L'immunohistochimie sur coupes en paraffine d'épiderme de souris en utilisant des anticorps fluorescents

Dans l’épiderme. L’immunohistochimie est un moyen efficace de localiser des protéines spécifiques dans leur compartiment d’expression. Dans cette vidéo, nous démontrons une méthode fiable d’immunolocalisation des protéines dans l’épiderme, que nous utilisons régulièrement dans notre laboratoire.

Bonjour, je m’appelle Tammy et je travaille au laboratoire du Dr Turin, dans le bas pavillon de l’Institut de recherche en santé d’Ottawa, dans le cadre du programme des maladies chroniques. Aujourd’hui, nous allons vous montrer une procédure d’immunohistochimie utilisant des anticorps fluorescents sur des coupes de tissus inclus dans la paraffine de l’épiderme de souris. Dans notre laboratoire, nous avons optimisé des protocoles d’immunolocalisation des marqueurs de différenciation épidermique à l’aide du tissu fixé de BO.

Dans le cadre de l’optimisation, nous gardons la peau plate en la disposant sur du papier absorbant avant de la fixer. Cette procédure implique la dissection de l’épiderme, la fixation, la déshydratation, l’enrobage de paraffine et la coupe de section, l’épilation, la réhydratation, le démasquage de l’antigène, le marquage des anticorps et, enfin, le montage et la visualisation avec épifluorescence. Alors commençons.

Lors de l’utilisation de souris néonatales, il n’est pas nécessaire de raser la peau du dos. Cependant, lorsque vous avez des souris plus âgées qui ont de la fourrure, vous devez raser la peau du dos afin qu’elle ne gêne pas la coupe des sections. Lorsque vous faites votre dissection, vous devez faire très attention à ne pas mettre vos pinces dans les zones de la peau que vous souhaitez utiliser pour votre dosage.

Donc, ce que nous faisons, c’est que nous mettons simplement la pince autour du bord de l’endroit où nous allons couper, puis vous soulevez très soigneusement, coupez l’épiderme, en vous rappelant de ne pas toucher la zone que vous voulez utiliser pour votre expérience. Lorsque nous réparons la peau, nous ne voulons pas que la peau s’enroule et se retrouve dans le tube. Nous voulons qu’il soit beau et plat.

Donc, ce que nous faisons pour aider cela, c’est que nous posons la peau sur une serviette en papier afin qu’elle reste plate pendant qu’elle est réparée. Donc, maintenant que nous avons la peau bien à plat sur la serviette en papier, ce que nous faisons, c’est couper les bords ou nous les coupons afin de retirer les parties que nous avons pu endommager avec la pince. Ensuite, vous coupez la peau en très petits morceaux d’environ deux millimètres sur deux millimètres.

Maintenant, le tissu va être réparé. Après avoir coupé la peau en morceaux gérables, vous la plongez dans la solution de boin. Bouchez les tubes, enveloppez les tubes avec du perfil et placez-les sur une bascule.

Pour une incubation d’une nuit, il est important de ne faire incuber dans la solution boin que 16 à 18 heures. Des périodes de fixation plus courtes ou plus longues endommageront votre volonté tissulaire. L’incubation est terminée.

Vous rincez votre mouchoir avec du PBS, puis vous effectuez une série de lavages à l’éthanol en utilisant de l’alcool à 30 %, 50 % et 70 %. Vous pouvez voir que le BO est de couleur jaune et qu’au fur et à mesure que vous faites les lavages, au fur et à mesure que les bienfaits sont dilués, la couleur du lavage devient de moins en moins jaune. Vous vous lavez deux fois 30 minutes à chaque fois.

Après le dernier lavage à l’éthanol, les échantillons sont placés dans un nouvel éthanol à 70 % et peuvent être stockés à quatre degrés Celsius jusqu’à ce qu’ils soient traités ultérieurement avec quelques évents de paraffine. Encastrement. L’utilisation excessive de tissus congelés signifie que l’intégrité des tissus est supérieure et que les échantillons peuvent être stockés pendant de longues périodes. En général, les plateformes génèrent des résultats plus reproductibles.

Cependant, si vous disposez de l’installation et d’un opérateur dédié qui possède l’expertise, les sections peuvent être coupées en interne. Apprendre à couper de bonnes sections est plutôt une forme d’art. Par conséquent, nous utilisons une plate-forme.

Après avoir reçu les lames de la plate-forme, vous pouvez voir que la paraffine est présente sur les lames. Sous la forme d’une fine pellicule, les lames sont placées sur une grille enveloppée de papier d’aluminium, tout comme une pomme de terre cuite au four, et incubées pendant cinq minutes à 55 degrés. Une fois votre incubation terminée, déballez rapidement les lames et placez-les dans du toluène pendant trois lavages de cinq minutes.

