2.13: Réalisation de la chromatographie sur couche mince 1D

1. Plaques TLC

1. Les adsorbants courants pour la CCM sont le gel de silice, l’alumine et la cellulose. Les plaques TLC sont disponibles dans le commerce avec une variété de propriétés. Choisissez une plaque TLC et coupez-la à une taille appropriée (environ 5 cm x 5 cm sont suffisants pour la plupart des applications). Pour les plaques TLC à dos de verre, marquez le verre à l’aide d’une règle et d’un coupe-verre, puis brisez-le soigneusement le long de la ligne.

2. Repérage

1. Dissoudre l’échantillon dans un solvant approprié pour obtenir une solution à environ 1 %. Si possible, le solvant doit être apolaire. Les fractions de chromatographie sur colonne et d’autres solutions diluées peuvent être utilisées sans dilution si le soluté est présent à une concentration comprise entre 0,2 % et 2,0 %.
2. Marquez la ligne de base avec un crayon à environ 1,0 cm du bas de la plaque. Positionnez les taches à au moins 1,0 cm du bord de la plaque et étiquetez-les de manière appropriée.
3. Les taches peuvent être appliquées à l’aide d’un capillaire en verre. Pour repérer la plaque TLC, trempez le capillaire dans la solution pour aspirer une petite quantité de liquide. Touchez doucement l’embout à l’endroit souhaité sur la plaque TLC et retirez-le immédiatement.
4. Vous pouvez également appliquer des taches à l’aide d’une seringue d’un microlitre en délivrant environ 1 μL de solution pour chaque application.
5. Des taches peuvent être appliquées successivement à chaque endroit, en prenant soin de ne pas perturber la surface de l’adsorbant avec le détachant. Laissez le solvant sécher entre les applications.

3. Choisir un solvant en développement

1. Il est préférable d’utiliser le moins de solvant polaire possible pour une bonne séparation. Les solvants courants pour la CCM comprennent l’hexane, l’acétate d’éthyle, le dichlorométhane et le méthanol (Tableau 1).
2. Un moyen pratique de trouver une phase mobile appropriée est de repérer la plaque CCM avec un échantillon. Appliquez suffisamment de solvant directement sur l’endroit pour former un cercle de solvant de 1 à 2 cm de diamètre. Marquez la circonférence du cercle. Lors de la visualisation, un solvant approprié montrera des anneaux bien séparés, l’anneau le plus externe étant à environ 50 % de la distance entre le centre et le front du solvant.
3. Il peut être nécessaire d’ajuster la polarité de la phase mobile en choisissant deux solvants miscibles et en les testant dans des proportions variables. Des exemples de mélanges courants sont les hexanes avec l’acétate d’éthyle et le dichlorométhane avec le méthanol.

4. Développement

1. Placez la plaque TLC tachetée dans une chambre de développement contenant le solvant de développement approprié. La ligne de solvant doit être inférieure à la ligne de base indiquée sur la plaque de CCM.
2. La chambre de développement peut être un bocal avec un couvercle, ou un bécher recouvert de papier d’aluminium ou d’un film plastique. Utilisez le plus petit récipient disponible qui peut accueillir la plaque TLC.
3. Ne laissez pas le solvant atteindre le bord supérieur de la plaque. Lorsque la face du solvant (la limite où se termine la partie humide de l’adsorbant) se trouve à 5 à 10 mm du haut de la plaque, retirez la plaque CCM de la chambre de développement et marquez la face du solvant avec un crayon avant que le solvant ne sèche.

5. Visualisation

1. Les taches colorées peuvent être visualisées immédiatement et marquées au crayon. Souvent, les taches ne sont pas visibles et doivent donc être visualisées par une autre méthode.
2. Souvent, l’adsorbant TLC contient un indicateur fluorescent. Les taches peuvent être visualisées à l’aide d’une lampe ultraviolette (UV) portative. Les composés qui éteignent la fluorescence apparaîtront sous forme de taches sombres lorsque la plaque est irradiée par une lumière UV à ondes courtes (254 nm). Les composés fluorescents produisent des points lumineux lorsqu’ils sont irradiés avec une lumière UV d’une longueur d’onde appropriée. Marquez le centre de chaque endroit avec un crayon.
3. Les taches peuvent également être visualisées en appliquant un réactif de visualisation ou une coloration sur la plaque de CCM. Le réactif de visualisation peut être appliqué en trempant la plaque dans le réactif, ou en essuyant la plaque avec une boule de coton saturée d’un réactif non corrosif.
4. Une solution à 20 % d’acide phosphomolybdique dans de l’éthanol est utile pour la visualisation de la plupart des composés organiques. Les taches apparaissent lors du chauffage de la plaque avec un pistolet thermique ou dans un four.
5. D’autres réactifs peuvent être utilisés pour la visualisation de classes spécifiques de composés. Par exemple, le réactif ninhydrine est utilisé pour la visualisation des acides aminés et la 2,4-dinitrophénylhydrazine pour les aldéhydes et les cétones.

