Isolement rapide de BMPR-IB + Adipose-Derived cellules stromales pour utilisation dans un calvarial Defect Modèle de guérison

L'objectif général de ce protocole est d'isoler des populations cellulaires spécifiques de cellules souches stromales dérivées du tissu adipeux et de tester leur activité ostéogénique à l'aide d'un test in vivo. La méthode peut être utilisée pour répondre à des questions clés dans le domaine de la biologie régénérative craniofaciale, telles que la manière dont les cellules souches dérivées du tissu adipeux peuvent être utilisées pour créer un tissu osseux pleinement fonctionnel dans des défauts osseux lésés. Le principal avantage de cette technique est que les cellules sont rapidement isolées à partir de tissu humain frais, évitant ainsi un passage en culture cellulaire, étape connue pour modifier l'expression des gènes et des marqueurs cellulaires.

Les implications de cette technique s'étendent aux patients présentant de grandes pertes osseuses, telles que causées par un cancer, un traumatisme ou une infection. À l'avenir, il pourrait être possible d'isoler des populations cellulaires de cellules souches adipeuses (ASCs) et de les utiliser de manière régénérative. La démonstration visuelle de cette technique est essentielle, car la création du défaut calvarial est difficile à apprendre, principalement parce que le défaut est réalisé sur un crâne bombé et qu'il se situe très près de la dure-mère.

Pour ce protocole, prélevez de la graisse sous-cutanée abdominale, latérale ou de la cuisse provenant d'un donneur humain sain, et conservez-la dans un flacon de prélèvement plastique. Ajoutez au tissu adipeux un volume équivalent de PBS stérile, puis mélangez par agitation douce pendant 30 secondes. Laissez la phase aqueuse se décanter, puis éliminez-la à l'aide d'une pipette plastique de 10 millilitres.

Ensuite, versez délicatement la graisse dans un grand récipient en plastique et ajoutez un volume égal de mélange de digestion. Nettoyez le récipient hermétique contenant la graisse avec de l'éthanol à 70 %, puis scellez-le avec du paraffine. Agitez ensuite le récipient à 180 tours par minute dans un incubateur à 37 °C pendant 30 minutes.

Ensuite, neutralisez la digestion en doublant le volume de la réaction avec le milieu standard. Faites centrifuger les cellules, retirez soigneusement le surnageant et resuspendez chaque culot dans 5 millilitres de milieu standard. Puis, faites passer toutes les suspensions à travers un filtre de 100 microns dans un tube conique de 50 millilitres.

Centrifuger le filtrat à quatre degrés Celsius pendant 15 minutes à 300 ×g. Éliminer le surnageant et resuspendre le culot dans cinq millilitres de tampon de lyse des globules rouges à température ambiante. Une fois en suspension, laisser agir cinq minutes pour la lyse à température ambiante. Ensuite, centrifuger l'échantillon à température ambiante pendant 15 minutes et terminer les étapes de séparation conformément au protocole écrit.

Le tri cellulaire adéquat est essentiel pour ce protocole. Tout d'abord, resuspendre les cellules dans du tampon FACS à raison d'un million de cellules par 100 microlitres, et les maintenir sur de la glace. Ensuite, transférer au moins 10 millions de cellules dans un tube à centrifuger en plastique placé sur de la glice, étiqueté BMPR-1B.

Transférez un million de cellules dans un tube sur glace étiqueté « non coloré » et ajoutez un millilitre de tampon FACS. Étiquetez les cellules restantes comme « non triées ». Ensuite, ajoutez l'anticorps au tube BMPR-1B et mélangez par pipetage doux pour homogénéiser.

Laisser ce mélange incuber pendant la durée recommandée par le fabricant. Ensuite, centrifuger les cellules pour le tri FACS et les resuspendre soigneusement dans un millilitre de tampon FACS. Puis, répéter l'opération et resuspendre les cellules à raison d'un million de cellules par millilitre.