Il est très important de se rappeler que ces rondelles de cinq minutes doivent être bien chronométrées, incuber trop longtemps, et le toluène ne sera pas bon pour vos échantillons. Après vos trois lavages et le toluène, faites un rinçage rapide à l’éthanol à cent pour cent. Étant donné que l’éthanol et le toluène forment un précipité qui interférera avec votre expérience, il s’agit d’une étape très importante à retenir.

Ensuite, les échantillons sont réhydratés par des lames d’incubation, cinq minutes dans de l’éthanol à 95 %, cinq minutes dans de l’éthanol à 70 %, puis deux fois cinq minutes dans de l’eau. À ce stade, les tissus peuvent être traités pour la coloration avec h et e. Nous utilisons également l’installation centrale à cette fin.

Pour le démasquage de l’antigène, utilisez 500 mils de tampon de citrate unique dans un bécher en plastique d’un litre et plongez vos lames. N’oubliez pas de retirer la poignée métallique et de mettre votre bécher dans le micro-ondes. Micro-ondes à puissance élevée pendant deux fois cinq minutes.

N’oubliez pas d’ouvrir la porte pour refroidir le micro-ondes entre vos deux incubations. Une fois votre micro-ondes terminé, retirez les lames du tampon de citrate bouillant et placez-les dans un plat de coloration contenant de l’eau tiède. Nous utilisons simplement de l’eau chaude du robinet et le but est de refroidir lentement vos lames de l’ébullition à la température ambiante.

Maintenant, vous pouvez laver les lames trois fois cinq fois dans le PBS et nous sommes prêts à commencer l’immunohistochimie. La première chose que nous devons faire pour commencer l’immunocoloration est de sécher la zone autour de nos échantillons avec un morceau de papier de soie. Afin d’éviter la contamination croisée par les anticorps, nous délimitons la zone autour de nos échantillons à l’aide d’un bloqueur de liquide.

Préparez une chambre humidifiée en mettant un papier filtre dans une boîte de Pétri. Trempez-le dans de l’eau, retirez l’excès d’eau et insérez vos lames. La raison pour laquelle nous utilisons une chambre humidifiée est de nous assurer que pendant nos périodes d’incubation, nos lames ne se dessèchent pas.

Il est très important que les diapositives ne sèchent pas car le dessin augmentera votre arrière-plan. Les lames sont bloquées à ce moment avec un tampon d’incubation pendant 30 minutes. Après le blocage, transférez vos diapositives dans le support à lames et incubez-les dans un tampon de lavage.

Retirez l’excédent de tampon comme vous l’avez fait auparavant. Remettez la lame dans la chambre humidifiée et incubez avec l’anticorps primaire pendant une heure. À température ambiante.

Lorsque votre incubation d’une heure est terminée, remettez les lames dans le support à lames et lavez-les avec un tampon de lavage pendant trois fois 10 minutes. Après vos lavages, retirez l’excédent de tampon de lavage autour de votre échantillon avec un papier de soie. Remettez les lames dans la chambre humidifiée et incubez pendant une heure à température ambiante avec un anticorps secondaire après avoir incubé avec un anticorps secondaire, lavez en trois fois le tampon de lavage 15 minutes chacun.

Ensuite, nous lavons en trois fois cinq minutes. Dans le PBS, retirez tout excès de liquide entourant l’échantillon et essuyez le PBS loin de l’arrière de la lame pour monter les lamelles de recouvrement sur la lame. Nous utilisons mobile avec 2,5 %DAB co.

Afin de réduire la décoloration, ajoutez 80 microlitres de dropwise sur les lames. Attention à ne pas introduire de bulles. Puis abaissez très lentement sur une lamelle.

En prenant soin de ne pas laisser de bulles derrière vous. Les bulles sont mauvaises parce qu’elles atterrissent souvent sur votre échantillon, là où vous voulez prendre vos photos une fois que votre mobile est sec. Vous êtes maintenant prêt à partir Regardez vos diapositives.

Voici un aperçu d’une coloration réussie à l’aide d’un filtre FITC. Dans un objectif de 20 x, nous voyons Clain six associé à toutes les couches super basales de l’épiderme. Notre laboratoire s’intéresse beaucoup à l’expression et à la localisation des claudines dans l’épiderme.

En ce qui concerne les jonctions serrées et la formation de la barrière de perméabilité épidermique, nous venons de vous montrer comment effectuer l’immunohistochimie sur la peau de la souris. Lorsque vous effectuez cette procédure, il est important de se rappeler que vous voulez que vos sections de tissus soient plates et que vous voulez vous assurer que vos lames ne se dessèchent pas entre les incubations. Donc c’est tout.

Merci d’avoir regardé et bonne chance dans vos expériences.