Name: Dun produit naturel à son cluster Gène biosynthétique: Une démonstration utilisant Polyketomycin de Streptomyces diastatochromogenes Tü6028 (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 8 s
Description: Découvrez comment identifier et purifier un produit naturel antibiotique et déterminer son cluster de gènes biosynthétiques par exploration génomique chez Streptomyces diastatochromogenes.

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S. Zhang est financé par le China Scholarship Council. Les auteurs sont très reconnaissants envers les anciennes personnes qui ont travaillé sur le projet de polykétomycine dans ce laboratoire et le professeur Hans-Peter Fiedler, de l’Université de Tübingen, pour avoir fourni le producteur de polykétomycine. La recherche a été soutenue par la DFG (RTG 1976).

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</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Dans ce laboratoire une bibliothèque de cosmide génomique de Streptomyces diastatochromogenes a été généré et projeté il y a plusieurs années, ce qui entraîne l&#39;identification du groupe de gènes polyketomycin à travers un processus extrêmement fastidieux. Caractérisation des gènes uniques sont possibles en utilisant des délétions de gènes cibles et l&#39; analyse des mutants résultant 12. Récemment, un projet de séquençage du génome de S. diastatochromogenes a été obtenue permettant l&#39;identification rapide du groupe de gènes de biosynthèse polyketomycin. Nous pourrions facilement détecter les gènes de biosynthèse, bien que le projet de séquençage du génome contient encore beaucoup de contigs. Le procédé décrit peut être réalisé en quelques mois. Cependant, le procédé comprend plusieurs étapes. étapes simples peuvent échouer à plusieurs reprises, ce qui empêche la progression vers les étapes suivantes: Le genre Streptomyces est connu pour sa capacité à produire des composés bioactifs. Alors qu&#39;ils transportent souvent plus de 20 biosclusters de gènes ynthetic, habituellement un ou deux composés sont produits dans des conditions de laboratoire. L&#39;application de l&#39;approche OSMAC (culture d&#39;une souche dans des conditions différentes) pour réveiller groupes de gènes silencieux peut parfois ne pas être suffisant. La manipulation génétique des gènes de régulation, tels que les gènes régulateurs pléiotropiques ADPA 44 et bldA 45,46, est aussi une méthode efficace pour activer la production d&#39;autres métabolites secondaires. Pour l&#39;élucidation de la structure du composé, par exemple , par analyse RMN, habituellement plus de 2 mg de composé purifié est nécessaire. Par conséquent, la fermentation de plus de 10 litres de la culture est souvent nécessaire. Sans un fermenteur qui est capable de maintenir l&#39;oxygène, du pH et de la température, il peut être difficile dans un petit laboratoire pour traiter cette quantité de la culture et l&#39;extraction ultérieure. Au cours de la purification, le composé peut être modifié en raison de l&#39;oxydation, le rayonnement ou la température.En outre, plus les étapes de purification sont utilisées, plus le risque de dégradation. Lors de l&#39;analyse de la structure du produit naturel, et les grappes dans le génome, il est parfois pas facile d&#39;identifier le cluster approprié. Tout d&#39;abord, s&#39;il y a seulement un projet de séquençage du génome une partie de la grappe peut être manquante. D&#39;autre part, tous les gènes qui sont nécessaires pour la biosynthèse ne sont pas dans le cluster. En troisième lieu, un cluster est parfois divisé en deux parties séparées l&#39;une de l&#39;autre par plusieurs kilobases. Quatrièmement, il peut être difficile de décider lequel est le groupe de gènes approprié. Dans le cas d&#39;un grand type PKS systèmes NRPS I ou, où il est possible de calculer le nombre d&#39;unités d&#39;extension en fonction du nombre de modules, ou même d&#39;identifier les unités d&#39;extension simples par analyse des domaines de la sélection, il se transforme facilement. Cependant, dans le cas d&#39;enzymes de travailler itérativement la prédiction des composés synthétisés est souvent pas possible, surtout si le straen a plus de 40 groupes de gènes. Cinquièmement, la nature est très complexe et plein de composés encore inconnus. Souvent, la biosynthèse est un mélange de différentes voies. Si le nouveau composé est pas encore identifié, ou non liés à un autre composé, il peut être difficile d&#39;identifier le cluster, de proposer un modèle de biosynthèse et pour le prouver. Une fois que le cluster est identifié, la technique de croisement unique est une bonne et rapide méthode pour vérifier l&#39;hypothèse. La PCR, le clonage dans un vecteur suicide, la conjugaison, la sélection des clones positifs, et le dosage de la production sont les seules étapes requises. Un inconvénient de cette technique est que l&#39;intégration du vecteur dans le chromosome est instable en raison d&#39;autres événements de recombinaison. Par conséquent, afin d&#39;analyser davantage les gènes individuels, des deletions de gènes précises sont nécessaires. En outre , il peut être difficile de manipuler des souches de Streptomyces sur le plan génétique. La procédure décrite peut être affectée to tout autre composé produit par une souche de Streptomyces ou d&#39; un autre micro - organisme. La connaissance d&#39;un groupe de gènes de biosynthèse et son composé synthétisé nous donne de nouvelles possibilités pour modifier déjà les molécules existantes dans le but de les améliorer pour la lutte contre les agents pathogènes multirésistantes.

