, les capteurs sont abrégés comme agent de liaison de GPCR-longueur Ga peptide. Tous les composants sont séparés par un non structurée (Gly-Ser-Gly) 4 segment de liaison qui permet une rotation libre de chaque domaine. La caractérisation détaillée de ces capteurs a déjà été réalisée en utilisant deux GPCR prototypiques: β 2 -AR et opsin 1. Ce capteur est transfecté de manière transitoire dans des cellules HEK-293T et en temps réel des expériences cellulaires mesure des spectres de fluorescence en fonction du fluorimètre, de la paire de FRET en unités arbitraires de coups par seconde (CPS) en présence ou en absence de ligand. Ces mesures sont utilisées pour calculer un ratio de FRET entre les fluorophores (YFP max / CFP max). Un changement de FRET (ΔFRET) est ensuite calculée en soustrayant le ratio moyen de FRETdes échantillons non traités à partir du rapport de FRET d&#39;échantillons de ligand traitée. ΔFRET peut être comparé à travers des constructions (β 2 -AR-10 nm-peptide par rapport ß Gas 2 -AR-10 nm-no peptide). Ici, nous détaillons le protocole d&#39;exprimer ces capteurs dans des cellules vivantes HEK-293T, surveiller leur expression, et la configuration, l&#39;exécution et l&#39;analyse des cellules vivantes à base fluoromètre-FRET mesure pour non traité contre les conditions traitées par le médicament. Alors que ce protocole est spécifique pour le capteur de peptide β nm Gas 2 -Ar-10 traitées avec 100 uM d&#39; isoprotérénol bitartrate, elle peut être optimisée pour les différentes paires de GPCR-Ga et des ligands.

<table><tbody><tr><td>B2-AR-10 nm-Capteur de peptide de gaz</td><td>Addgene</td><td>47438</td><td>https://www.addgene.org/Sivaraj_Sivaramakrishnan/</td></tr> <tr><td>GeneJET Plasmid Miniprep Kit</td><td>Fermentas/Fisher Sci FERK0503</td><td></td><td>élué en 2 mM Tampon d’élution Tris</td></tr><tr><td>HEK-293T-Flp-n Cellules Life</td><td>Technologies</td><td>R78007</td><td></td></tr><tr><td>Trypsine (0,25 %)</td><td>Life Technologies</td><td>25200056</td><td></td></tr><tr><td>DMEM- hyperglycémie</td><td>Life Technologies</td><td>11960-044</td><td>Chaud in&nbsp ; 37 &deg ; C bain-marie avant utilisation</td></tr><tr><td>FBS, certifié, inactivé par la chaleur, origine américaine</td><td>Life Technologies</td><td>10082147</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax I 100x</td><td>Life Technologies</td><td>35050061</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Corning</td><td>MT25060CL</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM</td><td>Life Technologies</td><td>31985-070</td><td>Milieu sérique réduit ; Apporter à RT avant utilisation</td></tr><tr><td>XtremeGene HP transfection reagenet</td><td>Roche</td><td>6366236001</td><td>Fortement recommandé pour sa consistance. Apporter à RT avant utilisation</td></tr><tr><td>FluoroMax 4</td><td>Horiba</td><td></td><td>À utiliser avec le logiciel FluorEssence V3.8</td></tr><tr><td>Cuvette en quartz de 3 mm de longueur de trajet</td><td>Starna</td><td>NC9729944(16.45F-Q-3/z8.5)</td><td>Peut nécessiter un porte-cuvette/adaptateur pour une utilisation dans un fluorimètre, disponible auprès de Starna</td></tr><tr><td>Sc100-S3 Pompe à bain d’eau de circulation chauffée</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-874-826</td><td>Chaud à 37 &deg ; C avant utilisation</td></tr><tr><td>Thermomixeur Bloc de chaleur</td><td>Eppendorf</td><td>22670000</td><td>Chaud à 37 &deg ; C avant l’utilisation</td></tr><tr><td>Eau libre d’ADN/ARNse ultrapure</td><td>Life Technologies</td><td>10977015</td><td>Utilisation à RT</td></tr><tr><td>D(+)-glucose, anhydre</td><td>Sigma</td><td>G5767</td><td></td></tr><tr><td>aprotinine de poumon bovin</td><td>Sigma</td><td>A1153</td><td></td></tr><tr><td>hémisulfate de leupeptine</td><td>EMD</td><td>10-897</td><td></td></tr><tr><td>Acide L-ascorbique, qualité réactif</td><td>Sigma</td><td>A0278</td><td></td></tr><tr><td>(-)- bitartrate d’isoprotérénol (+)-</td><td>Sigma</td><td>I2760</td><td>Utiliser une aliquote fraîche à chaque expérience</td></tr></tbody></table>

