Name: Une protéine Méthode de préparation pour le haut-débit Identification des protéines interagissant avec un cofacteur nucléaire utilisant LC-MS / MS Analysis (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-24T12:30:00.000+00:00
Duration: 5 min 43 s
Description: Découvrez une méthode de préparation protéique pour identifier les protéines interagissant avec un cofacteur nucléaire par analyse LC-MS/MS. Cette approche permet d'étudier les mécanismes de régulation transcriptionnelle dans les cellules HEK 293.

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Cette étude a été soutenue par la Fondation Astellas pour la recherche sur les troubles métaboliques (HT), la Fondation Takeda Science (HT) et par une société japonaise pour la promotion des subventions scientifiques pour les jeunes scientifiques (B) à HT.

1. transfection <ol><li> Ensemencer des cellules HEK293 dans des plaques de culture à 100 mm (2 x 10 6 cellules / boîte). La culture des cellules dans un milieu de Eagle modifié par Dulbecco supplémenté avec 10% de sérum de veau foetal, 100 ug / ml de streptomycine et de 100 unités / ml de pénicilline. Incuber les cellules dans un incubateur humidifié à 5% de CO 2 et 37 ° C. </li><li> Le lendemain, transfecter les cellules avec 10 pg de étiquetée FLAG ARIP4 plasmide en utilisant 40 ul de réactif de transfection selon les instructions du fabricant 11. </li></ol> 2. Extraction des protéines <ol><li> Environ 36 heures après la transfection, laver les cellules avec du PBS glacé et récolter les cellules en utilisant un grattoir. Transférer les cellules dans un 1,5 mltube et centrifuger à 8000 xg pendant 2 min à 4 ° C. Aspirer le surnageant et remettre en suspension le culot cellulaire dans 5x le volume du culot de tampon KCl 0,4 M (tampon salin élevé: 20 mM de Tris-HCl (pH 8,0), 0,4 M de KCl, 5 mM de MgCl2, 10% de glycerol, 0,1% de NP-40, 10 mM b-mercaptethanol, 1 x cocktail inhibiteur de protease). Tourner le mélange pendant 20 min à 4 ° C. </li><li> Centrifuger le tube à 17.700 xg pendant 10 min à 4 ° C. </li><li> Transférer le surnageant (extrait de cellules entières) dans un nouveau tube de 2 ml et ajouter 3 fois le volume initial de tampon 0 M de KCl (tampon de dilution: 20 mM de Tris-HCl (pH 8,0), 5 mM de MgCl2, 10% de glycerol, 0,1% de NP-40, 10 mM β-mercaptoéthanol, 1x inhibiteur de la protéase cocktail). </li><li> Effectuer une nouvelle centrifugation (17 700 g pendant 10 min à 4 ° C) et transférer le surnageant (extrait de cellules entières) dans un nouveau tube de 2 ml. </li></ol> 3. Immunoprécipitation <ol><li> Au cours de la centrifugation (2,4), laver 50 ul de billes anti-FLAG avec du PBS, 0,1 M de glycine-chlorhydrate, puis 1 M de Tris-chlorhydrate, suivie par deux lavages avec un tampon 0,1 M KCl (tampon faible teneur en sel: 20 mM de Tris- HCl (pH 8,0), 0,1 m de KCl, MgCl2 5 mM, glycerol à 10%, 0,1% de NP-40 à 10 mM b-mercaptoéthanol, 1x inhibiteur de la protéase cocktail). La centrifugation pour ce processus de lavage est effectué à 2000 xg pendant 1 min à 4 ° C. </li><li> Mélanger 50 pi de perles de FLAG avec les extraits de cellules entières et faire tourner doucement le mélange pendant 4 heures à 2-4 ° C (1% de l&#39;extrait de cellules entières de l&#39;étape 2.4 devrait également être conservé à -80 ° C pour une utilisation ultérieure comme entrée). </li><li> Transférer l&#39;échantillon à une colonne de centrifugation micro (chute de poids). Gardez l&#39;écoulement dans un tube de 1,5 ml, congeler en utilisant de l&#39;azote liquide, et le stocker à -80 ° C (vérifier les niveaux de l&#39;entrée et écoulement en utilisant une analyse Western blot de protéines). </li><li> Ajouter 1 ml de tampon 0,1 M KCl (tampon pauvre en sel) pour laver les perles de FLAG (chute de gravité). </li><li> Répétez l&#39;étape 3.4 au moins quatre fois (pour un total de cinq lavages). </li></ol> 4. Elution <ol><li> Placer la colonne dans un tube de 1,5 ml et centrifuger à 2000 g pendant 1 min; les perles vont sécher. </li><li> Boucher le fond dela colonne. </li><li> Ajouter 50 ul (égal au volume de billes FLAG) de 0,1 M de glycine-HCl (pH 2,5). </li><li> Secouer doucement le mélange pendant 10 min à température ambiante. </li><li> Placer la colonne dans un nouveau tube de 1,5 ml et centrifuger à 2000 g pendant 1 min. </li><li> La solution éluée est neutralisée avec 10 pl de 1 M de Tris-HCl (pH 8,0); bien mélanger par pipetage ou en utilisant une machine à vortex. </li></ol> 5. L&#39;alkylation et trypsinisation <ol><li> Ajouter 50 ul de 100 mM de NH 4 HCO 3, 10 pi de CH3CN et 2 pl de dithiothréitol au mélange (112 ul de volume total). </li><li> Incuber l&#39;échantillon pendant 30 minutes à 56 ° C. </li><li> Placer l&#39;échantillon à la température ambiante pendant 10 min. </li><li> Ajouter 10 ul de 333 mM d&#39;iodoacétamide à l&#39;échantillon et incuber dans l&#39;obscurité pendant 30 min à 37 ° C. </li><li> Ajouter 10 pi de trypsine (33 ng / ul) au mélange, et incuber pendant une nuit à 37 ° C. </li></ol><ol><li> Après trypsinisation durant la nuit, le transport du produit final à une LC-MS / MS installation ou à un tiers laboratoire de spectrométrie de masse pour l&#39; analyse 12. </li></ol>

