Système d'expression multigène médié par l'ARN T7 à ADN polymère induible, pMGX

L'objectif général de cette procédure est de construire des opérons synthétiques multigéniques sous le contrôle d'une ARN polymérase T7 inductible afin d'exprimer simultanément plusieurs protéines. Cette méthode peut aider les chercheurs en biologie synthétique et en biochimie à concevoir des voies métaboliques multi-protéiques ou à étudier des complexes protéiques dépendant de la co-expression. Le principal avantage de cette technique réside dans sa capacité à exprimer simultanément plusieurs gènes dans Escherichia coli à partir d'un seul plasmide.

La procédure sera démontrée par Mohamed Hassan, étudiant au doctorat, et Angela Thompson, étudiante en stage coopératif. Après avoir obtenu et amplifié les gènes d'intérêt conformément au protocole décrit, préparez les réactions de digestion pour le premier gène d'intérêt et le facteur pMGX. Utilisez une réaction de 40 microlitres contenant de 0,5 à 1,5 microgrammes d'ADN dans l'enzyme indel.

Incuber les réactions à 37 degrés Celsius pendant une heure. Ajouter ensuite EcoRI et laisser la digestion se poursuivre pendant une heure supplémentaire. NdeI est ajouté avant EcoRI afin de garantir une digestion efficace.

NdeI est sensible à la longueur d'ADN double brin située de part et d'autre du site de restriction. L'ajouter en premier garantit qu'il coupe le plasmide circulaire complet. Charger les réactions de digestion sur un gel d'agarose à 0,7 % et faire migrer les échantillons par électrophorèse à 100 volts pendant 55 minutes.

Ensuite, à l’aide d’un scalpel ou d’une lame de rasoir propre, excisez les bandes d’insert et de vecteur et placez les fragments de gel excisés dans des tubes de 1,5 millilitre. Utilisez un kit d’extraction de gel conformément au protocole indiqué pour purifier l’ADN. Préparez une réaction de ligation de 20 microlitres contenant de 0,15 à 0,5 microgramme d’ADN vecteur, la quantité appropriée d’insert en fonction de la taille du gène et un microlitre de ligase T4 de l’ADN.

Dans des conditions aseptiques, décongeler sur de la glace des aliquotes de 100 microlitres de cellules E.coli chimiquement compétentes XL1-Blue pendant cinq minutes. Ajouter ensuite cinq microlitres des réactions de ligation contenant un gène d'intérêt aux cellules. Incuber les transformations sur de la glace pendant 30 minutes.

Ensuite, soumettez les cellules à un choc thermique pendant 45 secondes dans un bain-marie à 42 degrés Celsius. Puis, placez les transformations sur de la glace et ajoutez 200 microlitres de milieu LB froid. Laissez les cellules incuber pendant deux minutes.

Incuber les cellules à 37 degrés Celsius à 220 tours par minute pendant une heure et déposer 100 microlitres sur des boîtes de gélose LB contenant un marqueur de sélection approprié. Pour cribler les colonies afin d'identifier d'éventuels transformants, comparer le nombre de colonies sur le témoin négatif et sur les boîtes de ligation. Un ratio de dénombrement des colonies de un à deux est souhaité.

Sélectionner quatre à huit colonies individuelles de chaque réaction de ligation pour ensemencer 4 millilitres de LB contenant l'antibiotique approprié. Incuber les cultures à 37 degrés Celsius et 220 tours par minute pendant la nuit. À l'aide du kit d'isolement de l'ADN plasmidique, purifier l'ADN plasmidique selon le protocole indiqué et préparer des réactions de digestion de 20 microlitres contenant 150 à 500 nanogrammes d'ADN, en utilisant un microlitre chacun de NdeI et d'EcoRI.

Incuber les réactions de digestion à 37 degrés Celsius pendant deux heures. Pour insérer le gène deux dans le vecteur pMGX contenant le gène un, préparer une réaction de digestion de 40 microlitres contenant 0,5 à 1,5 microgrammes d'ADN vecteur contenant le premier gène d'intérêt et un microlitre d'AVR2. Incuber la réaction à 37 degrés Celsius pendant 1,5 heure avant d'ajouter 1,5 microlitre de phosphatase de l'intestin de veau.

Incuber pendant 30 minutes supplémentaires. Ensuite, préparer une réaction de digestion de 40 microlitres contenant 0,5 à 1,5 microgrammes du vecteur pMGX portant le deuxième gène d'intérêt. Utiliser un microlitre d'AVR2 et de xpol.