conformations gpcr g protein-sélectifs mesurée à l&#39;aide de fret capteurs dans un fluorometer assay de cellules vivantes de suspension

G Protein-selective GPCR Conformations Measured Using FRET Sensors in a Live Cell Suspension Fluorometer Assay

Fӧrster transfert d&#39;énergie par résonance (FRET) à base d&#39;études ont de plus en plus courante dans l&#39;enquête de la signalisation GPCR. Notre groupe de recherche a développé un capteur de FRET intra-moléculaire pour détecter l&#39;interaction entre les sous-unités et les GPCR dans des cellules vivantes après stimulation agoniste Ga. Ici, nous détaillons le protocole pour la détection des changements dans le FRET entre le β 2 adrénergiques et l&#39;extrémité C-terminale Gas peptide lors d&#39;un traitement avec du chlorhydrate d&#39;isoprotérénol 100 uM comme précédemment caractérisé 1. Notre capteur de FRET est un polypeptide constitué en série d&#39;un GPCR de longueur totale, un fluorophore accepteur de FRET (mCitrine), un ER / K SPASME (affinité de la protéine systématique force modulation) de liaison, un fluorophore FRET donneur (mCerulean), et une Ga C peptide -terminale. Ce protocole sera la préparation détaillée de la cellule, les conditions de transfection, la configuration de l&#39;équipement, l&#39;exécution de l&#39;essai et l&#39;analyse des données. Cette conception expérimentale détecte petite changes de FRET indiquant des interactions protéine-protéine et peut également être utilisé pour comparer la force de l&#39;interaction entre les ligands et le GPCR-G paires de protéines. Pour améliorer le rapport signal-bruit dans nos mesures, ce protocole exige une précision accrue dans toutes les étapes, et est présenté ici pour permettre l&#39;exécution reproductible.

Un schéma généralisé de l&#39;expérience mise en place et l&#39; exécution est détaillée dans la figure 3. Afin de détecter un changement de FRET dans la plage dynamique étroite du capteur, il est essentiel de respecter les nuances du système être respectées. La qualité cellulaire est impératif d&#39;expression de la protéine ainsi que la cohérence dans l&#39; échantillonnage. Figure 1 Caractéristiques des images de cellules cultivées en croissance dans une ...

Des méthodes simples pour détecter l’activation sélective des protéines G par les récepteurs couplés aux protéines G restent un défi majeur dans la signalisation cellulaire. Ici, des biocapteurs de transfert d’énergie par résonance Förster (FRET) ont été développés en attachant par paires un RCPG à des peptides de protéine G pour sonder les changements de conformation à des concentrations contrôlées dans des cellules vivantes.

Conformations GPCR G Protein-sélectifs mesurée à l&#39;aide de FRET capteurs dans un Fluorometer Assay de cellules vivantes de suspension

F&#1255;rster resonance energy transfer (FRET)-based studies have become increasingly common in the investigation of GPCR signaling. Our research group ...