Produits naturels des plantes et des micro-organismes ont toujours été une source importante pour le développement de médicaments cliniques et de recherche. Le premier Pénicilline antibiotique a été découvert en 1928 à partir d&#39; un champignon par Alexander Fleming 1. De nos jours, beaucoup plus de produits naturels sont utilisés dans le traitement clinique. Un genre connu pour sa capacité de produire divers types de métabolites secondaires avec différentes activités biologiques est Streptomyces. Streptomyces sont des bactéries Gram-positives et appartiennent à la classe des Actinobactéries et l&#39;ordre actinomycetales. Près des deux tiers des antibiotiques utilisés en clinique sont dérivés de actinomycetales, principalement à partir de Streptomyces, comme l&#39; amphotéricine 2, 3 ou daptomycine tétracycline 4. Deux prix Nobel ont été décernés dans le domaine de Streptomyces recherche sur les antibiotiques. Le premier est allé à Selman Waksman pour la découverte de la streptomycine, le premier d&#39;untibiotic efficace contre la tuberculose. 5 En 2015, dans le cadre du Prix Nobel de physiologie et de médecine, la découverte de l&#39; avermectine de S. avermitilis a été attribué aussi bien. Avermectine est utilisé pour le traitement des maladies parasitaires 6,7. L&#39;approche traditionnelle de la découverte de produits naturels tels que des micro - organismes Streptomyces implique généralement la culture de la souche dans des conditions de croissance différentes, ainsi que l&#39; extraction et l&#39; analyse des métabolites secondaires. Des essais de bioactivité (par exemple , des dosages pour l&#39; activité anti - bactérienne et anti - cancéreuse) sont réalisés pour détecter l&#39;activité du composé. Enfin, le composé d&#39;intérêt est isolée et la structure chimique est élucidée. Les structures des produits naturels sont souvent composées de fragments individuels qui se forment des molécules complexes. Il y a quelques, mais limitées, les grandes voies de biosynthèse conduisant à la construction de blocks, qui sont utilisés pour la biosynthèse des produits naturels. Les principales voies de biosynthèse sont les voies de polykétides, les voies menant à des terpénoïdes et des alcaloïdes, des voies en utilisant des acides aminés, et les voies conduisant à des fragments de sucre. Chaque voie est caractérisée par un ensemble d&#39;enzymes spécifiques 8. Sur la base de la structure du composé, ces enzymes biosynthétiques peuvent être prédites. De nos jours, l&#39;analyse structurale détaillée d&#39;un composé en combinaison avec le séquençage de la prochaine génération et l&#39;analyse bioinformatique peut aider à identifier le groupe de gènes de biosynthèse responsable. Les informations de cluster ouvre de nouvelles voies pour de nouvelles recherches sur les produits naturels. Cela comprend l&#39;expression hétérologue pour augmenter le rendement du produit naturel, la modification du composé visé par délétion du gène ou de la modification et de la biosynthèse combinatoire avec des gènes provenant d&#39;autres voies. On a isolé Polyketomycin indépendamment dans le bouillon de culture dedeux souches, Streptomyces sp. MK277 AF1 9 et 10 Tü6028 Streptomyces. La structure a été élucidée par analyse par RMN et aux rayons X. Polyketomycin se compose d&#39;un decaketid tétracyclique et un acide salicylique de diméthyle, lié par les deux fragments désoxyose ß-D-amicetose et α-L-axenose. Il affiche cytotoxique et une activité antibiotique, même contre les souches multirésistantes Gram-positives telles que le SARM 11. Une bibliothèque de cosmide génomique de S. Tü6028 a été généré et projeté il y a plusieurs années. Utilisation de gène spécifique des sondes du groupe de gènes polyketomycin avec une taille de 52,2 kb, contenant 41 gènes, a été identifié après plusieurs mois de travail intense 12. Récemment, un projet de séquençage du génome de