Name: Imaging of Cell Forme Altération et Mouvement cellulaire dans Drosophila Gastrulation Utilisation DE-cadhérine Reporter mouches transgéniques (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 4 min 42 s
Description: Découvrez l'imagerie en direct de la gastrulation chez Drosophila pour étudier la constriction apicale et les mouvements cellulaires morphogénétiques. Cette méthode permet d'analyser la dynamique des cellules en développement embryonnaire.

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Cette étude a été financée par la Fondation Astellas pour la recherche sur les troubles métaboliques (HT), la Fondation Takeda Science (HT) et le programme soutenu par MEXT pour la Fondation de recherche stratégique dans les universités privées (HT).

NOTE: Les mouches transgéniques utilisées dans cette étude sont les suivants: DE-cad :: GFP 10. 1. Préparation d&#39;Apple Plate <ol><li> Préparer un mélange de 12,5 g d&#39; agar, 125 mL 100% disponible dans le commerce de jus de pomme, 12,5 g de glucose et 375 ml H 2 O. Chauffer le mélange dans un micro - ondes et versez - le dans une boîte de culture de cellules de 3 cm. Stocker le mélange à 4 ° C pour une utilisation future. </li><li> Après la préparation de la plaque de pomme, ajouter une fine couche de pâte malaxée de levure au-dessus de celui-ci pour permettre aux mouches de jeter l&#39;œuf. </li></ol> 2. Embryon Préparation et direct Protocole d&#39;imagerie <ol><li> Placez environ 50 mouches (25 mâles et 25 femelles) dans une bouteille pour accoupler et ensuite pondre des œufs durant la nuit sur une plaque de pomme couverte dans la levure malaxée. Placer la plaque de jus de pomme à l&#39;embouchure de la bouteille. Gardez la bouteille à l&#39;envers dans un incubateur. Envelopper les bouteilles en plastique Drosophila d&#39;actions avec une feuille d&#39;aluminium pour inciter ee vole à pondre plus d&#39;œufs. </li><li> Le lendemain matin, remplacer l&#39;ancienne plaque de jus de pomme avec un nouveau. </li><li> Que les mouches pondent des œufs pendant 3 à 4 h en enveloppant la bouteille avec du papier d&#39;aluminium. </li><li> Trois à quatre heures plus tard, de recueillir les embryons dans une passoire à l&#39;embryon de la plaque de jus de pomme à l&#39;aide d&#39;une brosse ou de coton mauvais et les laver avec du PBS. Laver les embryons de 2 à 3 fois plus avec PBS dans des boîtes de culture de 12 puits. </li><li> Dechorionate les embryons avec 50% de javel pendant 5 min dans des boîtes de culture de 12 puits. </li><li> Après le processus de dechorionation, laver les embryons de 2 à 3 fois plus avec PBS. </li><li> Transférer les embryons dans une boîte de culture cellulaire 3 cm contenant du PBS et sélectionnez l&#39;étape 5 embryons au microscope sur la base du niveau de transparence à leurs frontières. Pipeter les embryons mis en scène à l&#39;aide d&#39;une pipette de 200 pi. </li><li> Ensuite, placez deux embryons sélectionnés sur une lamelle de verre, et éliminer l&#39;excès de PBS avec du papier de soie finement torsadée. Orientez les embryons côté dorsal surla lamelle en utilisant un papier de soie finement torsadée. Après cela, fixer les embryons à la lamelle de verre avec de la graisse de silicium en utilisant une aiguille fine et du papier de soie torsadée. </li><li> Ajouter une petite goutte d&#39;huile d&#39;halocarbures 700 sur les embryons et placer la lamelle contenant les embryons à l&#39;envers sur la lame dentelée, en laissant un peu d&#39;espace au bas de la diapositive. </li><li> Examiner les embryons en utilisant un système d&#39;imagerie confocale, une Argon / 488 laser, et un objectif à immersion (63X). NOTE: Identification de l&#39;embryon au stade de développement approprié est important de capturer des images de l&#39;événement gastrulation. Dans ces conditions, observent presque tous les embryons se développent normalement au moins jusqu&#39;à l&#39;étape 14. L&#39;embryon analysé peut être cultivé à développer davantage comme un adulte. </li></ol>