<ol><li>De Las Rivas, J., Fontanillo, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein-protein+interactions+essentials%3A+key+concepts+to+building+and+analyzing+interactome+networks%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Comput.Biol%22%5BJournal%5D)">Protein-protein interactions essentials: key concepts to building and analyzing interactome networks.</a> PLoS Comput.Biol. 6 (6), e1000807(2010).</li>
<li>Westermarck, J., Ivaska, J., Corthals, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+protein+interactions+involved+in+cellular+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.Cell.Proteomics%22%5BJournal%5D)">Identification of protein interactions involved in cellular signaling.</a> Mol.Cell.Proteomics. 12 (7), 1752-1763 (2013).</li>
<li>MacPherson, R. E., Ramos, S. V., Vandenboom, R., Roy, B. D., Peters, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skeletal+muscle+PLIN+proteins%2C+ATGL+and+CGI-58%2C+interactions+at+rest+and+following+stimulated+contraction%5BTitle%5D)+AND+%22Am.J.Physiol.Regul.Integr.Comp.Physiol%22%5BJournal%5D)">Skeletal muscle PLIN proteins, ATGL and CGI-58, interactions at rest and following stimulated contraction.</a> Am.J.Physiol.Regul.Integr.Comp.Physiol. 304 (8), 644-650 (2013).</li>
<li>Qin, K., Dong, C., Wu, G., Lambert, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inactive-state+preassembly+of+G%28q%29-coupled+receptors+and+G%28q%29+heterotrimers%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.Chem.Biol%22%5BJournal%5D)">Inactive-state preassembly of G(q)-coupled receptors and G(q) heterotrimers.</a> Nat.Chem.Biol. 7 (10), 740-747 (2011).</li>
<li>Ogawa, H., Ishiguro, K., Gaubatz, S., Livingston, D. M., Nakatani, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+complex+with+chromatin+modifiers+that+occupies+E2F-+and+Myc-responsive+genes+in+G0+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A complex with chromatin modifiers that occupies E2F- and Myc-responsive genes in G0 cells.</a> Science. 296 (5570), 1132-1136 (2002).</li>
<li>Shi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coordinated+histone+modifications+mediated+by+a+CtBP+co-repressor+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Coordinated histone modifications mediated by a CtBP co-repressor complex.</a> Nature. 422 (6933), 735-738 (2003).</li>
<li>Huh, K. W., DeMasi, J., Ogawa, H., Nakatani, Y., Howley, P. M., Munger, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Association+of+the+human+papillomavirus+type+16+E7+oncoprotein+with+the+600-kDa+retinoblastoma+protein-associated+factor%2C+p600%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A%22%5BJournal%5D)">Association of the human papillomavirus type 16 E7 oncoprotein with the 600-kDa retinoblastoma protein-associated factor, p600.</a> Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 102 (32), 11492-11497 (2005).</li>
<li>Huang, B. X., Kim, H. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effective+identification+of+Akt+interacting+proteins+by+two-step+chemical+crosslinking%2C+co-immunoprecipitation+and+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Effective identification of Akt interacting proteins by two-step chemical crosslinking, co-immunoprecipitation and mass spectrometry.</a> PLoS One. 8 (4), 61430(2013).</li>