S. diastatochromogenes a été obtenu conduisant à l&#39;identification rapide du groupe de gènes de biosynthèse polyketomycin. Dans cette vue d&#39;ensemble, une méthode aidant à identifier un produit naturel et élucider son groupe de gènes de biosynthèse sera décrit, en utilisant polyketomycin comme un exemple. Ici , nous expliquons les étapes simples qui mènent à partir d&#39; un produit naturel à son groupe de gènes de biosynthèse montré pour polyketomycin produit par Streptomyces Tü6028. Le protocole comprend l&#39;identification et la purification d&#39;un produit naturel dont les propriétés antibiotiques. En outre l&#39;analyse structurelle et la comparaison avec les résultats du génome plomb minier à l&#39;identification du groupe de gènes de biosynthèse. Cette procédure peut être appliquée à tout autre composé dérivé d&#39;une souche de Streptomyces , ou tout autre micro - organisme.

<table><tbody><tr><td>agar</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Allemagne</td><td>5210.4</td><td></td></tr><tr><td>agarose</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Allemagne</td><td>6352.4</td><td></td></tr><tr><td>D-mannitol&nbsp ;</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Allemagne</td><td>4175.1</td><td></td></tr><tr><td>glucose&nbsp ;</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Allemagne</td><td>6780.1</td><td></td></tr><tr><td>LB&nbsp ;</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Allemagne</td> Extrait de malt <td>X964.3</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Allemagne</td><td>X976.2</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Allemagne</td><td>2189.1</td><td></td></tr><tr><td>Peptone&nbsp ;</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Allemagne</td><td></td><td></td></tr><tr><td>farine de soja</td><td>W.Schoenemberger GmbH, Magstadt, Allemagne</td><td></td><td>Bouillon</td></tr><tr><td>de soja tryptique</td> Hensec-Vollsoja <td>Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Allemagne</td><td>X938.3</td><td>Extrait de levure Caso-Bouillon</td></tr><tr><td>&nbsp ;</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Allemagne</td><td>2363.2</td><td></td></tr><tr><td><Solvants></forts></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Acide acétique</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Allemagne</td><td>3738.5</td><td></td></tr><tr><td>Acétone&nbsp ;</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Allemagne</td><td>9372.2</td><td></td></tr><tr><td>Acétonitrile</td><td>Avantor Performance Materials B.V., Deventer, Pays-Bas</td><td>JT-9012-03</td><td></td></tr><tr><td>Dichlorode&nbsp ;</td><td>Fisher Scientific GmbH, Schwerte, Allemagne</td><td>1530754</td><td></td></tr><tr><td>DMSO (sulfoxyde de diméthyle)</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Allemagne</td><td>4720.1</td><td></td></tr><tr><td>DMSO-d6 (Diméthylsulfoxyde-d6) 99,9 % d’atomes D</td><td>ARMAR Chemicals, D&ouml ; ttingen, Suisse</td><td>15200.204</td><td></td></tr><tr><td>Acétate d’éthyle</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Allemagne</td><td>6784.4</td><td></td></tr><tr><td>Acide chlorhydrique</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Allemagne</td><td>6331.4</td><td></td></tr><tr><td>Méthanol</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Allemagne</td><td>7342.1</td><td></td></tr><tr><td>Enzymes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>enzymes de restriction</td><td>New England Biolabs GmbH, Francfort-sur-le-Main, Allemagne</td><td></td><td></td></tr><tr><td>polymérase&nbsp ;</td><td>New England Biolabs GmbH, Francfort-sur-le-Main, Allemagne</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ADN polymérase I Grand fragment (Klenow)</td><td>Promega GmbH, Mannheim, Allemagne</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Antibiotics</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>apramycin</td><td>AppliChem