Une protéine Méthode de préparation pour le haut-débit Identification des protéines interagissant avec un cofacteur nucléaire utilisant LC-MS / MS Analysis
24 janvier 2017
Nous avons établi un procédé pour la purification des protéines d'interaction co-régulation utilisant le système LC-MS / MS.
L’objectif global de cette procédure est d’identifier les protéines qui interagissent avec un cofacteur nucléaire à l’aide de l’analyse LC-MS/MS. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés liées aux mécanismes transcriptionnels dans le domaine de la régulation des gènes. Le principal avantage de cette technique est qu’elle permet d’identifier les protéines qui interagissent avec un cofacteur nucléaire.
De plus, cette méthode nous permet de mieux comprendre les mécanismes de régulation transcriptionnelle des facteurs nucléaires ciblés. Récoltez les cellules HEK 293 exprimant ARIP4 36 heures après la transvection en lavant la feuille cellulaire avec du PBS glacé et en collectant les cellules avec un grattoir cellulaire. Transférez les cellules dans un tube de 1,5 millilitre, puis centrifugez-les à 8000 g pendant deux minutes à quatre degrés Celsius.
Aspirez le surnageant et remettez en suspension la pastille cellulaire dans cinq fois le volume de pastille du tampon à haute teneur en sel. Faites pivoter le mélange pendant 20 minutes à quatre degrés Celsius. Après 20 minutes de rotation, centrifugez le tube à 17, 700g pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius.
Ensuite, transférez les surnageants dans un nouveau tube de deux millilitres et ajoutez un tampon de dilution à trois fois le volume de surnageant. Effectuez une autre cétrifugation, puis transférez le surnageant dans un nouveau tube de deux millilitres. Pendant la centrifugation de 10 minutes, laver 50 microlitres de billes anti-drapeau avec PBS.
Ensuite, centrifugez le tube à 2000g pendant une minute à quatre degrés Celsius. Retirez le surnageant et répétez les étapes de lavage d’abord avec 1 molaire de chlorhydrate de glycine, puis avec une molaire de chlorhydrate de tris. Ensuite, lavez deux fois avec un tampon à faible teneur en sel.
Ensuite, mélangez 50 microlitres de billes lavées avec des extraits de cellules entières. Faites pivoter doucement le mélange pendant quatre heures à deux à quatre degrés Celsius. Ensuite, à l’aide d’une pointe émoussée, transférez l’échantillon dans une micro-colonne de spin et laissez la solution s’égoutter dans un tube de 1,5 millilitre.
Congelez le flux dans de l’azote liquide et stockez-le à moins 80 degrés Celsius. Ensuite, lavez cinq fois les perles du drapeau avec un tampon à faible teneur en sel. Pour éluer, placez la colonne dans un tube de 1,5 millilitre et centrifugez à 2000g pendant une minute pour sécher les billes.
Boucher le bas de la colonne puis ajouter 50 microlitres de chlorhydrate de glycine à 1 molaire. Agitez doucement le mélange pendant 10 minutes à température ambiante. Après 10 minutes, placez la colonne dans un nouveau tube de 1,5 millilitre et centrifugez à 2000 g pendant une minute.
Neutraliser la solution éluée avec 10 microlitres de chlorhydrate d’une molaire et bien mélanger par pipetage et vortex. Ajouter 50 microlitres de bicarbonate d’ammonium de 100 millimolaires. 10 microlitres d’acétonitrile, deux microlitres de dithiothréitol et 50 microlitres d’échantillon neutralisé.
Incuber pendant 30 minutes à 56 degrés Celsius. Après l’incubation, laissez l’échantillon à température ambiante pendant 10 minutes. Ajoutez ensuite 10 microlitres d’iodoacétamide de 333 millimolaires à l’échantillon et incubez dans l’obscurité pendant 30 minutes à 37 degrés C. Ajoutez 10 microlitres de trypsine au mélange et incubez toute la nuit à 37 degrés Celsius.
Le lendemain, transportez le produit final vers une installation LC-MS/MS ou vers un laboratoire de spectrométrie de masse tiers pour analyse. Cette image montre la coloration à l’argent de l’épitope du drapeau marqué ARIP4 exprimé dans les cellules HEK 293 après précipitation immunitaire avec un anticorps spécifique du drapeau et séparation par électrophorèse. À titre de contrôle, une purification simulée a été réalisée sur des cellules HEK 293 qui n’exprimaient pas de protéines exogènes.
En utilisant notre méthode, il est possible d’identifier des cofacteurs nucléaires présumés via leur facteur transcriptionnel d’intérêt et d’améliorer encore notre compréhension des mécanismes de régulation transcriptionnelle.
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Aperçu
Cet article présente un protocole détaillé permettant d'identifier les protéines interagissant avec des facteurs nucléaires cofacteurs par analyse LC-MS/MS. La méthode consiste en une immunoprécipitation d'un cofacteur nucléaire marqué par une étiquette flag à partir de cellules HEK 293, suivie d'une spectrométrie de masse afin de révéler les interactions protéine-protéine impliquées dans la régulation transcriptionnelle. Cette approche permet aux chercheurs d'élucider les réseaux complexes régissant l'expression des gènes.
Composantes clés de l'étude
Domaine scientifique
- Biologie moléculaire
- Protéomique
- Régulation transcriptionnelle
Contexte
- Les cofacteurs transcriptionnels sont essentiels à la régulation efficace de la structure de la chromatine nucléaire.
- Les cofacteurs interagissent avec les facteurs de transcription, modifient les histones et les protéines, et peuvent altérer la conformation de la chromatine.
