Conformations GPCR G Protein-sélectifs mesurée à l'aide de FRET capteurs dans un Fluorometer Assay de cellules vivantes de suspension

L’objectif global de ce test basé sur le transfert d’énergie de résonance de Forster sur cellule vivante, ou FRET, est d’évaluer les conformations sélectives du récepteur couplé à la protéine G ou RCPG dans différentes conditions agonistes. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine des RCPG sur les interactions des RCPG avec différents effecteurs et l’effet de différents médicaments sur la confirmation des récepteurs. Le principal avantage de cette technique est que les capteurs sont modulaires et peuvent être facilement repensés pour différentes combinaisons de peptides GPCR et G alpha, y compris la sous-unité complète et G alpha.

Bien que cette méthode puisse fournir un aperçu de la sélection de la protéine G et de la réponse à différents lygènes. Il peut également être appliqué pour explorer la conséquence physiologique de l’activation différentielle de la protéine G. Avant de commencer la procédure, cultivez les cellules d’intérêt dans un milieu complet à 37 degrés Celsius dans une atmosphère humidifiée à cinq pour cent de dioxyde de carbone jusqu’à ce que les cultures atteignent la confluence.

Ensuite, détachez les cellules avec de la trypsine et faites passer les cultures à huit fois 10 à la cinquième cellules par cellule dans deux millimètres de milieu dans une culture tissulaire traitée à six puits pendant seize à 20 heures de culture. Après 16 à 20 heures, préparez une réaction de transfection par puits lorsque les cellules ont adhéré aux plaques dans une enceinte de sécurité biologique et laissez les mélanges de réactifs s’équilibrer pendant 15 à 30 minutes. À la fin de l’incubation, ajoutez une réaction à chaque culture cellulaire goutte à goutte dans le puits.

Secouez doucement la plaque pour assurer une distribution complète du réactif dans les cultures. Remettez ensuite la plaque dans l’incubateur de culture cellulaire. Après 20 heures, analysez les cultures pour l’expression des protéines de la membrane plasmique et évaluez la santé cellulaire.

Si une internalisation substantielle de la protéine est observée, surveiller la transfection jusqu’à ce qu’une expression significative soit détectée au niveau de la membrane plasmique. L’évaluation du niveau d’expression des protéines est impérative pour un dispositif expérimental optimal. Si les cellules ont mal transfecté ou si l’expression des protéines est trop faible, attendez de récolter les cellules.

Sinon, le signal fluorescent peut être inadéquat pour l’analyse. Lorsque les cellules sont prêtes à être récoltées, transférez-les dans l’enceinte de biosécurité et retirez délicatement un millilitre de milieu. À l’aide d’une pipette P1000, remettre les cellules en suspension dans un millilitre de milieu restant par puits et transférer les suspensions cellulaires dans des tubes de microcentrifugation individuels de 1,5 millilitre.

Comptez les cellules et granulez les cellules par centrifugation. Retirez le milieu de la pastille de cellule. Remettez doucement le surnageant en suspension dans un millilitre de tampon cellulaire à 37 degrés Celsius et répétez la centrifugation.

Remettez la pastille en suspension à une concentration de quatre fois 10 à la sixième cellule par millilitre dans un tampon de cellules fraîches après le deuxième essorage. Ensuite, ajoutez 90 microlitres de cellules de contrôle dans une cuvette et acquérez le spectre FRET de contrôle. Après avoir collecté trois à cinq spectres de contrôle répétés avec 90 microlitres de cellules fraîches pour chaque mesure, répétez les étapes de suspension, d’essorage et de lavage pour les cellules transfectées.

Aliquote 90 microlitres de cellules transfectées dans chaque tube de 500 microlitres dans le support deux à six et huit à 12 dans un bloc thermique, en remettant doucement les cellules en suspension entre chaque aliquote. Lorsque toutes les cellules ont été transférées, ajoutez 10 microlitres de tampon de médicament dans les tubes deux à six pour les échantillons de condition non traités. Ajoutez ensuite 10 microlitres d’un millimolaire de la solution médicamenteuse dans le tube huit.