GmbH, Darmstadt, Allemagne&nbsp ;</td><td>A7682.0005</td><td></td></tr><tr><td>fosfomycine</td><td>Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, Allemagne</td><td>P5396-50G</td><td></td></tr><tr><td>kanamycin</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Allemagne</td><td>T832.2</td><td></td></tr><tr><td>Plasmid/Vectors</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>pKC1132</td><td>Bierman et al. 1992</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Primer& nbsp ; </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>pokPI_for</td><td>TGATGGTGCGCCGCTGGCCATGG</td><td>Amorce pour amplifier un fragment contenant le gène</td><td></td>pokPI</tr><tr><td>pokPI_rev</td><td>AGCGTTCACTGTTCCGCCCGAC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Souches bactériennes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bacillus subtilis COHN ATCC6051</td><td></td><td>Souche test à Gram positif&nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>Escherichia coli ET12567 pUZ8002&nbsp ;</td><td>MacNeil et al. 1992</td><td>souche pour conjugaison</td><td></td></tr><tr><td>Escherichia coli XL1 Blue</td><td>Agilient Technologies, Santa Clara,</td><td>États-Unis Souche test à Gram négatif + hôte clonage&nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>Streptomyces diastatochromogenes T&uuml ; 6028</td><td>Paululat et al., 1999</td> Producteur <td></td>de <td>polykétomycine</td></tr><tr><td>Services en ligne</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>antismash (Antibiotics and Secondary Metabolite Analysis Shell)</td><td>http://antismash.secondarymetabolites.org/</td> <td>Détection du groupe</td><td></td>de gènes du métabolite secondaire</tr><tr><td>BLAST (Basic Local Alignment Search Tool)</td><td>http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi</td><td>trouve des régions de similitude entre les séquences</td><td></td>biologiques</tr><tr><td>GenDB</td><td>https://www.uni-giessen.de/fbz/fb08/Inst/bioinformatik/software/gendb</td><td>Annotation des ORFs&nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>MiBIG (Minimum Information about a Biosynthetic Gene Cluster)</td><td>http://mibig.secondarymetabolites.org/</td> <td>Base de données des groupes de gènes biosynthétiques</td><td></td></tr><tr><td>NaPDoS</td><td>http://napdos.ucsd.edu/</td> <td>Détection du groupe</td><td></td>de gènes métabolites séconaires</tr><tr><td>NCBI Procaryotic Genome Annotation Pipeline</td><td>http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/annotation_prok/</td> <td>Annotation of ORFs&nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>NRPSpredictor</td><td>http://nrps.informatik.uni-tuebingen.de/</td> <td>Détection des domaines</td><td></td>NRPS</tr><tr><td>Prokka (annotation rapide du génome procaryote)</td><td>http://www.vicbioinformatics.com/software.prokka.shtml</td><td>Annotation des ORFs&nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>RAST (annotation rapide à l’aide de la technologie des sous-systèmes)</td><td>http://rast.nmpdr.org/</td> <td>Annotation des ORF&nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>Autres programmes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Chem Station Rev. A.09.03</td><td>Agilent Technologies, Waldbronn, Allemagne</td><td>Programme de manutention pour HPLC&nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>Clone Manager Suite 7</td><td>Logiciel scientifique et éducatif, Cary, États-Unis</td><td>Conception d’expériences de clonage&nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>Newbler v2.8</td><td>Roche Diagnostics</td><td>Alignement des lectures de séquençage <Machines>fortes</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp ; </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Centrifugeuse Avanti J-6000, Rotor JA-10</td><td>Beckman Coulter GmbH, Krefeld, Allemagne</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HPLC/MS</td><td>Agilent