Imaging of Cell Forme Altération et Mouvement cellulaire dans Drosophila Gastrulation Utilisation DE-cadhérine Reporter mouches transgéniques
29 décembre 2016
Nous décrivons ici une procédure permettant de capturer des images en direct de la gastrulation de la drosophile. Cela nous a permis de mieux comprendre la constriction apicale impliquée dans le développement précoce et d’analyser davantage les mécanismes régissant les mouvements cellulaires lors de la modification de la structure tissulaire.
L’objectif global de cette procédure est de mieux comprendre la forme et le mouvement cellulaires lors de la gastrulation de la drosophile. Nous proposons ici une méthode de mesure robuste de la gastrulation de la drosophile, pour tester l’initiation du mouvement cellulaire morphogénétique, au cours de cette étape du développement embryonnaire. Le principal avantage de cette technique est que le réarrangement cellulaire au moment de la gastrulation peut être identifié en même temps que la constriction apicale, lors de la gastrulation.
Pour commencer l’expérience, préparez un mélange de 375 millilitres d’eau. 125 millilitres de jus de pomme 100 % disponible dans le commerce. 12,5 grammes d’agar.
12,5 grammes de glucose. Ensuite, faites chauffer le mélange au micro-ondes, jusqu’à ce que la gélose fonde. Et versez-le dans une boîte de culture cellulaire de trois centimètres.
Conservez le mélange à 4 degrés Celsius, pour une utilisation future. Après avoir préparé l’assiette de pommes, ajoutez une fine couche de pâte de levure pétrie par-dessus, pour permettre aux mouches de pondre des œufs. Placez 25 mouches mâles et 25 mouches femelles dans une bouteille sur une assiette de pommes recouverte de levure pétrie.
Enveloppez les bouteilles de bouillon en plastique de Drosophiles avec du papier d’aluminium pour inciter les mouches à pondre plus d’œufs. Gardez la bouteille à l’envers dans un incubateur pendant la nuit. Le lendemain matin, remplacez l’assiette de jus de pomme par une assiette fraîche.
Enveloppez ensuite la bouteille avec du papier d’aluminium et laissez les mouches pondre des œufs pendant trois à quatre heures. Une fois que les mouches ont pondu des œufs, détachez les œufs de la plaque avec un coton-tige. Recueillez les embryons dans une passoire et lavez-les avec une solution saline tamponnée au phosphate, ou PBS.
Lavez les embryons trois fois de plus avec du PBS, dans des boîtes de culture à 12 puits. Déchorionner les embryons avec 50 % d’eau de Javel, dans des boîtes de culture à 12 puits. Après le processus de déchorionation, lavez les embryons trois fois de plus avec du PBS.
Transférez les embryons dans une boîte de culture cellulaire de trois centimètres contenant du PBS. Et sélectionner les embryons de cinquième stade au microscope, en fonction du niveau de transparence à leurs bords. À l’aide d’une pointe de pipette de 200 microlitres, prélevez les embryons stabilisés.
Ensuite, placez deux embryons sélectionnés sur une lamelle en verre et retirez l’excès de PBS avec du papier de soie. À l’aide d’un papier de soie finement tordu, orientez les embryons côté dorsal vers le haut jusqu’à la lamelle. Fixez ensuite les embryons à la lamelle en verre avec de la graisse silicone à l’aide d’une aiguille fine.
Ajoutez une petite goutte d’huile de carbone creuse 700 sur les embryons et placez la lamelle contenant les embryons à l’envers sur la lame dentelée. Laisser un peu d’espace au bas de la diapositive. Collez ensuite la lamelle sur la glissière.
Enfin, examinez les embryons à l’aide d’un système d’imagerie confocale, d’un laser argon 488 et d’un objectif à immersion dans l’huile. Des images en accéléré ont été capturées à partir d’images en direct, en utilisant la GFP DE-cadhérine du mouvement cellulaire sur 500 secondes, afin d’analyser les zones apicales des cellules individuelles, de la drosophile pendant la gastrulation. À 500 secondes, la constriction apicale et l’invagination sont clairement visibles.
En utilisant notre méthode. Nous pouvons mieux comprendre les mécanismes moléculaires de la gastrulation de la drosophile, ainsi que la transition épithéliale à mésenchymateuse, impliquée dans les métastases cancéreuses.
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Aperçu
Cet article présente une procédure permettant de capturer des images en direct de la gastrulation de Drosophila, améliorant ainsi notre compréhension de la constriction apicale durant le développement précoce. La technique permet une analyse détaillée des mouvements cellulaires impliqués dans la modification de la structure des tissus.
Composantes clés de l'étude
Domaine scientifique
- Neurosciences
- Biologie du développement
- Biologie cellulaire
Contexte
- La gastrulation de Drosophila est une phase critique du développement embryonnaire.
- La compréhension de la forme et du mouvement cellulaires est essentielle pour saisir les processus du développement.
- La constriction apicale joue un rôle important dans les mouvements morphogénétiques.
- Les techniques d'imagerie vivante peuvent fournir des informations sur les comportements cellulaires dynamiques.
Objectif de l'étude
- Améliorer la compréhension des mouvements cellulaires au cours de la gastrulation chez Drosophila.
- Développer une méthode robuste pour mesurer les mouvements cellulaires morphogénétiques.
- Identifier les réarrangements cellulaires et la constriction apicale pendant la gastrulation.