L'objectif général de cet essai basé sur le transfert d'énergie par résonance de Förster (FRET) en cellules vivantes est d'évaluer les conformations des récepteurs couplés aux protéines G, ou RCPG, spécifiques des protéines G sous différentes conditions d'agonistes. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine des RCPG concernant leurs interactions avec différents effecteurs ainsi que l'effet de divers médicaments sur la conformation du récepteur. Le principal avantage de cette technique réside dans le caractère modulaire des capteurs, qui peuvent être facilement réingénierés pour différentes combinaisons de RCPG et de peptides G alpha, y compris la sous-unité G alpha complète.Bien que cette méthode puisse fournir des informations sur le choix des protéines G et la réponse à différents ligands, elle peut également être utilisée pour explorer les conséquences physiologiques d'une activation différentielle des protéines G. Avant de commencer la procédure, cultiver les cellules d'intérêt en milieu complet à 37 degrés Celsius dans une atmosphère humidifiée contenant cinq pour cent de dioxyde de carbone, jusqu'à ce que les cultures atteignent la confluence.Ensuite, détacher les cellules à l’aide de la trypsine et repiquer les cultures à huit fois dix puissance cinq cellules par puits dans deux millimètres de milieu, dans des boîtes de culture de tissus à six puits, pendant 16 à 20 heures. Après 16 à 20 heures, préparer une réaction de transfection par puits lorsque les cellules se sont fixées aux plaques, dans une hotte de sécurité biologique, et laisser les mélanges de réactifs s’équilibrer pendant 15 à 30 minutes. À la fin de l’incubation, ajouter une réaction par culture cellulaire, goutte à goutte, sur l’ensemble du puits.Agiter doucement la plaque pour assurer une répartition homogène du réactif dans toutes les cultures. Puis remettre la plaque dans l'incubateur de culture cellulaire. Après 20 heures, analyser les cultures pour l'expression protéique de la membrane plasmique et évaluer la viabilité cellulaire.Si une internalisation importante de la protéine est observée, surveillez la transfection jusqu'à ce qu'une expression significative soit détectée au niveau de la membrane plasmique. L'évaluation du niveau d'expression de la protéine est essentielle pour un dispositif expérimental optimal. Si les cellules sont mal transfectées ou si l'expression de la protéine est trop faible, attendez avant de récolter les cellules.Sinon, le signal fluorescent pourrait être insuffisant pour l'analyse. Lorsque les cellules sont prêtes à être récoltées, transférez-les dans l'enceinte de sécurité biologique et retirez délicatement un millilitre de milieu. À l’aide d’une pipette P1000, resuspendez les cellules dans un millilitre de milieu restant par puits et transférez les suspensions cellulaires dans des tubes microcentrifuge individuels de 1,5 millilitre.Compter les cellules et former un culot cellulaire par centrifugation. Éliminer le milieu du culot cellulaire. Resuspendre délicatement le surnageant dans un millilitre de tampon pour cellules à 37 degrés Celsius et répéter la centrifugation.Resuspendre le culot à une concentration de quatre fois dix puissance six cellules par millilitre dans du tampon cellulaire frais après la deuxième centrifugation. Ensuite, ajouter 90 microlitres de cellules témoins dans une cuvette et acquérir le spectre FRET témoin. Après avoir collecté trois à cinq spectres témoins répétés, en utilisant 90 microlitres frais de cellules pour chaque mesure, répéter les étapes de resuspension, de centrifugation et de lavage pour les cellules transfectées.Prélevez 90 microlitres de cellules transfectées dans chaque tube de 500 microlitres placé dans les positions deux à six et huit à 12 sur un bloc chauffant, en redispersant délicatement les cellules entre chaque prélèvement. Une fois toutes les cellules transférées, ajoutez 10 microlitres de tampon sans agent actif aux tubes deux à six pour les échantillons du groupe témoin. Ensuite, ajoutez 10 microlitres de la solution de médicament à une concentration de un millimolaire au tube huit.Démarrez un minuteur pour un compte à rebours de 10 minutes et utilisez une pipette P200 pour mélanger délicatement le contenu du tube. Fermez le tube après le mélange et remettez-le sur le bloc chauffant. Ensuite, prenez immédiatement le tube deux.Mélangez délicatement son contenu avec une nouvelle pipette. Ajoutez 90 microlitres de la suspension de cellules transfectées dans la cuvette de la condition non traitée et placez la cuvette dans le fluoromètre. Enregistrez le spectre FRET de l'échantillon en utilisant les mêmes paramètres que pour les spectres témoins.