Technologies, Waldbronn, Allemagne</td><td></td><td></td></tr><tr><td>_Autosampler : G1313A</td><td>Agilent Technologies, Waldbronn, Allemagne</td><td></td><td></td></tr><tr><td>_Pre-colonne : XBridge C18 (20 mm x 4,6 mm ; Taille des particules : 3,5 & micro ; m)</td><td>Agilent Technologies, Waldbronn, Allemagne</td><td></td><td></td></tr><tr><td>_Column :Xbridge C18 (100 mm & fois ; 4,6 mm ; Taille des particules : 3,5 &mu ; m)</td><td>Agilent Technologies, Waldbronn, Allemagne</td><td></td><td></td></tr><tr><td>_semi-prep Pre-Column : Zorbax B-C18 (9,4 x 150 mm ; Taille des particules : 5 & micro ; m)</td><td>Agilent Technologies, Waldbronn, Allemagne</td><td></td><td></td></tr><tr><td>_semi-prep Colonne : Zorbax B-C18 (9,4 x 20 mm ; Taille des particules : 5 & micro ; m)</td><td>Agilent Technologies, Waldbronn, Allemagne</td><td></td><td></td></tr><tr><td>_Degasser : G1322A&nbsp ;</td><td>Agilent Technologies, Waldbronn, Allemagne</td><td></td><td></td></tr><tr><td>_Quarternary pompe : G1311A</td><td>Agilent Technologies, Waldbronn, Allemagne</td><td></td><td></td></tr><tr><td>_Diode détecteur matriciel (DAD) G1315B (&lambda ; = 254 nm et 400 nm)</td><td>Agilent Technologies, Waldbronn, Allemagne</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>_Quadrupole détecteur de masse (MSD) G1946D(2-3000 m/z)</td><td>Agilent Technologies, Waldbronn, Allemagne</td><td></td><td></td></tr><tr><td>évaporateur</td><td></td><td></td><td></td> rotatif</tr><tr><td>_heating bain Hei-VAP Value/G3</td><td>Heidolph Instruments GmbH & Co.KG, Schwabach, Allemagne</td><td></td><td></td></tr><tr><td>_vacuum système de pompe SC 920 G</td><td>KNF&nbsp ; Stratégies mondiales&nbsp ; AG, Sursee, Suisse</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Autres matériaux</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sephadex LH20</td><td>GE Healthcare,&nbsp ;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Chromafil PVDF-45/15MS (taille des pores 0,45 & micro ; m; filtre & Oslash ; 15 mm)</td><td>MACHEREY-NAGEL GmbH & Co. KG, D&uuml ; ren, Allemagne</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Colonne SPE Oasis HLB 20 35 cc (6g)</td><td>Waters GmbH, Eschborn, Allemagne&nbsp ;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>E. coli </td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Allemagne</td><td></td><td>Médium : LB, Composition : LB, Quantité à 1 L H2O : 20 g</td></tr><tr><td>Bacillus&nbsp ; </td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Allemagne</td><td></td><td>Support : LB, Composition : LB, Quantité à 1 L H2O : 20 g</td></tr><tr><td>Streptomyces sp.</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Allemagne</td><td></td><td>Médium : TSB, Composition : CASO Boullion, Quantité à 1 L H2O : 30 g</td></tr><tr><td>de champignon</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Allemagne</td><td></td><td>Milieu : YPD, Composition : Extrait de levure, Quantité à 1 L H2O : 10 g</td></tr><tr><td>de champignon</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Allemagne</td><td></td><td>Médium : YPD, Composition : Peptone, Quantité à 1 L H2O : 20 g</td></tr><tr><td>de champignon</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Allemagne</td><td></td><td>Milieu : YPD, Composition : Glucose, Quantité à 1 L H2O : 20 g</td></tr><tr><td colspan="4">pour les plaques de gélopour les plaques de gélose ajouter 2 % de gélose</td></tr></tbody></table>

d'un produit naturel à son cluster gène biosynthétique: une démonstration utilisant polyketomycin de streptomyces diastatochromogenes tü6028

From a Natural Product to Its Biosynthetic Gene Cluster: A Demonstration Using Polyketomycin from Streptomyces diastatochromogenes T&#252;6028

