Détermination de l'échelle du génome de Timing de réplication mammalienne par l'ADN Mesure Contenu

L'objectif général de cette procédure est de cartographier le programme de chronologie de réplication à l'échelle du génome d'une cellule au choix. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la réplication, par exemple, comment le programme de réplication génomique évolue-t-il en santé et en maladie.

Le principal avantage de cette technique est qu'elle constitue un moyen rapide et simple de cartographier le moment de la réplication dans diverses cellules et conditions. La personne rédigeant la procédure de fax serait Dan Lehmann, un expert en fax à la Faculté de médecine. Cette procédure commence généralement avec au moins une à deux fois dix puissance six cellules en croissance rapide et non synchronisées.

Pour les cellules adhérentes, aspirez et lavez chaque plaque avec trois millilitres de PBS sans calcium ni magnésium. Jetez le PBS et ajoutez un millilitre de trypsine-EDTA commerciale à chaque plaque. Incubez les cellules pendant cinq minutes à 37 degrés Celsius, jusqu'à ce qu'elles se détachent.

Ajoutez trois millilitres de milieu de culture pour neutraliser la trypsine et recueillez les cellules dans un tube conique de 15 millilitres ou dans un tube en polystyrène de cinq millilitres. Maintenez les cellules sur de la glace. Pour commencer cette procédure, centrifugez les cellules à 300 x G pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius.

Aspirez et lavez les cellules avec un millilitre de PBS froid. Ensuite, centrifugez les cellules. Après le deuxième lavage, retirez le PBS et resuspendez les cellules dans 250 microlitres de PBS froid.

Tout en vortexant doucement le tube, ajouter goutte à goutte 800 microlitres d'éthanol à 100 % de haute pureté préalablement refroidi à moins 20 degrés Celsius. Ceci conduit à une concentration finale en éthanol comprise entre 70 et 80 pour cent. Incuber les cellules sur de la glace pendant 30 minutes.

Commencez cette procédure en centrifugeant les cellules fixées à 500 x G pendant dix minutes à 4 degrés Celsius. Aspirez soigneusement le surnageant et lavez les cellules deux fois avec un millilitre de PBS froid. Faites une centrifugation après chaque lavage.

Après le deuxième lavage, aspirez le surnageant et resuspendez chaque cellule dans une solution de PI composée comme suit : un millilitre de PBS contenant cinq microlitres d'ARNase à dix milligrammes par millilitre et 50 microlitres d'iodure de propidium à un milligramme par millilitre. Filtrez l'échantillon à travers une maille de 35 micromètres dans un tube en polystyrène de 5 millilitres.

Fermez le tube avec du parafilm. Incubez à température ambiante pendant 15 à 30 minutes. Conservez les échantillons à l’abri de la lumière, car l’iodure de propidium est sensible à la lumière.

Les cellules seront triées à l'aide d'un trieur cellulaire. Utilisez le laser de 561 nanomètres pour différencier les cellules selon leur intensité de propidium iodure. Pour des résultats optimaux, utilisez la buse la plus petite recommandée pour la taille spécifique des cellules.

Pour la plupart des cellules, cela correspond à 85 micromètres. Utilisez un débit régulier et lent. Généralement, jusqu'à 300 à 500 événements par seconde.

À l'aide du triage, distinguez les cellules mortes et les débris subcellulaires en traçant la FCS en fonction de la SSC. Parmi les cellules viables, discriminez les doublets en traçant la largeur SSC par rapport à la hauteur SSC, suivie d'un tracé de la largeur FFC en fonction de la hauteur FFC, puis d'un tracé de la largeur de l'iodure de propidium par rapport à la hauteur de l'iodure de propidium. Pour les cellules signal viables, tracez un histogramme de l'intensité de la surface de l'iodure de propidium, qui représente la teneur en ADN des cellules.

Trier les cellules dans des conditions froides en phases G1 et S. La fenêtre pour la phase S doit être large et empiéter sur les phases G1 et G2. En revanche, la fenêtre pour la phase G1 doit être étroite et située aussi loin que possible de la phase S.

Pour certains types cellulaires, il peut être difficile d'obtenir une distribution satisfaisante du cycle cellulaire. Il est essentiel de prélever la phase G1 sans les cellules en phase S. Retirez les tubes contenant les cellules triées du fax.

Gardez les tubes sur de la glace après le tri. Après le tri cellulaire, l'ADN de chaque échantillon est purifié à l'aide d'un kit commercial de purification de l'ADN, conformément aux instructions du fabricant. Ensuite, fragmentez l'ADN à l'aide d'un ultrasonicateur focalisé jusqu'à une taille moyenne cible de 250 paires de bases.

Vérifiez la taille de l'ADN fragmenté par électrophorèse. La distribution de taille recommandée est de 200 à 700 paires de bases, avec un pic vers environ 250 paires de bases. Ensuite, la banque est préparée, séquencée et analysée comme décrit dans le protocole textuel.

Une carte temporelle de réplication pour l'ensemble du chromosome un provenant de fibroblastes embryonnaires de souris est présentée. Un zoom est effectué sur une région d'environ 50 mégabases. Les points représentent le ratio S/G1 normalisé pour chaque fenêtre individuelle, et la ligne continue représente les résultats obtenus par une interpolation cubique lissée.

Des valeurs élevées de S par rapport à G1 correspondent à une réplication précoce, tandis que des valeurs faibles correspondent à une réplication tardive. Les flèches rouges indiquent des exemples de régions ayant un temps de réplication constant, et les flèches vertes indiquent des régions de transition temporelle. Cette figure illustre la reproductibilité des cartes de temps de réplication entre des triplicats de fibroblastes embryonnaires de souris, comparés à des triplicats de cellules pré-B de souris dans la même région de 18 mégabases sur le chromosome un de la souris.

Les flèches oranges indiquent des exemples de régions différentielles entre les lignées cellulaires. Une carte thermique des corrélations de Spearman entre les six échantillons confirme davantage les résultats. Une fois maîtrisée, cette technique, de la collecte des cellules à la génération des cartes, peut être réalisée en une semaine si elle est effectuée correctement.

Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment générer des cartes génomiques de l'heure de réplication pour des cellules en croissance.