- La compréhension des interactions protéine-protéine au sein de ces réseaux est cruciale pour élucider les mécanismes régulateurs des gènes.
- La LC-MS/MS est une technique validée permettant d'identifier les partenaires de liaison des protéines.
Objectif de l'étude
- Établir une méthode rapide et fiable pour identifier les protéines interagissant avec les facteurs cofacteurs nucléaires.
- Faciliter l'analyse à haut débit des complexes protéiques impliqués dans la régulation de la transcription.
- Approfondir la compréhension des mécanismes moléculaires sous-jacents au contrôle de l'expression génique.
Méthodes utilisées
- Expression de ARIP4 marqué par un flag dans des cellules HEK 293.
- Récolte des cellules et lyse à l’aide d’un tampon à haute force ionique.
- Immunoprécipitation avec des billes anti-flag pour isoler les complexes protéiques.
- Lavage et élution séquentiels des protéines liées.
- Digestion des protéines par la trypsine et préparation des échantillons pour LC-MS/MS.
- Analyse des interactions protéiques par spectrométrie de masse.
Résultats principaux
- Isolation réussie de l'ARIP4 marquée par un marqueur « flag » et des protéines associées à partir de cellules HEK 293.
- La coloration argent a confirmé la présence des protéines immunoprécipitées.
- Des expériences témoins ont validé la spécificité du processus de purification.
- La LC-MS/MS a permis l'identification de partenaires putatifs de liaison des cofacteurs nucléaires.
Conclusions
- Le protocole décrit permet d'identifier efficacement les protéines interagissant avec des facteurs cofacteurs nucléaires.
- Cette méthode fait progresser l'étude des mécanismes régulateurs de la transcription.
- Elle fournit une base pour explorer davantage les réseaux protéiques impliqués dans la régulation des gènes.
Questions fréquemment posées
Pertinence professionnelle pour l'industrie
L'identification à haut débit des interactions entre protéines cofacteurs nucléaires à l'aide de LC-MS/MS est essentielle pour réduire les risques en phase précoce de découverte et clarifier les réseaux régulateurs transcriptionnels. Ce flux de travail permet aux équipes de biopharmacie d'interroger des hypothèses mécanistiques et de hiérarchiser les cibles en se fondant sur des preuves directes d'interactions protéine-protéine. L'intégration d'une cartographie robuste de l'interactome en phase de découverte renforce la confiance prédictive et éclaire les décisions de tri du portefeuille.
Applications stratégiques en R-D biopharmaceutique
Début de la découverte et validation de la cible
- Permet l'identification systématique des partenaires de liaison des cofacteurs nucléaires pour la validation fonctionnelle des cibles.
- Contribue à l'atténuation des risques mécanistiques en clarifiant les voies régulatrices de la transcription.
- Fournit des preuves directes de réseaux d'interactions protéiques pertinents pour la régulation des gènes.
- Facilite la priorisation des cibles possédant des interactions moléculaires validées.
Développement de tests et criblage
- Prépare des complexes protéiques validés pour une analyse quantitative en LC-MS/MS en aval.
- Standardise l'immunoprécipitation et la préparation des échantillons pour un profilage reproductible de l'interactome.
- Génère des données quantitatives permettant le développement de tests et la préparation au criblage.
- Permet une évaluation fiable des effets des composés sur les interactions protéine-protéine.
Recherche translationnelle et préclinique
- Aligne les données d'interactome avec les mécanismes transcriptionnels liés aux maladies lorsque des facteurs cofacteurs nucléaires sont impliqués dans la pathologie.
- Permet une continuité entre la découverte et la validation préclinique en cartographiant les réseaux protéiques régulateurs.
- Éclaire les décisions d'avancement ajustées au risque en se fondant sur des connaissances mécanistiques.
Intégration des pipelines et des flux de travail
Cette préparation protéique et ce protocole de LC-MS/MS s'inscrivent à l'interface entre la phase initiale de découverte et l'identification de composés candidats, fournissant des données fondamentales sur l'interactome pour des recherches translationnelles ultérieures.
- Biologie de la découverte : Facilite la vérification d'hypothèses et la clarification des voies en cartographiant les interactions des cofacteurs nucléaires.
- Écrans : Fournit des résultats reproductibles et quantitatifs pour le développement de tests et le criblage de composés.
- Analytique : Permet l'identification et la quantification fondées sur la spectrométrie de masse des complexes protéiques.
- Recherche translationnelle : Permet, le cas échéant, d'associer les données d'interactions moléculaires à des modèles de maladies.
- Réutilisation en entreprise : Met en place un flux de travail évolutif et réutilisable pour la cartographie de l'interactome à travers différentes cibles et programmes.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Accroît la confiance prédictive et réduit l'ambiguïté mécanistique dans la validation des cibles.
- Valeur opérationnelle : Standardise l'isolement des complexes protéiques et l'analyse LC-MS/MS pour assurer la reproductibilité et l'évolutivité.
- Valeur stratégique : Améliore les décisions d'avancement ou d'abandon et l'efficacité du capital en fondant les progrès sur des données d'interaction directe.
- Impact sur le portefeuille : Permet une priorisation ajustée au risque en se basant sur des mécanismes moléculaires validés.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Nécessite une expertise en immunoprécipitation, en chimie des protéines et en analyses LC-MS/MS.
- Suppose un accès à des instruments de spectrométrie de masse et à une infrastructure analytique.
- Exige une standardisation interéquipes des protocoles de préparation des échantillons et d'analyse des données.
- Peut être adapté à différents cofacteurs nucléaires et systèmes de protéines marquées moyennant une optimisation du protocole.
- Dépend de la spécificité et de la qualité des anticorps pour une immunoprécipitation fiable.