<li>ten Have, S., Boulon, S., Ahmad, Y., Lamond, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+spectrometry-based+immuno-precipitation+proteomics+-+the+user%27s+guide%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Mass spectrometry-based immuno-precipitation proteomics - the user's guide.</a> Proteomics. 11 (6), 1153-1159 (2011).</li>
<li>Ogawa, H., Komatsu, T., Hiraoka, Y., Morohashi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+Suppression+by+Transient+Recruitment+of+ARIP4+to+Sumoylated+nuclear+receptor+Ad4BP%2FSF-1%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.Biol.Cell%22%5BJournal%5D)">Transcriptional Suppression by Transient Recruitment of ARIP4 to Sumoylated nuclear receptor Ad4BP/SF-1.</a> Mol.Biol.Cell. 20 (19), 4235-4245 (2009).</li>
<li>Tsuchiya, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+autophagic+receptor+p62+regulates+the+abundance+of+transcriptional+coregulator+ARIP4+during+nutrient+starvation%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.Rep%22%5BJournal%5D)">Selective autophagic receptor p62 regulates the abundance of transcriptional coregulator ARIP4 during nutrient starvation.</a> Sci.Rep. 5, 14498(2015).</li>
<li>Watanabe, T., Matsuo, I., Maruyama, J., Kitamoto, K., Ito, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+characterization+of+an+intracellular+lectin%2C+calnexin%2C+from+Aspergillus+oryzae+using+N-glycan-conjugated+beads%5BTitle%5D)+AND+%22Biosci.Biotechnol.Biochem%22%5BJournal%5D)">Identification and characterization of an intracellular lectin, calnexin, from Aspergillus oryzae using N-glycan-conjugated beads.</a> Biosci.Biotechnol.Biochem. 71 (11), 2688-2696 (2007).</li>
<li>Sitz, J. H., Tigges, M., Baumgartel, K., Khaspekov, L. G., Lutz, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dyrk1A+potentiates+steroid+hormone-induced+transcription+via+the+chromatin+remodeling+factor+Arip4%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.Cell.Biol%22%5BJournal%5D)">Dyrk1A potentiates steroid hormone-induced transcription via the chromatin remodeling factor Arip4.</a> Mol.Cell.Biol. 24 (13), 5821-5834 (2004).</li>
<li>Mohammed, H., Taylor, C., Brown, G. D., Papachristou, E. K., Carroll, J. S., D'Santos, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+immunoprecipitation+mass+spectrometry+of+endogenous+proteins+%28RIME%29+for+analysis+of+chromatin+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.Protoc%22%5BJournal%5D)">Rapid immunoprecipitation mass spectrometry of endogenous proteins (RIME) for analysis of chromatin complexes.</a> Nat.Protoc. 11 (2), 316-326 (2016).</li>
<li>Fonslow, B. R., Yates, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Capillary+electrophoresis+applied+to+proteomic+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22J.Sep.Sci%22%5BJournal%5D)">Capillary electrophoresis applied to proteomic analysis.</a> J.Sep.Sci. 32 (8), 1175-1188 (2009).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