Démarrez une minuterie pour le compte à rebours à partir de 10 minutes et utilisez une pipette P200 pour mélanger doucement le contenu du tube. Fermez le tube après avoir mélangé et remettez-le dans le bloc de chaleur. Ensuite, prenez immédiatement le tube deux.

Mélangez doucement son contenu avec une nouvelle pointe. Ajoutez 90 microlitres de suspension de cellules transfectées dans la cuvette d’état non traitée et placez la cuvette dans le fluorimètre. Acquérez le spectre FRET de l’échantillon en utilisant les mêmes paramètres que pour les spectres de contrôle.

À neuf minutes et 10 secondes, piquez le tube neuf avec 10 microlitres de la solution médicamenteuse d’un millimolaire. Mélangez délicatement le contenu du tube et remettez le tube dans le bloc chauffant. Ensuite, prenez immédiatement le tube trois et mélangez et mesurez le contenu de la cuvette comme nous venons de le démontrer pour le tube deux.

Au bout de cinq minutes et 10 secondes, mélangez délicatement le tube huit à l’aide d’une pipette P200. Ajoutez 90 microlitres de suspension cellulaire dans une cuvette séparée pour la mesure de l’échantillon traité par le médicament et acquérez le spectre FRET pour l’échantillon de l’état du médicament. Une fois que tous les spectres ont été acquis, enregistrez les fichiers du projet.

Lavez soigneusement les cuvettes avec de l’eau ultra pure et réapprovisionnez les tubes pour la prochaine condition. Sur cette image, une monocouche de culture cellulaire homogène optimale pour le placage et la transfection à six puits est montrée. Cependant, ces cellules se développant selon des motifs agglomérés qui conduisent à des formes dendritiques, ne sont pas recommandées pour un placage cohérent et une analyse précise de l’expression des protéines ou une mesure FRET.

Les conditions de transfection peuvent également être optimisées pour obtenir une expression reproductible. Une fois que toutes les données ont été collectées et saisies dans un fichier CSV pour analyse, les résultats générés ressembleront à ces spectres RAW et FRET moyens normalisés représentatifs. Tous les spectres FRET RAW de cette expérience représentative démontrent une plage signal/bruit fluide et suffisante, permettant une analyse cohérente des données avec un pic d’eau minimal de l’échantillon.

Lorsque les données sont normalisées à 475 nanomètres, le nombre par seconde de cette valeur est fixé à 1,0 et le changement significatif à la lecture de 525 nanomètres entre les échantillons traités et non traités devient apparent. Si l’expression de la protéine est faible ou s’il y a une faible efficacité de transfection ou une faible densité cellulaire dans la cuvette pour la lecture de la fluorescence, les données RAW peuvent être bruyantes, ce qui entraîne un problème de soustraction et de normalisation du bruit de fond, ce qui entraîne des spectres qui ne s’alignent pas et ne peuvent pas être analysés. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en 25 minutes si elle est correctement exécutée.

Lors de cette procédure, il est important de se rappeler d’être doux lors de la manipulation des cellules à toutes les étapes de l’expérience. À la suite de cette procédure, la technique peut être étendue pour tester différents capteurs FRET de récepteurs, différents médicaments et effecteurs et différents types de cellules. Après son développement, cette technique a contribué au domaine des RCPG où des études récentes utilisant ces capteurs ont mis en lumière le mécanisme moléculaire de la sélection des protéines G.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’évaluer des confirmations spécifiques de RCPG à l’aide d’un test de mesure de construction FRET de sangle de cellule vivante. N’oubliez pas que travailler avec des cultures de cellules de mammifères et certains médicaments expérimentaux peut être extrêmement dangereux et que des précautions telles que le port d’un équipement de protection individuelle approprié doivent toujours être prises lors de l’exécution de cette procédure.