Maintenant, faire passer les trois populations cellulaires à travers des tamis cellulaires de 40 microns dans des tubes FACS en verre. Utiliser 500 microlitres de tampon FACS pour rincer les dernières cellules des filtres. Préparer maintenant deux flacons de collecte, pour les populations positives et négatives à l'anticorps.

Chargez chacun avec deux millilitres de milieu de culture cellulaire standard, à la machine FACS, commencez par analyser les cellules non marquées, puis utilisez les résultats pour définir une porte négative pour le marqueur fluorescent. Ensuite, à l’aide d’un embout de 100 microns, triez les cellules marquées dans leurs tubes respectifs contenant le milieu standard. Si possible, maintenez ces tubes au frais à quatre degrés Celsius pendant le tri.

Procédez en chargeant les cellules dans l'échafaudage comme décrit dans le protocole écrit. Après avoir anesthésié l'animal, rasez tous les poils au niveau du site chirurgical et nettoyez la peau exposée avec une solution de povidone iodée suivie d'éthanol à 70 %, trois fois. Ensuite, recouvrez l'animal avec un champ opératoire, en laissant le site chirurgical exposé.

Maintenant, à l’aide d’un scalpel à lame 15, réalisez une incision sagittale médiane qui s’étend sur la majeure partie du crâne dorsal. Ensuite, à l’aide de pinces à dents fines, rétractez la peau du côté droit de l’incision afin d’exposer l’os pariétal droit. Installez le foret avec une mèche de trépan stérilisée de quatre millimètres de diamètre, revêtue de diamant.

Ensuite, percer un défaut à travers l'os pariétal, sans étendre le défaut au-delà de l'os, en laissant la couche de la dure-mère intacte. Placer maintenant une échafaudure contenant des cellules ou une solution témoin dans le défaut, puis fermer l'incision cutanée à l'aide d'un point de suture continu en nylon. Procéder ensuite aux protocoles de soins postopératoires de la souris conformément aux instructions du protocole écrit.

Des analyses micro-CT du défaut crânien réalisées le jour de l'intervention chirurgicale montrent clairement le nouveau défaut. Des analyses répétées à des temps ultérieurs montrent que les défauts ensemencés avec des cellules positives pour BMPR-1B se referment plus rapidement que ceux ensemencés avec des cellules négatives pour BMPR-1B ou des cellules non triées. Lorsque la cicatrisation est quantifiée en pourcentage de fermeture complète de la plaie, la différence est facilement perceptible.

Ensuite, les portions des crânes contenant les défauts ont été décalcifiées et colorées afin d'identifier le nouveau tissu osseux régénéré et le contrôle osseux en utilisant la pentachromie de Movat, qui permet de distinguer le cartilage de l'os, ainsi que tous les stades de maturation intermédiaires. Par rapport aux cellules non triées, les cellules positives pour BMPR-1B ont exercé un effet marqué sur le processus régénératif, particulièrement visible aux bords des défauts. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre le potentiel clinique de cette expérience, qui consiste à isoler des ASC spécifiques au patient et à les utiliser pour réparer des défauts osseux.

De nombreuses expériences en aval peuvent découler de celle-ci afin de répondre à des questions encore plus poussées sur la cicatrisation osseuse, comme la cytométrie en flux (FACS) pour l'isolement de cellules souches adipeuses (ASC) présentant différents engagements lignagiques, la micro-tomodensitométrie (micro CT) pour analyser la manière dont différents types cellulaires et tissus cicatrisent au fil du temps, ou encore le modèle de défaut crânien utilisé dans cette expérience, qui peut servir de base à de nouvelles réflexions sur des expériences de cicatrisation osseuse. N'oubliez pas que le travail avec des tissus humains peut présenter des risques extrêmement élevés. Veillez à prendre les précautions appropriées, notamment en portant des gants, en utilisant une protection oculaire et en éliminant correctement tous les déchets dangereux.