transfection efficace est essentielle pour obtenir un bon résultat avec ce protocole. En conséquence, nous vous recommandons d&#39;utiliser l&#39;analyse Western blot pour déterminer les niveaux de protéine FLAG-tagged immunoprécipitées. Cette étape permet aux utilisateurs de vérifier que leur protéine d&#39;intérêt est correctement surexprimée et, en outre, que l&#39;adresse IP a été réalisée avec succès. les niveaux de protéine étiquetée FLAG doivent également être vérifiés avant l&#39;analyse par spectrométrie de mas...

interactions protéine-protéine jouent un rôle important dans de nombreuses fonctions biologiques. Par conséquent, ces interactions ont été impliquées dans la transduction du signal; le transport de protéines à travers les membranes cellulaires; le métabolisme cellulaire; et plusieurs processus nucléaires, y compris la replication de l&#39; ADN, la réparation des dommages de l&#39; ADN, la recombinaison et la transcription 1, 2, 3, 4. L&#39;identification des protéines impliquées dans ces interactions est par conséquent essentiel de faire progresser notre compréhension de ces processus cellulaires. Immunoprécipitation (IP) est une technique utilisée pour valider l&#39;analyse des interactions protéine-protéine. Afin de faciliter l&#39;identification des protéines co-immunoprécipitation, la spectrométrie de masse est souvent utilisée 5, 6, 7, 8,9. En ciblant un élément connu d&#39;un complexe protéique avec un anticorps, il est possible d&#39;isoler le complexe de protéines et d&#39;identifier ensuite les composants inconnus par analyse par spectrométrie de masse. ARIP4 (protéine androgène-récepteur coopérant 4), un co - régulateur de la transcription, interagit avec les protéines de récepteurs nucléaires, afin d&#39;activer ou de réprimer les promoteurs cibles d&#39;une manière dépendante du contexte 9, 10. Pour mieux comprendre les mécanismes de régulation de transcription qui régissent ces facteurs nucléaires, nous décrivons une méthode complète pour purifier et identifier les protéines qui interagissent ARIP4 en utilisant le système LC-MS / MS.

<table><tbody><tr><td>Lipofectamine 2000 Réactif de transfection</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11668019 Cocktail d’inhibiteurs</td><td></td></tr> de <tr><td>protéase (sans EDTA) (100x)</td><td>nacalai tesque</td><td>03969-21</td><td></td></tr><tr><td>ANTI-FLAG M2 Affinity Gel</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2220</td><td></td></tr><tr><td>Micro Bio-Spin</td><td>Colonnes BIO-RAD</td><td>732-6204</td><td></td></tr></tbody></table>

une protéine méthode de préparation pour le haut-débit identification des protéines interagissant avec un cofacteur nucléaire utilisant lc-ms / ms analysis

A Protein Preparation Method for the High-throughput Identification of Proteins Interacting with a Nuclear Cofactor Using LC-MS/MS Analysis

Les corégulateurs transcriptionnels sont essentiels à la régulation transcriptionnelle efficace de la structure de la chromatine nucléaire. Les corégulateurs jouent divers rôles dans la régulation de la transcription. Il s’agit notamment de l’interaction directe avec les facteurs de transcription, de la modification covalente des histones et d’autres protéines, et de l’altération occasionnelle de la conformation de la chromatine. Par conséquent, il est essentiel d’établir des méthodes relativement rapides pour identifier les protéines qui interagissent au sein de ce réseau afin d’améliorer notre compréhension des mécanismes de régulation sous-jacents. L’identification des partenaires de liaison aux protéines médiée par LC-MS/MS est une technique validée utilisée pour analyser les interactions protéine-protéine. En immunoprécipitant un membre précédemment identifié d’un complexe protéique avec un anticorps (parfois avec un anticorps pour une protéine marquée), il est possible d’identifier ses interactions protéiques inconnues via l’analyse par spectrométrie de masse. Ici, nous présentons une méthode de préparation de protéines pour l’identification à haut débit médiée par LC-MS/MS des interactions protéiques impliquant des cofacteurs nucléaires et leurs partenaires de liaison. Cette méthode permet de mieux comprendre les mécanismes de régulation transcriptionnelle des facteurs nucléaires ciblés.

Nous avons identifié un signal fort de ARIP4, environ 160 kDa, ainsi que ceux d&#39;un contrôle de l&#39; échantillon mock et plusieurs autres protéines inconnues (Figure 1). Analyse LC-MS / MS a identifié deux peptides ARIP4 complexes et les cofacteurs de peptides potentiels dans la fraction de billes de pavillon (tableau 1). p62 (Sequestosome1), un cofacteur ARIP4 connu 11 a été identifié dans l&#39;analyse (tableau 1),<...

Nous avons établi un procédé pour la purification des protéines d&#39;interaction co-régulation utilisant le système LC-MS / MS.

Une protéine Méthode de préparation pour le haut-débit Identification des protéines interagissant avec un cofacteur nucléaire utilisant LC-MS / MS Analysis

Transcriptional coregulators are vital to the efficient transcriptional regulation of nuclear chromatin structure. Coregulators play a variety of roles in ...