Souches de Streptomyces sont connus pour leur capacité à produire un grand nombre de composés différents avec divers bioactivité. La culture dans des conditions différentes conduit souvent à la production de nouveaux composés. Par conséquent, les cultures des souches de production sont extraites avec de l&#39;acétate d&#39;éthyle et les extraits bruts sont analysés par HPLC. En outre, les extraits sont testés quant à leur activité biologique par différents dosages. Pour la détermination de la structure du composé d&#39;intérêt est purifié par une combinaison de différentes méthodes de chromatographie. Le séquençage du génome couplé à l&#39;extraction du génome permet l&#39;identification d&#39;un groupe de gènes de biosynthèse de produits naturels en utilisant des programmes informatiques différents. Pour confirmer que le groupe de gènes correct a été identifié, des expériences d&#39;inactivation de gènes doivent être effectuées. Les mutants résultants sont analysés pour la production du produit naturel en particulier. Une fois que le groupe de gènes correct a été inactivé, lasouche devrait échouer pour produire le composé. Le flux de travail est montré pour la polyketomycin composé antibactérien produit par Streptomyces Tü6028. Il y a une dizaine d&#39;années, lorsque le séquençage du génome était encore très cher, le clonage et l&#39;identification d&#39;un groupe de gènes est un processus très chronophage. séquençage du génome rapide combiné avec l&#39;extraction du génome accélère le procès de l&#39;identification de cluster et ouvre de nouvelles façons d&#39;explorer la biosynthèse et de générer de nouveaux produits naturels par des méthodes génétiques. Le protocole décrit dans le présent document peut être attribué à un autre composé dérivé d&#39;une souche de Streptomyces ou d&#39; un autre micro - organisme.

Dans cet aperçu, nous décrivons les étapes simples de l'identification d'un antibiotique conduisant à son groupe de gènes de biosynthèse. Il y a plusieurs années nous avons cloné une bibliothèque de cosmides, les emballés dans des phages, transduction E. cellules hôtes coli, et a dû examiner des milliers de colonies pour identifier les clones ayant des régions qui se chevauchent de grappe polyketomycin. Le séquençage des cosmides a également été un processus difficile et coûteux 12. Afin de mener d' autres études sur la souche nous avons séquencé la totalité du génome de Streptomyces Tü6028. Avec le projet de séquençage du génome nous avons facilement identifié le groupe de gènes de biosynthèse de polyketomycin et d'autres groupes codant pour des composés prometteurs. La figure 7 compare la méthode "ancienne" pour identifier le cluster de biosynthèse par clonage d'une banque de cosmides et de dépistage élaboratif etla «nouvelle» méthode par séquençage du génome entier à l'exploitation du génome ultérieur sur une échelle de temps rugueux. Les nouvelles technologies de séquençage et de nouveaux programmes d'exploration de génome d'accélérer l'ensemble du processus. <img alt="Figure 7" src="/files/ftp_upload/54952/54952fig7.jpg"> Figure 7: Comparaison de la «vieille» et «nouvelle» méthode d'attribution d' un gène biosynthétique Cluster. La méthode "ancienne" comprend le clonage d'une banque de cosmides avec la sélection des clones positifs et le séquençage du cosmide (s) respectif (ci-dessus); La méthode «nouvelle» comprend le séquençage du génome entier et -mining pour identifier tous les groupes de gènes de métabolites secondaires situés sur le génome de la souche (ci-dessous). Durée des étapes simples sont présentées sur une échelle de temps rugueux. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54952/54952fig7large.jpg" target="_blank">S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a>

Nous présentons ici un protocole détaillé de (A) l&#39;identification d&#39;un produit naturel avec une activité antibiotique, (B) la purification du composé, (C) le premier modèle de sa biosynthèse, (D) le séquençage du génome / -mining et ( E) la vérification du groupe de gènes de biosynthèse.

