Name: Dissection de tissu gonadique Larval Zebrafish (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-04-26T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 43 s
Description: Découvrez la dissection de tissu gonadique chez les larves de zebrafish dès 17 jours post-fécondation. Cette technique permet d'analyser les propriétés moléculaires et d'étudier la différenciation sexuelle chez Danio rerio.

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Nous remercions C Zhang pour les soins de poissons. Ce travail a été soutenu par la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (31171074, 31371099 et 31571067 GP) et par le projet Talent Pujiang (09PJ1401900 GP).

des expériences ont été approuvées par le poisson-zèbre le soin des animaux Université Fudan Comité institutionnel. Zebrafish ont été soulevées et élevés selon des procédures standard 20. 1. Préparation <ol><li> Cultiver 17 dpf et 25 dpf zebrafish larvaire <ol><li> Transfert 2 hommes et 2 femmes adultes poisson zèbre (santé, 3 à 6 mois, la souche de laboratoire AB) à un réservoir de passage dans l&#39;après-midi avant le jour de passage. Séparer les hommes et les femmes avec une barrière. Le lendemain matin, rafraîchir l&#39;eau du réservoir et enlever la barrière pour leur permettre de s&#39;accoupler. Recueillir des œufs à 100 mm des boîtes de Petri 1 à 2 h après la fécondation. </li><li> Gardez environ 40 embryons dans une plaque de 100 mm avec 40 ml de milieu d&#39;embryon (EM) à 28,5 ° C au cours de la première période de développement (4 jours) et rafraîchir l&#39;EM deux fois par jour. Transfert des larves à 1 réservoirs L (40 larves à 300 ml d&#39;eau du système) et alimenter avec rotifères en direct (alimentation complète, deux fois par jour) après 5 dpf.Nourrissez les crevettes de saumure en direct au lieu de l&#39;alimentation des rotifères après 10 dpf. Transférer le poisson dans le système d&#39;eau de recirculation à 14 dpf 21. </li><li> Élever des larves de poisson zèbre dans le système d&#39;eau en recirculation a 17 dpf ou 25 dpf. Assurer que le cycle lumière / obscurité est 14/10 h et valeur pH de l&#39;eau du système est d&#39;environ 7,2. Mesurer la longueur de corps de 17 dpf (5.5 à 6.8 mm) et 25 dpf (8 à 11 mm) 22 larves. </li></ol></li><li> Préparer 2% des plaques d&#39;agar pour la dissection. <ol><li> Ajouter 4 g d&#39;agar à 200 ml d&#39;eau stérile. Faire chauffer le mélange dans un four à micro-ondes jusqu&#39;à ce qu&#39;il devienne transparent. </li><li> On refroidit la solution de gélose pendant environ 15 min, puis le verser dans de 60 mm de diamètre des boîtes de Petri (environ 1/3 du volume de la plaque). Conserver les plaques d&#39;agar solidifiées à 4 ° C. </li></ol></li></ol> 2. Protocole 1: Disséquer le gonades de 17 et 25 dpf Larves <ol><li> Ajouter de la glace pilée dans le réservoir pour anesthésier 17 larves de dpf. transférer lalarves anesthésié à une boîte de Petri réfrigérées 100 mm avec une solution de 30 ml à froid Ringer. Gardez le poisson dans la incubée solution de Ringer refroidie pendant au moins 15 min pour anesthésier complètement les larves. </li><li> Transfert des larves à une plaque de gélose prérefroidi avec une petite cuillère en plastique. Immerger le corps entier de poisson dans 10 ml réfrigérées solution de Ringer et le poser délicatement sur le côté. </li><li> Les opérations suivantes dans le champ de vision du microscope stéréo 25X. Fixer le tronc de poisson avec des pincettes pour la stabilisation. Extraire l&#39;abdomen longitudinalement à partir de l&#39;anus vers le cœur avec une autre paire de pinces à épiler. Retirez délicatement la peau et les muscles d&#39;un côté du corps pour exposer les organes internes. </li><li> Retirer la masse des organes ventrales à la vessie natatoire soigneusement. Evitez d&#39;endommager la gonade attachée à la vessie natatoire. </li><li> Coupez la connexion entre la vessie natatoire et le corps antérieur. Tirer sur toute la vessie natatoire et le tissu gonadique doucement. NOTE: Dans la plupart des cass, le tissu gonadique à 17 dpf contient entourant le tissu épithélial et protonephridium. Ils ne sont pas facilement séparés les uns des autres, mais à 25 dpf il peut être facilement séparés. La gonade est également reliée à l&#39;anus. Une jonction avec gonades gauche et à droite reliés entre eux à l&#39;anus sera clairement visible. </li><li> Utiliser des pinces pour séparer soigneusement le tissu gonadique de la vessie natatoire et nettoyer les tissus