<ol><li>Haruta, T., Warrior, R., Yonemura, S., Oda, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+proximal+half+of+the+Drosophila+E-cadherin+extracellular+region+is+dispensable+for+many+cadherin-dependent+events+but+required+for+ventral+furrow+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Cells%22%5BJournal%5D)">The proximal half of the Drosophila E-cadherin extracellular region is dispensable for many cadherin-dependent events but required for ventral furrow formation.</a> Genes Cells. 15 (3), 193-208 (2010).</li>
<li>Oda, H., Takeichi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolution%3A+structural+and+functional+diversity+of+cadherin+at+the+adherens+junction%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Evolution: structural and functional diversity of cadherin at the adherens junction.</a> J. Cell Biol. 193 (7), 1137-1146 (2011).</li>
<li>Fernandez-Sanchez, M. E., Serman, F., Ahmadi, P., Farge, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+induction+in+embryonic+development+and+tumor+growth+integrative+cues+through+molecular+to+multicellular+interplay+and+evolutionary+perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Mechanical induction in embryonic development and tumor growth integrative cues through molecular to multicellular interplay and evolutionary perspectives.</a> Methods Cell Biol. 98, 295-321 (2010).</li>
<li>Alderton, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metastasis%3A+Epithelial+to+mesenchymal+and+back+again%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Metastasis: Epithelial to mesenchymal and back again.</a> Nat. Rev. Cancer. 13 (1), 3(2013).</li>
<li>Fabregat, I., Malfettone, A., Soukupova, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+Insights+into+the+Crossroads+between+EMT+and+Stemness+in+the+Context+of+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Med%22%5BJournal%5D)">New Insights into the Crossroads between EMT and Stemness in the Context of Cancer.</a> J. Clin. Med. 5 (3), (2016).</li>
<li>Serrano-Gomez, S. J., Maziveyi, M., Alahari, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+epithelial-mesenchymal+transition+through+epigenetic+and+post-translational+modifications%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Regulation of epithelial-mesenchymal transition through epigenetic and post-translational modifications.</a> Mol. Cancer. 15, (2016).</li>
<li>Yu, A. Q., Ding, Y., Li, C. L., Yang, Y., Yan, S. R., Li, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TALEN-induced+disruption+of+Nanog+expression+results+in+reduced+proliferation%2C+invasiveness+and+migration%2C+increased+chemosensitivity+and+reversal+of+EMT+in+HepG2+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Oncol.+Rep%22%5BJournal%5D)">TALEN-induced disruption of Nanog expression results in reduced proliferation, invasiveness and migration, increased chemosensitivity and reversal of EMT in HepG2 cells.</a> Oncol. Rep. 35 (3), 1657-1663 (2016).</li>
<li>Zheng, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epithelial-to-mesenchymal+transition+is+dispensable+for+metastasis+but+induces+chemoresistance+in+pancreatic+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Epithelial-to-mesenchymal transition is dispensable for metastasis but induces chemoresistance in pancreatic cancer.</a> Nature. 527 (7579), 525-530 (2015).</li>
<li>Kalluri, R., Weinberg, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+basics+of+epithelial-mesenchymal+transition%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">The basics of epithelial-mesenchymal transition.</a> J. Clin. Invest. 119 (6), 1420-1428 (2009).</li>
<li>Huang, J., Zhou, W., Dong, W., Watson, A. M., Hong, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed%2C+efficient%2C+and+versatile+modifications+of+the+Drosophila+genome+by+genomic+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Directed, efficient, and versatile modifications of the Drosophila genome by genomic engineering.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106 (20), 8284-8289 (2009).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Bien que nous ayons déjà rapporté une procédure similaire pour capturer des images en direct du processus de gastrulation chez Drosophilla1, la méthode que nous décrivons ici est détaillée et facile à retracer l’expression endogène de la cadhérine et est donc très utile pour le dépistage génétique des facteurs clés impliqués dans la gastrulation. Pour maximiser le succès de cette procédure d’imagerie, il est essentiel d’utiliser une lame en retrait. La pression mécanique provoque parfois la mort embry...