D'un produit naturel à son cluster Gène biosynthétique: Une démonstration utilisant Polyketomycin de Streptomyces diastatochromogenes Tü6028

Streptomyces strains are known for their capability to produce a lot of different compounds with various bioactivities. Cultivation under different ...

L’objectif global de ce flux de travail est d’identifier un produit naturel ayant une activité antibiotique, de purifier le composé et de déterminer son groupe de gènes biosynthétiques grâce à l’exploitation minière du génome. De nouveaux antibiotiques sont nécessaires de toute urgence en raison du nombre croissant d’agents pathogènes résistants aux mytos. Les souches de streptomycine sont des producteurs d’antibiotiques connus et nous devrions utiliser ce potentiel.Avec la connaissance d’un groupe hétérogène d’antibiotiques biocine, nous pouvons proposer une voie de biosynthèse et modifier davantage le composé. Ces procédures vous aident à identifier le groupe de gènes correspondant. La radio est mise en évidence avec la souche de streptomycine.Mais il peut être appliqué à d’autres micro-organismes. Pour commencer, lancez la souche de streptomycine dans différentes conditions, comme différents milieux ou temps d’incubation. Récoltez les cellules par centrifugation pendant 10 minutes à 3 000 fois G.Et transférez les surnageants dans un nouveau flacon.Pour l’extraction du composé du bouillon de culture, ajuster le surnageant à PH4 par l’ajout d’une molaire d’acide chlorhydrique. Et transférez-le dans un entonnoir de séparation. Ajoutez ensuite le même volume d’acétate d’étal et secouez le mélange pendant 30 minutes à 180 tr/min.Ensuite, prélevez la phase d’acétate éthylène et transférez-la dans une fiole à fond rond à travers un papier filtre. Évaporer l’acétate d’éthylène par évaporation rotative à 40 degrés Celsius et 240 bars. Pour l’extraction du composé à partir du mycélium, remettez les cellules en suspension dans un double volume d’acétone.Agitez les cellules dans un tube à 180 tr/min pendant 30 minutes. Filtrez le liquide à travers du papier filtre. Ensuite, évaporez l’acétone à l’aide d’un évaporateur rotatif à 40 degrés Celsius et 550 bars.Dissoudre l’extrait séché dans 20 millilitres d’acétate d’eau et continuer l’extraction des composés comme précédemment. Dissoudre ensuite les extraits secs dans du méthanol. Filtrez-les à travers un filtre de la taille des pores de 0,45 micromètre.Et transférez les extraits dans des flacons HPLC. Injectez les échantillons dans la machine HPLC et analysez l’extrait brut comme décrit dans le protocole texte. Pour identifier l’activité antibiotique à l’aide de l’essai de diffusion sur disque, répartir diverses précultures de souches d’essai sur des plaques de gélose respectives.Ensuite, pipetez 20 à 50 microlitres de l’extrait dissous sur des disques en papier stériles. Préparez également un témoin négatif avec un solvant et un témoin positif avec un antibiotique approprié. Après avoir séché les disques de papier pendant 30 minutes, transférez-les sur les plaques avec les cultures d’essai.Incuber les plaques de déformation d’essai dans des conditions adéquates. Déterminez ensuite les zones d’inhibition apparentes pour chaque souche d’essai. S’il existe une zone d’inhibition, purifier le composé responsable de la culture à grande échelle et élucider la structure comme décrit dans le protocole de texte.Pendant la purification, un composé peut changer en raison de l’oxydation, du rayonnement ou de la température. Plus il y a de pastilles de purification utilisées, plus le risque de dégradation est élevé. Jusqu’à cinq milligrammes de composé, ce qui est le minimum nécessaire pour l’analyse du génogène commun.Analysez la structure chimique du composé isolé et prédisez les enzymes qui peuvent être impliquées dans sa biosynthèse. Ici, la polycidomycine est utilisée comme exemple pour démontrer la procédure. Tout d’abord, subdivisez la structure en moitiés simples évidentes.La polycidomycine est composée d’un groupement tétracyclique, de deux monosaccharides et d’acide diméthylsalicylique. Ensuite, prédire les gènes présumés dans le groupe d’où les fractions peuvent