6. Analyse

1. Le facteur de retard (R_f) est le rapport entre la distance parcourue par un composé sur une plaque de CCM et la distance parcourue par le solvant. Cela peut être déterminé en mesurant la distance entre la ligne de base et le centre du spot et en divisant la valeur par la distance entre la ligne de base et le front du solvant.
   
2. Le R_f d’un composé est caractéristique de ses propriétés physiques et dépend de facteurs tels que la température, la taille de l’échantillon, l’épaisseur et l’activité de l’adsorbant, la température et la taille de l’échantillon.
3. Pour confirmer qu’un inconnu est identique à un composé connu, un étalon doit être repéré sur la même plaque de CCM. Les substances identiques auront la même caractéristique R_f.

La chromatographie sur couche mince, ou CCM, est une méthode chromatographique utilisée pour séparer des mélanges de composés non volatils, couramment utilisée en chimie organique.

La CCM est réalisée sur une plaque à support en verre ou en plastique. Une ligne de base est marquée sur la plaque, ainsi que des étiquettes. Le mélange examiné et les composés de référence sont dissous dans un solvant approprié et appliqués près du bord inférieur de la plaque de CCM en petits points. L’assiette est placée dans un bocal, et un solvant ? (la phase mobile) ? sépare le mélange en fonction des propriétés physiques de chaque composant.

Malgré le fait que les techniques de séparation plus lourdes en instruments ont un pouvoir de résolution plus élevé que la CCM, c’est la vitesse et le faible coût qui font de la CCM une technique attrayante pour l’analyse qualitative à la volée. Cette vidéo démontre la préparation, le fonctionnement et l’analyse de la chromatographie sur couche mince.

Les techniques chromatographiques comprennent une phase stationnaire et une phase mobile. Dans le cadre de la CCM, la phase stationnaire est constituée d’une fine couche de matériau fixée à la plaque. Le matériau est une substance polaire, telle que le gel de silice. La phase mobile est un liquide non polaire qui remonte la couche adsorbante par capillarité. Au fur et à mesure que la phase mobile se déplace vers le haut de la plaque, elle entraîne les composants de chaque point, qui sont ensuite séparés en fonction de la polarité.

Les composés moins polaires passeront plus de temps dans la phase mobile lorsqu’ils sont tirés vers le haut de la plaque. Les composés plus polaires sont plus attirés par la phase stationnaire et ne remonteront donc pas aussi loin sur la plaque.

La séparation a lieu dans un conteneur en développement. Il peut s’agir de bocaux avec des couvercles ou de béchers recouverts de papier d’aluminium. Utilisez le plus petit contenant disponible qui peut accueillir la plaque TLC pour accélérer la séparation.

La phase mobile, ou solvant de développement, doit être aussi apolaire que possible pour une bonne séparation. Voici une série éléotropique pour le gel de silice, une liste de phases mobiles courantes par ordre croissant de puissance d’extraction.

Plusieurs phases mobiles peuvent être testées simultanément. Sur une plaque propre, repérez l’échantillon dissous plusieurs fois, à au moins 2 cm de distance. Appliquez suffisamment de phase mobile à chaque endroit pour former un cercle de 1 à 2 cm de diamètre.

Marquez la distance parcourue par la phase mobile. Si la phase mobile n’est pas assez polaire, l’échantillon restera proche du point initial. Si la phase mobile est trop polaire, tout l’échantillon migrera avec le front du solvant. Une phase mobile appropriée montrera des anneaux bien séparés, l’anneau le plus externe étant à environ 50 % de la distance par rapport au front du solvant.

Si nécessaire, deux phases mobiles miscibles peuvent être mélangées dans des proportions variables pour obtenir les propriétés souhaitées. Ici, un mélange 1:1 d’acétate d’éthyle et d’hexane était trop polaire, mais un mélange 1:20 a été séparé de manière appropriée.

Une fois la phase mobile choisie, vous êtes prêt à commencer à développer la plaque.

Pour commencer la procédure, coupez une plaque TLC disponible dans le commerce à la taille souhaitée. Si la plaque a un support en verre, marquez-la avec un coupe-verre et cassez soigneusement le long de la ligne.

À l’aide d’un crayon, tracez une ligne de base à environ 1 cm du bas de l’assiette. Marquez l’endroit où les échantillons seront repérés le long de la ligne. Assurez-vous que les taches sont à au moins 1 cm du bord et à 3 mm de distance. Étiquetez-les de manière appropriée.

Les échantillons solides doivent être dissous dans un solvant approprié. Les solvants courants comprennent l’hexane, l’acétate d’éthyle ou le dichlorométhane. Utilisez le solvant le moins polaire qui dissoudra l’échantillon.

Prélever le mélange échantillon/solvant à l’aide d’un capillaire en verre. Touchez doucement l’embout à l’endroit souhaité sur la plaque TLC et retirez-le immédiatement. Il est important de ne pas perturber la phase stationnaire.