L'objectif général de cette procédure est d'identifier les protéines interagissant avec un cofacteur nucléaire à l'aide d'une analyse LC-MS/MS. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés relatives aux mécanismes transcriptionnels dans le domaine de la régulation des gènes. Le principal avantage de cette technique est que nous pouvons identifier les protéines interagissant avec un cofacteur nucléaire.En outre, cette méthode nous permet de mieux comprendre les mécanismes régulateurs transcriptionnels des facteurs nucléaires ciblés. Récolter les cellules HEK 293 exprimant ARIP4 marqué par un drapeau (flag-tagged) 36 heures après la transfection en lavant la couche cellulaire avec du PBS glacé et en collectant les cellules à l’aide d’un racloir cellulaire. Transférer les cellules dans un tube de 1,5 millilitre, puis centrifuger à 8000g pendant deux minutes à quatre degrés Celsius.Aspirez le surnageant et resuspendez le culot cellulaire dans un volume de tampon à haute force ionique égal à cinq fois le volume du culot. Incubez le mélange sous agitation rotative pendant 20 minutes à quatre degrés Celsius. Après 20 minutes d'agitation, centrifugez le tube à 17 700 g pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius.Ensuite, transférez les surnageants dans un nouveau tube de deux millilitres et ajoutez du tampon de dilution jusqu'à un volume égal à trois fois celui du surnageant. Effectuez une autre centrifugation, puis transférez le surnageant dans un nouveau tube de deux millilitres. Pendant la centrifugation de 10 minutes, lavez 50 microlitres de billes anti-flag avec du PBS.Ensuite, centrifuger le tube à 2000g pendant une minute à quatre degrés Celsius. Éliminer le surnageant et répéter les étapes de lavage d'abord avec du chlorhydrate de glycine 1 molaire, puis avec du chlorhydrate de tris 1 molaire. Laver ensuite deux fois avec le tampon à faible concentration saline.Ensuite, mélangez 50 microlitres de billes lavées avec des extraits de cellules entières. Faites tourner doucement le mélange pendant quatre heures à deux à quatre degrés Celsius. Puis utilisez une pipette à embout émoussé pour transférer l'échantillon dans une colonne micro-centrifuge et laissez la solution s'écouler dans un tube de 1,5 millilitre.Congelez rapidement le flux en azote liquide et conservez à moins 80 degrés Celsius. Ensuite, lavez les billes de flag avec le tampon à faible concentration de sel cinq fois. Pour l'élution, placez la colonne dans un tube de 1,5 millilitre et centrifugez à 2000g pendant une minute afin de sécher les billes.Fermer le bas de la colonne, puis ajouter 50 microlitres de glycine hydrochlorure à 1 molaire. Agiter doucement le mélange pendant 10 minutes à température ambiante. Après 10 minutes, placer la colonne dans un nouveau tube de 1,5 millilitre et centrifuger à 2000g pendant une minute.Neutraliser la solution élutée avec 10 microlitres de chlorure de tris à une molaire et bien mélanger par pipetage et vortexage. Ajouter 50 microlitres de bicarbonate d'ammonium à 100 millimolaire. 10 microlitres d'acétonitrile, deux microlitres de dithiothréitol et 50 microlitres d'échantillon neutralisé.Incuber pendant 30 minutes à 56 degrés Celsius. Après l'incubation, laisser l'échantillon à température ambiante pendant 10 minutes. Ajouter ensuite 10 microlitres de iodoacétamide à 333 millimolaire à l'échantillon et incuber à l'obscurité pendant 30 minutes à 37 degrés C. Ajouter 10 microlitres de trypsine au mélange et incuber toute la nuit à 37 degrés Celsius.Le lendemain, acheminer le produit final vers un centre LC-MS/MS ou vers un laboratoire externe de spectrométrie de masse pour analyse. Cette image montre une coloration argentique de ARIP4 portant un marqueur d'épitope flag exprimé dans des cellules HEK 293, après immunoprécipitation à l'aide d'un anticorps spécifique du flag et séparation par électrophorèse. Comme témoin, une purification factice a été réalisée sur des cellules HEK 293 n'exprimant pas de protéines exogènes.Grâce à notre méthode, il est possible d'identifier des cofacteurs nucléaires putatifs par l'intermédiaire de leur facteur de transcription d'intérêt et d'approfondir ainsi notre compréhension des mécanismes régulateurs de la transcription.

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