adipeux environnants. </li><li> Transférer immédiatement le tissu gonadique isolé à un prérefroidi tube de centrifugation de 1,5 ml contenant une solution de 200 ul Ringer. Gardez le tube sur la glace jusqu&#39;à ce que tous les tissus gonadiques sont séparés des larves. </li><li> Disséquer les gonades de 25 dpf larves comme décrit dans les étapes 2.1 - 2.7. </li></ol> 3. Protocole 2: analyser l&#39;expression génique des tissus isolés gonadiques <ol><li> Extrait ARN total des tissus gonadiques larves. <ol><li> Transférer les tissus gonadiques isolés à une nouvelle RNase 1.tube 5 ml et retirer la solution de Ringer. Ajouter 100 ul d&#39;une solution de lyse. Vortex jusqu&#39;à ce que les tissus sont complètement lysées. </li><li> Effectuez la procédure totale d&#39;extraction d&#39;ARN selon les instructions du fabricant. </li><li> Ajouter 1/10 du volume de la DNase I 10x tampon et 1 ul de DNase I à la solution d&#39;ARN et mélanger doucement. Incuber pendant 20 min à 37 ° C. </li><li> Ajouter 1/10 de volume réactif d&#39;inactivation de DNase à la solution d&#39;ARN. Incuber pendant 10 min à 70 ° C. Mesurer la concentration de l&#39;ARN total en utilisant un spectrophotomètre. Conserver à -20 ° C. </li></ol></li><li> Effectuer la synthèse d&#39;ADNc du premier brin <ol><li> Utiliser une amorce lieur oligo (dT) pour effectuer la synthèse d&#39;ADNc du premier brin suivant le protocole du fabricant. Ajouter de 1 à 2 ug d&#39;ARN à un volume réactionnel total de 20 ul. </li><li> Incuber la solution réactionnelle pendant 90 minutes à 45 ° C. Terminer la réaction par chauffage à 70 ° C pendant 5 min. </li><li> Ajouter 1 pi de RNase H à l&#39;ADNc de manièrelution pour éliminer l&#39;ARN résiduel. Mélanger doucement et centrifuger pendant 10 s à ~ 13 000 x g. Incuber pendant 20 min à 37 ° C. Ajouter 20 ul nucléase d&#39;eau libre. Stocker à -70 ° C. </li></ol></li><li> Effectuer une PCR quantitative fluorescent <ol><li> Effectuer qPCR sur un système cycleur avec un colorant fluorescent. Utiliser les conditions de cycle de PCR suivantes: 35 cycles à 95 ° C pendant 15 s, Tm-5 ° C pendant 15 s, 68 ° C pendant 30 s. Utilisation des séquences d&#39; amorces comme suit: AMH (FWD: GTGGATGGCAGCAGTACGAC; rev: GCGGAGAGGTGGAAGAGAGAATG), cyp19a1a (FWD: GTCCTGTTGTCTCCTACTGTCG; rev: CATTTGAGTTGAATATGATGCCCTG), nanos3 (FWD: GCTCGGTGTACGCCAAATCAACAT; rev: CCAAGTGAAAACACAACACCAGTGC), vasa (FWD: ATCGCATAGGAAGAACTGGACGCT; rev: CCAAGTGAAAACACAACACCAGTGC) et β-actine (Fwd: AGTGCGACGTGGACATCCGTA; rev: GCACTTCCTGTGGACGATGGA) 19. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Wilson, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wild+sex+in+zebrafish%3A+loss+of+the+natural+sex+determinant+in+domesticated+strains%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Wild sex in zebrafish: loss of the natural sex determinant in domesticated strains.</a> Genetics. 198 (3), 1291-1308 (2014).</li>
<li>Liew, W. C., Orban, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+sex%3A+a+complicated+affair%5BTitle%5D)+AND+%22Genomics%22%5BJournal%5D)">Zebrafish sex: a complicated affair.</a> Genomics. 13 (2), 172-187 (2014).</li>
<li>Orban, L., Sreenivasan, R., Olsson, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long+and+winding+roads%3A+Testis+differentiation+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Long and winding roads: Testis differentiation in zebrafish.</a> Mol. Cell. Endocrinol. 312 (1-2), 35-41 (2009).</li>
<li>Blaser, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transition+from+non-motile+behaviour+to+directed+migration+during+early+PGC+development+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Transition from non-motile behaviour to directed migration during early PGC development in zebrafish.</a> J. Cell Sci. 118, 4027-4038 (2005).</li>
<li>Wang, X. G., Orban, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anti-M%C3%BCllerian+hormone+and+11+%CE%B2-hydroxylase+show+reciprocal+expression+to+that+of+aromatase+in+the+transforming+gonad+of+zebrafish+males%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Dynam%22%5BJournal%5D)">Anti-Müllerian hormone and 11 β-hydroxylase show reciprocal expression to that of aromatase in the transforming gonad of zebrafish males.</a> Dev. Dynam. 236 (5), 1329-1338 (2007).</li>
<li>Siegfried, K. R., Nüsslein-Volhard, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Germ+line+control+of+female+sex+determination+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Germ line control of female sex determination in zebrafish.</a> Dev. Biol. 324 (2), 277-287 (2008).</li>