Gastrulation est le premier ensemble d&#39;événements morphologiquement dynamiques qui se produisent au cours du développement embryonnaire des animaux pluricellulaires tels que la drosophile 1,2. Il est intéressant de nouvelles preuves suggèrent que ce processus est régi par l&#39;interaction entre les mécanismes mécaniques et moléculaires 3. En outre, la transition épithélio - mésenchymateuse (EMT), qui est un processus crucial dans la gastrulation, est également impliquée dans des processus pathologiques humains tels que les métastases du cancer 8/4. En tant que tels, de nombreux gènes qui contrôlent la constriction apicale sont également connus pour être des facteurs clés dans l&#39;OGD observée dans les métastases du cancer 9. Ainsi, constriction apicale au moment de la gastrulation est un excellent modèle pour étudier les mécanismes de régulation précités et d&#39;améliorer notre compréhension des métastases du cancer. L&#39;avantage de cette technique est que nous pouvons observer le mouvement des cellules au moment de la gastrulation en temps réel et, par conséquent, nous seronsen mesure de dépister les gènes impliqués dans la gastrulation, ainsi que les métastases du cancer. Bien que relativement inconnu, l&#39; adhésion de cellule à cellule est pensé pour jouer un rôle central dans la constriction apicale 1. Génétique de la Drosophile est bien adapté pour les enquêtes individuelles au niveau cellulaire explorant les mécanismes moléculaires de régulation. Ce modèle nous permettra de découvrir l&#39;importance de la constriction apicale pendant la gastrulation. En outre, cette méthode peut être utilisée pour cribler des gènes impliqués dans la métastase du cancer. Capture d&#39; images en direct de la drosophile gastrulation nous a en outre permis de comprendre plus en détail les mécanismes moléculaires qui régissent le réarrangement des tissus. Ici, nous fournissons une description complète d&#39;une méthode simple pour y parvenir.

<table><tbody><tr><td>Huile halocarbure 700</td><td>Sigma</td><td>MKBH 5726</td><td></td></tr><tr><td>Graisse sous vide Silicone</td><td>Beckman</td><td>335148</td><td></td></tr><tr><td>Lamelle en verre&nbsp ;</td><td>Verre Matsunami</td><td>Epaisseur No1</td><td>24 - 36 mm</td></tr><tr><td>Embryo stariner</td><td>Corning</td><td>Corning3477</td><td></td></tr><tr><td>Bouteilles en plastique Drosophilla Stock Bottles</td><td>Hitec</td><td>MKC-100</td><td></td></tr><tr><td>DE-Cadherin knock-in mouches</td><td></td><td></td><td>REF (10)</td></tr></tbody></table>

imaging of cell forme altération et mouvement cellulaire dans drosophila gastrulation utilisation de-cadhérine reporter mouches transgéniques

Imaging of Cell Shape Alteration and Cell Movement in Drosophila Gastrulation Using DE-cadherin Reporter Transgenic Flies

Gastrulation est le premier ensemble d&#39;événements morphologiquement dynamiques qui se produisent pendant le développement embryonnaire des animaux pluricellulaires tels que la drosophile. Cette altération morphologique est également reconnu comme transition épithélio mésenchymateuse (EMT). Dysrégulation de EMT est associée à la fibrose et les métastases du cancer. Il existe des preuves émergentes que EMT est contrôlé par un certain nombre de mécanismes moléculaires. En tant que tels, de nombreux gènes clés qui contrôlent la constriction apicale sont également connus pour être des facteurs importants dans l&#39;OGD observée dans les métastases du cancer. Comme EMT pendant la drosophile gastrulation, les cellules épithéliales peuvent être amenés à changer leur forme et être reprogrammées pour rediriger le destin des cellules vers d&#39;autres types de cellules. Ici , nous fournissons une méthode d&#39;imagerie robuste de Drosophila gastrulation pour doser l&#39;initiation des mouvements cellulaires morphogénétiques et l&#39; identification du destin cellulaire au cours de ce stade de développement embryonnaire. En utilisant cette méthode, nous identifions cell réarrangement au moment de la gastrulation et de démontrer l&#39;importance de la constriction apicale pendant la gastrulation utilisant GFP marquées DE-cadhérine.

Ici, nous montrons les événements gastrulation de l'embryon de drosophile et un aperçu général de la procédure de préparation de l' embryon (Figure 1). Les membranes cellulaires sont marquées en utilisant le document DE-cadhérine :: GFP et l' imagerie en temps réel des mouvements de cellules est effectuée au moment de la gastrulation chez la drosophile (figure 2). Depuis DE-cadhérine GFP mouches nous permettent de visualiser les jonctions d'adhé...

Nous décrivons ici une procédure permettant de capturer des images en direct de la gastrulation de la drosophile. Cela nous a permis de mieux comprendre la constriction apicale impliquée dans le développement précoce et d’analyser davantage les mécanismes régissant les mouvements cellulaires lors de la modification de la structure tissulaire.