Gardez l’endroit aussi petit que possible, car cela permet une meilleure séparation. Si l’on a besoin d’un échantillon supplémentaire, des taches peuvent être appliquées successivement à chaque endroit. Laissez le solvant sécher entre les applications. Un courant d’air peut être utilisé pour sécher les solvants moins volatils.

La plaque TLC est maintenant prête à être développée. Placez un morceau de papier filtre au fond du bocal pour augmenter la pression de vapeur. Ajoutez la phase mobile à une profondeur qui n’atteint pas la ligne de fond. Fermez le pot lorsqu’il n’est pas utilisé afin que les vapeurs de solvant ne s’échappent pas.

Placez soigneusement la plaque TLC tachetée dans le bocal de développement. Assurez-vous que la phase mobile est inférieure à la ligne de base. Observez l’évolution du front solvable ? L’avant-garde de la phase mobile ? car il se déplacera rapidement vers le haut de l’assiette.

Ne laissez pas la phase mobile atteindre le bord supérieur de la plaque, car les bandes d’échantillon commenceront à se dilater par diffusion. Une fois que la façade du solvant s’approche du haut, retirez la plaque de la chambre de développement et marquez la façade du solvant avec un crayon avant que le solvant ne sèche.

Si les composés ne sont pas colorés, une lampe UV peut être utilisée pour visualiser les taches. Le composé bloquera la fluorescence de fond de la plaque. Réglez la lampe sur le réglage des ondes courtes et allumez la plaque sèche. À l’aide d’un crayon, tracez le contour de tous les points visibles sous la lampe. À l’aide d’un crayon, tracez le contour de tous les points visibles sous la lampe.

Une autre technique de visualisation possible consiste à utiliser du permanganate de potassium, un agent oxydant. À l’aide d’une pince à épiler, trempez la plaque dans la teinture de permanganate.

Retirez et tamponnez l’excès de solution avec une serviette en papier. Dans une hotte, chauffez soigneusement la plaque avec un pistolet thermique pour visualiser les taches. Utilisez un crayon pour marquer les taches qui apparaissent.

Une fois les taches visualisées, la substance d’intérêt peut être comparée aux normes, comme le montre ici. Dans cet exemple, l’inconnu est la 1,3-diphénylpropynone, un élément constitutif de la synthèse organique. En comparant la bande à un étalon connu et au chlorure de benzoyle, l’une des matières premières, le produit peut être identifié.

Le facteur de retardement, ou Rf, est utilisé pour identifier le composé inconnu. Le Rf est le rapport entre la distance parcourue par un composé le long d’une plaque CCM et la distance parcourue par la phase mobile. Le facteur est déterminé en mesurant la distance entre la ligne de base et le point et en divisant par la distance entre la ligne de base et le front du solvant.

Le Rf d’un composé donné dépend des conditions utilisées dans l’expérience, notamment le choix du solvant, l’épaisseur et l’activité de l’adsorbant, la température et la taille de l’échantillon. Il faut veiller à ce que ces facteurs restent cohérents entre les expériences.

Il existe plusieurs applications de la chromatographie sur couche mince.

Dans cet exemple, la teneur en triacylglycérides des glandes sébacées de chauve-souris a été étudiée. La fraction superficielle lipidique a d’abord été séparée par polarité sur une plaque CCM. La bande de triacylglycérides a ensuite été retirée de la plaque à l’aide d’une spatule. La poudre de silice a été transférée dans un tube de microcentrifugation avec du solvant. Après la centrifugation, la phase stationnaire a été laissée au fond du tube, tandis que les composés sont restés dissous dans le solvant. Les triacylglycérides ont ensuite été séparés par une autre propriété physique. Dans ce cas, la deuxième dimension de la séparation était la taille moléculaire.

La CCM peut également être utilisée pour surveiller la progression d’une réaction chimique. Dans cet exemple, le matériau de départ de la réaction a été utilisé comme étalon et a été utilisé avec la solution réactionnelle sur une plaque CCM. Ce processus a été répété à des intervalles précis au cours de la réaction. Au fur et à mesure que la réaction progressait, la bande de matériau de départ diminuait et la bande de produit s’élargissait. Lorsqu’il n’y avait pas de changement de bandes ou que tout le matériau de départ était consommé, la réaction était complète. ?

Enfin, les plaques CCM peuvent être utilisées dans les essais biologiques. Dans cet exemple, les composés ont été séparés du trèfle rouge avec de la CCM. Chaque bande a ensuite été placée sur des bactéries se développant sur des plaques de gélose. Les molécules qui présentaient une inhibition de la croissance bactérienne ont été analysées plus en détail pour leurs propriétés antimicrobiennes.

Vous venez de regarder l’introduction de JoVE à la chromatographie sur couche mince. Vous devez maintenant comprendre la théorie sous-jacente de la séparation, comment choisir une phase mobile appropriée pour votre expérience et comment configurer et faire fonctionner une plaque TLC. Merci d’avoir regardé !