<li>Uchida, D., Yamashita, M., Kitano, T., Iguchi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oocyte+apoptosis+during+the+transition+from+ovary-like+tissue+to+testes+during+sex+differentiation+of+juvenile+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Biol%22%5BJournal%5D)">Oocyte apoptosis during the transition from ovary-like tissue to testes during sex differentiation of juvenile zebrafish.</a> J. Exp. Biol. 205 (Pt 6), 711-718 (2002).</li>
<li>Groh, K. J., Schönenberger, R., Eggen, R. I. L., Segner, H., Suter, M. J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+protein+expression+in+zebrafish+during+gonad+differentiation+by+targeted+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Gen.+Comp.+Endocr%22%5BJournal%5D)">Analysis of protein expression in zebrafish during gonad differentiation by targeted proteomics.</a> Gen. Comp. Endocr. 193, 210-220 (2013).</li>
<li>Siegfried, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+search+of+determinants%3A+gene+expression+during+gonadal+sex+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Fish+Biol%22%5BJournal%5D)">In search of determinants: gene expression during gonadal sex differentiation.</a> J. Fish Biol. 76 (8), 1879-1902 (2010).</li>
<li>Small, C. M., Carney, G. E., Mo, Q., Vannucci, M., Jones, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microarray+analysis+of+sex-+and+gonad-biased+gene+expression+in+the+zebrafish%3A+evidence+for+masculinization+of+the+transcriptome%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">A microarray analysis of sex- and gonad-biased gene expression in the zebrafish: evidence for masculinization of the transcriptome.</a> BMC Genomics. 10, 579(2009).</li>
<li>Chiang, E. F., Yan, Y. L., Guiguen, Y., Postlethwait, J., Chung, B. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/11264405">Two Cyp19 (P450 aromatase) genes on duplicated zebrafish chromosomes are expressed in ovary or brain.</a> Mol. Biol. Evol. 18 (4), 542-550 (2001).</li>
<li>Kishida, M., Callard, G. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+cytochrome+P450+aromatase+isoforms+in+zebrafish+%28Danio+rerio%29+brain+and+ovary+are+differentially+programmed+and+estrogen+regulated+during+early+development%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Distinct cytochrome P450 aromatase isoforms in zebrafish (Danio rerio) brain and ovary are differentially programmed and estrogen regulated during early development.</a> Endocrinology. 142 (2), 740-750 (2001).</li>
<li>Rodríguez-Marí, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+and+expression+pattern+of+zebrafish+anti-M%C3%BCllerian+hormone+%28amh%29+relative+to+sox9a%2C+sox9b%2C+and+cyp19a1a%2C+during+gonad+development%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Expr.Patterns%22%5BJournal%5D)">Characterization and expression pattern of zebrafish anti-Müllerian hormone (amh) relative to sox9a, sox9b, and cyp19a1a, during gonad development.</a> Gene Expr.Patterns. 5 (5), 655-667 (2005).</li>
<li>Krovel, A. V., Olsen, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+a+vas%3A%3AEGFP+transgene+in+primordial+germ+cells+of+the+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Mech+Dev%22%5BJournal%5D)">Expression of a vas::EGFP transgene in primordial germ cells of the zebrafish.</a> Mech Dev. 116 (1-2), 141-150 (2002).</li>
<li>Krovel, A. V., Olsen, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sexual+dimorphic+expression+pattern+of+a+splice+variant+of+zebrafish+vasa+during+gonadal+development%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Sexual dimorphic expression pattern of a splice variant of zebrafish vasa during gonadal development.</a> Dev. Biol. 271 (1), 190-197 (2004).</li>
<li>Tzung, K. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+depletion+of+primordial+germ+cells+in+zebrafish+promotes+testis+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Early depletion of primordial germ cells in zebrafish promotes testis formation.</a> Stem Cell Reports. 4 (1), 61-73 (2015).</li>
<li>Hsiao, C., Tsai, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenic+zebrafish+with+fluorescent+germ+cell%3A+a+useful+tool+to+visualize+germ+cell+proliferation+and+juvenile+hermaphroditism+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Transgenic zebrafish with fluorescent germ cell: a useful tool to visualize germ cell proliferation and juvenile hermaphroditism in vivo.</a> Dev. Biol. 262 (2), 313-323 (2003).</li>