À neuf minutes et 10 secondes, ajoutez 10 microlitres de la solution de médicament à un millimolaire dans le tube neuf. Mélangez délicatement le contenu du tube et replacez-le dans le bloc chauffant. Ensuite, prenez immédiatement le tube trois, mélangez-le et mesurez le contenu de la cuvette comme vient de l'être démontré pour le tube deux.À cinq minutes et dix secondes, mélanger délicatement le tube huit à l’aide d’une pipette P200. Ajouter 90 microlitres de la suspension cellulaire dans une cuvette séparée pour la mesure de l’échantillon traité au médicament et acquérir le spectre FRET de l’échantillon en condition médicamenteuse. Une fois tous les spectres acquis, enregistrer les fichiers du projet.Lavez soigneusement les cuvettes avec de l'eau ultra-pure et rechargez les tubes pour la condition suivante. Sur cette image, on observe une monocouche homogène de culture cellulaire, optimale pour la mise en place dans des plaques à six puits et la transfection. Toutefois, ces cellules qui se développent en motifs groupés conduisant à des formes dendritiques ne sont pas recommandées pour un semis uniforme ni pour une analyse fiable de l'expression protéique ou une mesure de FRET.Les conditions de transfection peuvent également être optimisées afin d'obtenir une expression reproductible. Une fois que toutes les données ont été recueillies et saisies dans un fichier CSV pour analyse, les résultats obtenus seront semblables à ces spectres moyens de FRET bruts et normalisés représentatifs. Tous les spectres de FRET bruts issus de cette expérience représentative présentent un signal lisse et une plage signal sur bruit suffisante, permettant une analyse cohérente des données avec un pic d'eau minimal provenant de l'échantillon.Lorsque les données sont normalisées à 475 nanomètres, le nombre de comptes par seconde de cette valeur est fixé à 1,0 et le changement significatif observé à la lecture de 525 nanomètres entre les échantillons traités et non traités devient apparent. Si l'expression protéique est faible, si l'efficacité de transfection est médiocre ou si la densité cellulaire dans la cuvette est faible lors de la lecture de la fluorescence, les données brutes peuvent être bruitées, ce qui pose un problème lors de la soustraction du fond et de la normalisation, conduisant à des spectres qui ne s'alignent pas et ne peuvent pas être analysés. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en 25 minutes si elle est effectuée correctement.Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de manipuler délicatement les cellules à toutes les étapes de l'expérience. Après cette méthode, la technique peut être étendue pour tester différents capteurs FRET de récepteurs, différents médicaments et effecteurs, ainsi que différents types cellulaires. Depuis son développement, cette technique a contribué au domaine des RCPG, où des études récentes utilisant ces capteurs ont permis de mieux comprendre le mécanisme moléculaire de sélection des protéines G.Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment évaluer des confirmations spécifiques des RCPA à l’aide d’un dosage basé sur la mesure de la construction FRET ancrée en cellules vivantes. N’oubliez pas que manipuler des cultures cellulaires de mammifères et certains médicaments expérimentaux peut présenter des risques extrêmement élevés, et que des précautions telles que le port d’équipements de protection individuelle adaptés doivent toujours être prises lors de l’exécution de cette procédure.

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JoVE Journal

Biology

Biologie

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Imagerie interactions protéine-protéine In vivo</em

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Conformations GPCR G Protein-sélectifs mesurée à laide de FRET capteurs dans un Fluorometer Assay de cellules vivantes de suspension (Vidéo) | JoVE Journal

Conformations GPCR G Protein-sélectifs mesurée à l'aide de FRET capteurs dans un Fluorometer Assay de cellules vivantes de suspension

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