Une protéine Méthode de préparation pour le haut-débit Identification des protéines interagissant avec un cofacteur nucléaire utilisant LC-MS / MS Analysis
January 24th, 2017
Nous avons établi un procédé pour la purification des protéines d'interaction co-régulation utilisant le système LC-MS / MS.
L’objectif global de cette procédure est d’identifier les protéines qui interagissent avec un cofacteur nucléaire à l’aide de l’analyse LC-MS/MS. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés liées aux mécanismes transcriptionnels dans le domaine de la régulation des gènes. Le principal avantage de cette technique est qu’elle permet d’identifier les protéines qui interagissent avec un cofacteur nucléaire.
De plus, cette méthode nous permet de mieux comprendre les mécanismes de régulation transcriptionnelle des facteurs nucléaires ciblés. Récoltez les cellules HEK 293 exprimant ARIP4 36 heures après la transvection en lavant la feuille cellulaire avec du PBS glacé et en collectant les cellules avec un grattoir cellulaire. Transférez les cellules dans un tube de 1,5 millilitre, puis centrifugez-les à 8000 g pendant deux minutes à quatre degrés Celsius.
Aspirez le surnageant et remettez en suspension la pastille cellulaire dans cinq fois le volume de pastille du tampon à haute teneur en sel. Faites pivoter le mélange pendant 20 minutes à quatre degrés Celsius. Après 20 minutes de rotation, centrifugez le tube à 17, 700g pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius.
Ensuite, transférez les surnageants dans un nouveau tube de deux millilitres et ajoutez un tampon de dilution à trois fois le volume de surnageant. Effectuez une autre cétrifugation, puis transférez le surnageant dans un nouveau tube de deux millilitres. Pendant la centrifugation de 10 minutes, laver 50 microlitres de billes anti-drapeau avec PBS.
Ensuite, centrifugez le tube à 2000g pendant une minute à quatre degrés Celsius. Retirez le surnageant et répétez les étapes de lavage d’abord avec 1 molaire de chlorhydrate de glycine, puis avec une molaire de chlorhydrate de tris. Ensuite, lavez deux fois avec un tampon à faible teneur en sel.
Ensuite, mélangez 50 microlitres de billes lavées avec des extraits de cellules entières. Faites pivoter doucement le mélange pendant quatre heures à deux à quatre degrés Celsius. Ensuite, à l’aide d’une pointe émoussée, transférez l’échantillon dans une micro-colonne de spin et laissez la solution s’égoutter dans un tube de 1,5 millilitre.
Congelez le flux dans de l’azote liquide et stockez-le à moins 80 degrés Celsius. Ensuite, lavez cinq fois les perles du drapeau avec un tampon à faible teneur en sel. Pour éluer, placez la colonne dans un tube de 1,5 millilitre et centrifugez à 2000g pendant une minute pour sécher les billes.
Boucher le bas de la colonne puis ajouter 50 microlitres de chlorhydrate de glycine à 1 molaire. Agitez doucement le mélange pendant 10 minutes à température ambiante. Après 10 minutes, placez la colonne dans un nouveau tube de 1,5 millilitre et centrifugez à 2000 g pendant une minute.
Neutraliser la solution éluée avec 10 microlitres de chlorhydrate d’une molaire et bien mélanger par pipetage et vortex. Ajouter 50 microlitres de bicarbonate d’ammonium de 100 millimolaires. 10 microlitres d’acétonitrile, deux microlitres de dithiothréitol et 50 microlitres d’échantillon neutralisé.
Incuber pendant 30 minutes à 56 degrés Celsius. Après l’incubation, laissez l’échantillon à température ambiante pendant 10 minutes. Ajoutez ensuite 10 microlitres d’iodoacétamide de 333 millimolaires à l’échantillon et incubez dans l’obscurité pendant 30 minutes à 37 degrés C. Ajoutez 10 microlitres de trypsine au mélange et incubez toute la nuit à 37 degrés Celsius.
Le lendemain, transportez le produit final vers une installation LC-MS/MS ou vers un laboratoire de spectrométrie de masse tiers pour analyse. Cette image montre la coloration à l’argent de l’épitope du drapeau marqué ARIP4 exprimé dans les cellules HEK 293 après précipitation immunitaire avec un anticorps spécifique du drapeau et séparation par électrophorèse. À titre de contrôle, une purification simulée a été réalisée sur des cellules HEK 293 qui n’exprimaient pas de protéines exogènes.