Incuber la réaction à 37 degrés Celsius pendant deux heures. Séparer les produits de restriction sur un gel d'agarose à 0,7 % par électrophorèse. Utiliser une gomme de scalpel propre pour exciser les bandes d'insert et de vecteur comme indiqué précédemment.

Après avoir extrait l'ADN plasmidique et quantifié l'échantillon selon le protocole indiqué, préparez une réaction de ligation en utilisant un rapport insert/vecteur de 3:1 entre le gène 2 et pMGX-yfg1. Incluez un témoin négatif utilisant uniquement pMGX-yfg1. Transformez cinq microlitres de chaque réaction dans des cellules XL1-Blue comme indiqué précédemment.

Ensuite, comparez le nombre de colonies sur les plaques de contrôle négatif et sur les plaques de ligation. S'il y a un grand nombre de colonies sur la plaque de contrôle négatif, revoir le traitement par la CIP. Sélectionnez quatre à huit colonies individuelles issues de la réaction de ligation et utilisez chaque colonie pour ensemencer quatre microlitres de milieu LB additionné de l'antibiotique approprié.

Faire croître à 37 degrés Celsius et 220 tours par minute pendant la nuit. Après avoir isolé et quantifié l'ADN plasmidique comme précédemment, rechercher l'insertion efficace du second gène en mettant en place une réaction de digestion contenant 150 à 500 nanogrammes d'ADN et un microlitre d'EcoRI. Incuber les réactions à 37 degrés Celsius pendant deux heures.

On recommande EcoRI à des fins de criblage, mais dans certains cas, EcoRI peut générer deux inserts ou plus de taille similaire, difficiles à distinguer sur un gel. Pour garantir la réussite, un enzyme de restriction alternatif tel que NdeI doit être utilisé. Séparer les réactions de digestion sur un gel d'agarose, en recherchant une bande correspondant à la taille du gène inséré 2.

Cloner des gènes supplémentaires dans le plasmide selon le protocole décrit. Pour générer le plasmide polycistronique, les cinq gènes ont d'abord été clonés dans un plasmide approprié, le pMGX A. Cette figure montre les constructions pCR-Blunt-yfg1 et pCR-Blunt-yfg2 dans le plasmide pMGX A, ainsi que le pMGX A digéré par indel et EcoRI. Pour cloner les deux premiers gènes dans pMGX A, le plasmide a été digéré par indel et EcoRI.

Après le clonage, les plasmides pMGX-yfg1 et pMGX-yfg2 ont été digérés avec AVR2 et xpol afin de confirmer l'obtention de clones corrects. Cette figure montre le vecteur pMGXyfg1 digéré avec AVR2 et le vecteur pMGX-yfg2 digéré avec AVR2 et xpol, permettant d'isoler le gène d'intérêt deux. L'insert résultant a été cloné dans pMGX-yfg1 pour créer le vecteur pMGX-yfg1 deux.

Comme on le voit ici, la digestion de pMGX-yfg1 deux par EcoRI a confirmé le clonage réussi du gène d'intérêt numéro deux dans pMGX-yfg1. Cette image de gel illustre la différence entre les plasmides digérés ayant soit l'insertion dans l'orientation correcte, soit dans une orientation inverse. Une insertion en orientation inverse présenterait deux sites EcoRI en proximité étroite, rendant les fragments résultants de 50 paires de bases indétectables sur le gel et augmentant la taille du squelette plasmidique.

Enfin, après la génération d'un vecteur d'expression polycistronique à cinq gènes, un immunotransfert (western blot) des protéines exprimées confirme que les cinq protéines ont été exprimées à partir d'un seul vecteur. Notez que la protéine produite par yfg5 a la même taille que celle de yfg1 et n'est pas séparée sur le gel. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en trois à quatre jours pour chaque gène inséré dans le squelette pMGX, à condition qu'elle soit effectuée correctement.

Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de se rappeler de traiter et de linéariser le vecteur avec une phosphatase telle que la phosphatase de l'intestin de veau afin de déphosphoryler les cinq extrémités du vecteur. Après cette procédure, d'autres expériences, telles que l'expression multigénique in vivo, peuvent être réalisées afin de caractériser et d'exploiter des voies biosynthétiques pour la production de produits naturels ou l'étude de complexes protéine-protéine. Cette technique a ouvert la voie aux chercheurs du domaine de la biologie synthétique pour produire des glucides complexes et des souches d'E. coli génétiquement modifiées.

Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la mise en œuvre du système d'expression multigénique chez E.coli.