être dérivées. Ici, la fraction tétracyclique pourrait être dérivée d’une synphase de type poly key de type II.Alors que la fraction diméthylsalicylique peut être dérivée d’une synphase itérative de type poly clé de type I.De même, les deux fractions de sucres, qui sont 6 sucres désoxy, pourraient être synthétisées à partir de glucose impliquant une dNDP-glucose-4, 6-déshydratase pendant la biosynthèse et attachées par deux glycosyltransférases.Séquencez l’ADN génomique à l’aide de technologies de séquençage de nouvelle génération. Pour l’identification du métabolite secondaire, exécutez des programmes tels que l’antiSMASH, le Natural Product Domain Seeker ou le NRPS predicter. Soumettez la séquence du génome au format fasta.Après plusieurs heures, les résultats sont envoyés via un lien par e-mail. Dans l’ébauche du génome de streptimyoces diastatochromogenes, antiSMASH a identifié 22 groupes de gènes présumés. Analysez les groupes de gènes présumés pour leurs voies enzymatiques.Recherchez des grappes contenant des gènes qui pourraient être impliqués dans la synthèse de votre composé. Dans les astatochromogènes, le groupe II contient des gènes de synphase de type II poly-clés, trois gènes pour une PKS itérative de type I, et le gène dTDP-glucose-4, 6-déshydratase et deux glycosyltransférases codant pour des gènes. Pour comparer le groupe avec d’autres groupes, antiSMASH fournit un lien vers la base de données MIBiG qui comprend des annotations et des informations supplémentaires sur des groupes de gènes biosynthétiques similaires et leurs produits.Comparez la structure du composé avec d’autres composés connus pour vérifier les similitudes. L’identification du groupe de gènes biosynthétiques responsable peut être simple. Mais dans certains cas, cela peut aussi être très difficile.Pour vérifier que le groupe de gènes proposé est responsable de la biosynthèse du composé, recherchez un gène au sein du groupe et codez pour une enzyme ayant une fonction centrale pour la biosynthèse. Pour confirmer l’amas de gènes de la polycidomycine, le gène pokPI un codant pour la cétosynthase alpha de la PKS de type II a été sélectionné et inactivé par une délétion hors cadre. Après clonage et conjugaison de la construction de croisement unique comme décrit dans le protocole texte.Vérifiez les mutants à croisement unique. Pour ce faire, inoculez 100 millilitres de milieu de production avec des clones uniques contenant l’interruption génique vérifiée. Incuber les cellules dans les mêmes conditions que celles utilisées précédemment.Procédez à l’extraction de l’extrait brut comme indiqué précédemment. Enfin, vérifiez la production par HPLC MS Analysis comme décrit dans le protocole texte. Le pic correspondant dans le chromatogramme HPLC et la masse du composé ne doivent pas être détectables.Le groupe de gènes biosynthétiques de la polycidomycine a été vérifié par une expérience de délétion de gènes. On voit ici le chromatogramme HPLC de l’extrait brut du type sauvage S. Diastatochromogenes et de la souche mutante avec le gène interrupte pokPI one. La souche mutante ne produit plus de polycidomycine.Une fois maîtrisée, cette procédure peut être réalisée en quelques mois. Il y a de nombreuses années, l’identification d’un groupe de gènes biosynthétiques prenait beaucoup de temps. Aujourd’hui, le séquençage et l’exploitation minière du génome accélèrent fortement ce processus.Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de passer d’un nouveau composé à son groupe de gènes biosynthétiques. Nous avons montré l’ensemble de la procédure en une seule étape afin que vous puissiez maintenant les attribuer à n’importe quel autre producteur de produits naturels. La connaissance du groupe de gènes et de ses composés synthétisés nous donne un aperçu des voies de biosynthèse.Cela nous donne d’autres opportunités de modifier des molécules déjà existantes afin de les améliorer.

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D'un produit naturel à son cluster Gène biosynthétique: Une démonstration utilisant Polyketomycin de Streptomyces diastatochromogenes Tü6028

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