Imaging of Cell Forme Altération et Mouvement cellulaire dans Drosophila Gastrulation Utilisation DE-cadhérine Reporter mouches transgéniques

Gastrulation is the first set of morphologically dynamic events that occur during the embryonic development of multicellular animals such as Drosophila. ...

L’objectif global de cette procédure est de mieux comprendre la forme et le mouvement cellulaires lors de la gastrulation de la drosophile. Nous proposons ici une méthode de mesure robuste de la gastrulation de la drosophile, pour tester l’initiation du mouvement cellulaire morphogénétique, au cours de cette étape du développement embryonnaire. Le principal avantage de cette technique est que le réarrangement cellulaire au moment de la gastrulation peut être identifié en même temps que la constriction apicale, lors de la gastrulation.Pour commencer l’expérience, préparez un mélange de 375 millilitres d’eau. 125 millilitres de jus de pomme 100 % disponible dans le commerce. 12,5 grammes d’agar.12,5 grammes de glucose. Ensuite, faites chauffer le mélange au micro-ondes, jusqu’à ce que la gélose fonde. Et versez-le dans une boîte de culture cellulaire de trois centimètres.Conservez le mélange à 4 degrés Celsius, pour une utilisation future. Après avoir préparé l’assiette de pommes, ajoutez une fine couche de pâte de levure pétrie par-dessus, pour permettre aux mouches de pondre des œufs. Placez 25 mouches mâles et 25 mouches femelles dans une bouteille sur une assiette de pommes recouverte de levure pétrie.Enveloppez les bouteilles de bouillon en plastique de Drosophiles avec du papier d’aluminium pour inciter les mouches à pondre plus d’œufs. Gardez la bouteille à l’envers dans un incubateur pendant la nuit. Le lendemain matin, remplacez l’assiette de jus de pomme par une assiette fraîche.Enveloppez ensuite la bouteille avec du papier d’aluminium et laissez les mouches pondre des œufs pendant trois à quatre heures. Une fois que les mouches ont pondu des œufs, détachez les œufs de la plaque avec un coton-tige. Recueillez les embryons dans une passoire et lavez-les avec une solution saline tamponnée au phosphate, ou PBS.Lavez les embryons trois fois de plus avec du PBS, dans des boîtes de culture à 12 puits. Déchorionner les embryons avec 50 % d’eau de Javel, dans des boîtes de culture à 12 puits. Après le processus de déchorionation, lavez les embryons trois fois de plus avec du PBS.Transférez les embryons dans une boîte de culture cellulaire de trois centimètres contenant du PBS. Et sélectionner les embryons de cinquième stade au microscope, en fonction du niveau de transparence à leurs bords. À l’aide d’une pointe de pipette de 200 microlitres, prélevez les embryons stabilisés.Ensuite, placez deux embryons sélectionnés sur une lamelle en verre et retirez l’excès de PBS avec du papier de soie. À l’aide d’un papier de soie finement tordu, orientez les embryons côté dorsal vers le haut jusqu’à la lamelle. Fixez ensuite les embryons à la lamelle en verre avec de la graisse silicone à l’aide d’une aiguille fine.Ajoutez une petite goutte d’huile de carbone creuse 700 sur les embryons et placez la lamelle contenant les embryons à l’envers sur la lame dentelée. Laisser un peu d’espace au bas de la diapositive. Collez ensuite la lamelle sur la glissière.Enfin, examinez les embryons à l’aide d’un système d’imagerie confocale, d’un laser argon 488 et d’un objectif à immersion dans l’huile. Des images en accéléré ont été capturées à partir d’images en direct, en utilisant la GFP DE-cadhérine du mouvement cellulaire sur 500 secondes, afin d’analyser les zones apicales des cellules individuelles, de la drosophile pendant la gastrulation. À 500 secondes, la constriction apicale et l’invagination sont clairement visibles.En utilisant notre méthode. Nous pouvons mieux comprendre les mécanismes moléculaires de la gastrulation de la drosophile, ainsi que la transition épithéliale à mésenchymateuse, impliquée dans les métastases cancéreuses.

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Découvrez l'imagerie en direct de la gastrulation chez Drosophila pour étudier la constriction apicale et les mouvements cellulaires morphogénétiques. Cette méthode permet d'analyser la dynamique des cellules en développement embryonnaire.

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