En utilisant notre méthode, il est possible d’identifier des cofacteurs nucléaires présumés via leur facteur transcriptionnel d’intérêt et d’améliorer encore notre compréhension des mécanismes de régulation transcriptionnelle.
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Aperçu
Cette étude présente une méthode pour purifier les protéines d'interaction coregulatrices en utilisant l'analyse LC-MS/MS. La technique vise à identifier les protéines interagissant avec un cofacteur nucléaire, améliorant notre compréhension des mécanismes de régulation transcriptionnelle.
Composants clés de l'étude
Domaine scientifique
- Neuroscience
- Biochimie
- Régulation génique
Contexte
- Comprendre les mécanismes transcriptionnels est crucial dans la régulation des gènes.
- Identifier les interactions protéiques peut révéler des informations sur les processus cellulaires.
- LC-MS/MS est un outil puissant pour analyser les interactions protéiques.
- Cette méthode se concentre sur les cofacteurs nucléaires et leurs rôles régulateurs.
Objectif de l'étude
- Identifier les protéines interagissant avec un cofacteur nucléaire.
- Élucider les mécanismes de régulation transcriptionnelle.
- Fournir une méthode fiable pour la purification des protéines.
Méthodes utilisées
- Récolte des cellules HEK 293 exprimant l'ARIP4 marquée par un flag.
- Lavage des cellules avec du PBS glacé.
- Collecte des cellules à l'aide d'un grattoir cellulaire.
- Centrifugation des cellules à 8000g pendant deux minutes à 4°C.
Résultats principaux
- Identification réussie des protéines interagissant avec les cofacteurs nucléaires.
- Compréhension améliorée des mécanismes transcriptionnels.
- Démonstration de l'efficacité de la méthode LC-MS/MS.
- Applications potentielles dans la recherche sur la régulation génique.
Conclusions
- La méthode fournit un outil précieux pour étudier les interactions protéiques.
- Elle contribue à la compréhension plus large de la régulation génique.
- Des études futures peuvent s'appuyer sur cette technique pour des insights supplémentaires.
Questions fréquemment posées
Executive Industry Relevance
High-throughput identification of nuclear cofactor protein interactions using LC-MS/MS is pivotal for de-risking early discovery and clarifying transcriptional regulatory networks. This workflow enables biopharma teams to interrogate mechanistic hypotheses and prioritize targets based on direct protein-protein interaction evidence. Integrating robust interactome mapping at the discovery stage supports predictive confidence and informs portfolio triage decisions.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables systematic identification of nuclear cofactor binding partners for functional target validation.
- Supports mechanistic de-risking by clarifying transcriptional regulatory pathways.
- Provides direct evidence for protein interaction networks relevant to gene regulation.
- Facilitates prioritization of targets with validated molecular interactions.
Screening & Assay Development
- Prepares validated protein complexes for downstream quantitative LC-MS/MS analysis.
- Standardizes immunoprecipitation and sample preparation for reproducible interactome profiling.
- Generates quantitative data supporting assay development and screening readiness.
- Enables reliable evaluation of compound effects on protein-protein interactions.
Translational & Preclinical Research
- Aligns interactome data with disease-relevant transcriptional mechanisms when nuclear cofactors are implicated in pathology.
- Supports continuity from discovery through preclinical validation by mapping regulatory protein networks.
- Informs risk-adjusted advancement decisions based on mechanistic insights.
Pipeline & Workflow Integration
This protein preparation and LC-MS/MS workflow fits at the interface of early discovery and lead identification, providing foundational interactome data for downstream translational research.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by mapping nuclear cofactor interactions.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative outputs for assay development and compound screening.
- Analytics: Provides mass spectrometry-based identification and quantification of protein complexes.
- Translational Research: Enables alignment of molecular interaction data with disease models when relevant.
- Enterprise Reuse: Establishes a scalable, reusable workflow for interactome mapping across targets and programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in target validation.
- Operational Value: Standardizes protein complex isolation and LC-MS/MS analysis for reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital efficiency by grounding advancement in direct interaction data.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization based on validated molecular mechanisms.
Implementation Considerations
- Requires expertise in immunoprecipitation, protein chemistry, and LC-MS/MS analytics.
- Needs access to mass spectrometry instrumentation and analytical infrastructure.
- Demands cross-team standardization of sample preparation and data analysis protocols.
- Adaptable to different nuclear cofactors and tagged protein systems with protocol optimization.
- Dependent on antibody specificity and quality for reliable immunoprecipitation.