Méthodes utilisées
- Préparation d'un mélange spécifique pour l'imagerie.
- Imagerie en direct d'embryons de Drosophila pendant la gastrulation.
- Analyse des mouvements cellulaires et des changements de forme.
- Identification des événements morphogénétiques clés.
Résultats principaux
- Capture réussie d'images en direct de la gastrulation de Drosophila.
- Identification de la constriction apicale et du réarrangement cellulaire.
- Compréhension approfondie de la dynamique cellulaire durant le développement précoce.
- Méthodologie robuste pour des études futures en biologie du développement.
Conclusions
- La procédure fournit des informations précieuses sur la gastrulation de Drosophila.
- L'imagerie vivante est un outil puissant pour l'étude des mouvements cellulaires.
- Les résultats contribuent à une compréhension plus large des processus du développement.
Questions fréquemment posées
Pertinence professionnelle pour l'industrie
L'imagerie en direct de la modification de la forme cellulaire et des déplacements pendant la gastrulation de Drosophila fournit une plateforme robuste pour analyser les mécanismes moléculaires sous-jacents à la transition épithélio-mésenchymateuse (EMT), un processus impliqué dans la fibrose et la métastase cancéreuse. Cette méthode permet une visualisation haute résolution de la constriction apicale et du réarrangement cellulaire, renforçant ainsi la fiabilité prédictive de la validation précoce des cibles associées aux voies liées à l'EMT. L'approche consolide la continuité translationnelle entre la biologie du développement et les études mécanistiques pertinentes aux maladies dans la recherche et développement biopharmaceutique.
Applications stratégiques en recherche et développement en biopharmacie
Début de la découverte et validation de la cible
- Permet l'analyse de la fonction des gènes liés à l'EMT et de la dynamique des voies de signalisation dans un contexte vivant et multicellulaire.
- Contribue à l'évaluation du risque biologique en visualisant directement les événements morphogénétiques associés aux mécanismes de la maladie.
- Facilite la validation fonctionnelle des cibles pour les gènes contrôlant la constriction apicale et les transitions de destin cellulaire.
- Offre une prédictibilité renforcée pour hiérarchiser les cibles modulant l'EMT dans les portefeuilles de recherche en oncologie et en fibrose.
Développement de criblages et de tests
- Met en place un système d'imagerie validé permettant de quantifier en temps réel les mouvements cellulaires et les changements de forme.
- Permet la mesure reproductible de la constriction apicale et du réarrangement cellulaire en tant que paramètres quantitatifs d'analyse.
- Facilite la standardisation de plateformes de criblage phénotypique pour les composés modulant l'EMT.
- Prépare des systèmes biologiques robustes pour des flux de travail de criblage à haut contenu en aval.
Recherche translationnelle et préclinique
- Aligne les processus développementaux d'EMT avec des modèles pertinents pour la maladie en matière de métastase et de remodelage tissulaire.
- Fournit des éclairages mécanistiques permettant d'orienter le choix de biomarqueurs translationnels pour les études précliniques.
- Permet une progression ajustée au risque des candidats ciblant l'EMT, fondée sur des preuves phénotypiques obtenues sur cellules vivantes.
- Renforce la continuité entre la découverte et la validation préclinique dans les domaines pathologiques induits par l'EMT.
Intégration du pipeline et du flux de travail
Cette méthode d'imagerie s'intègre dans la continuité de la découverte, depuis les premiers tests d'hypothèses jusqu'au développement de modèles précliniques pour des cibles liées à l'EMT.
- Biologie de la découverte : Soutient la vérification d'hypothèses et la clarification des voies régulatrices de l'EMT et de la morphogenèse.
- Criblage : Fournit des résultats quantitatifs et reproductibles sur la forme et le mouvement cellulaires, permettant la mise au point de tests.
- Analytique : Fournit des données d'imagerie à haut contenu pour l'analyse comparative de perturbations génétiques ou pharmacologiques.
- Recherche translationnelle : Établit un lien entre les mécanismes du développement et les modèles d'EMT pertinents pour les maladies, afin d'aligner les biomarqueurs.
- Réutilisation en entreprise : Offre une plateforme d'imagerie réutilisable, adaptable à diverses études sur l'EMT et la morphogenèse.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Renforce la confiance prédictive et la détection mécanistique des risques pour les programmes de découverte ciblant l'EMT.
- Valeur opérationnelle : Fournit des protocoles d'imagerie standardisés et évolutifs assurant une reproductibilité entre projets.
- Valeur stratégique : Éclaire les décisions de poursuite ou d'abandon et réduit les risques biologiques en phase avancée dans les indications liées à l'EMT.
- Impact sur le portefeuille : Permet une priorisation ajustée au risque des actifs modulant l'EMT dans différents domaines thérapeutiques.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Requiert une expertise en imagerie vivante, en microscopie confocale et en embryologie de Drosophila.
- Nécessite un accès à des instruments d'imagerie avancés et à des logiciels analytiques pour l'analyse en time-lapse.
- Implique une standardisation interéquipes des stades embryonnaires et des protocoles d'imagerie afin d'assurer la reproductibilité.
- L'adaptation à d'autres systèmes modèles peut exiger une optimisation des constructions rapporteuses et des conditions d'imagerie.
- Les limitations pratiques incluent des contraintes en termes de débit et la nécessité d'une manipulation précise des embryons.