<li>Jorgensen, A., Nielsen, J. E., Morthorst, J. E., Bjerregaard, P., Leffers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser+capture+microdissection+of+gonads+from+juvenile+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Reprod+Biol+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Laser capture microdissection of gonads from juvenile zebrafish.</a> Reprod Biol Endocrinol. 7, 97(2009).</li>
<li>Chen, S., Zhang, H., Wang, F., Zhang, W., Peng, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((nr0b1+%28DAX1%29+mutation+in+zebrafish+causes+female-to-male+sex+reversal+through+abnormal+gonadal+proliferation+and+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">nr0b1 (DAX1) mutation in zebrafish causes female-to-male sex reversal through abnormal gonadal proliferation and differentiation.</a> Mol. Cell. Endocrinol. 433, 105-116 (2016).</li>
<li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWesterfield%2C+M+%22The+Zebrafish+Book%3A+A+Guide+for+The+Laboratory+Use+of+Zebrafish+%28Danio+rerio%29%22">The Zebrafish Book: A Guide for The Laboratory Use of Zebrafish (Danio rerio)</a>. , Eugene: University of Oregon Press. University of Oregon. (2000).</li>
<li>Liew, W. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polygenic+sex+determination+system+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Polygenic sex determination system in zebrafish.</a> PLoS One. 7 (4), e34397(2012).</li>
<li>Parichy, D. M., Elizondo, M. R., Mills, M. G., Gordon, T. N., Engeszer, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Normal+table+of+postembryonic+zebrafish+development%3A+staging+by+externally+visible+anatomy+of+the+living+fish%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">Normal table of postembryonic zebrafish development: staging by externally visible anatomy of the living fish.</a> Dev Dyn. 238 (12), 2975-3015 (2009).</li>
<li>Gupta, T., Mullins, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissection+of+Organs+from+the+Adult+Zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Dissection of Organs from the Adult Zebrafish.</a> J. Vis Exp. (37), (2010).</li>
<li>Arnaout, R., Reischauer, S., Stainier, D. Y. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recovery+of+Adult+Zebrafish+Hearts+for+High-throughput+Applications%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Recovery of Adult Zebrafish Hearts for High-throughput Applications.</a> J. Vis Exp. (94), (2014).</li>
<li>Gerlach, G. F., Schrader, L. N., Wingert, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissection+of+the+Adult+Zebrafish+Kidney%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Dissection of the Adult Zebrafish Kidney.</a> J. Vis Exp. (54), (2011).</li>
<li>Yoon, C., Kawakami, K., Hopkins, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+vasa+homologue+RNA+is+localized+to+the+cleavage+planes+of+2-+and+4-cell-stage+embryos+and+is+expressed+in+the+primordial+germ+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Zebrafish vasa homologue RNA is localized to the cleavage planes of 2- and 4-cell-stage embryos and is expressed in the primordial germ cells.</a> Development. 124 (16), 3157-3165 (1997).</li>
<li>Braat, A. K., Speksnijder, J. E., Zivkovic, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Germ+line+development+in+fishes%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Germ line development in fishes.</a> Int. J. Dev. Biol. 43 (7), 745-760 (1999).</li>
<li>Huang, H. Y., Ketting, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+zebrafish+gonads+for+RNA+isolation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Isolation of zebrafish gonads for RNA isolation.</a> Methods Mol Biol. 1093, 183-194 (2014).</li>
</ol>

Les auteurs déclarent qu&#39;ils ont pas d&#39;intérêts financiers concurrents.

Le poisson zèbre est devenu un modèle puissant et est largement utilisé dans le développement et la recherche liée à la maladie. Les méthodes d&#39;isolement des organes chez le poisson zèbre adulte tels que le cerveau, le cœur, gonades, et les reins, ont été bien documentés 23, 24, 25. En raison de la petite taille et le remodelage dynamique des tissus gonadiques du poisson zèbre larvaire, l&#39;isolement des gonades est une t...

Le principal déterminant du sexe féminin dans le chromosome 4 est sauvage zebrafish perdu ou modifié dans le poisson zèbre domestique (c. -à- souches de laboratoire communes) 1. , Ils ont plutôt un système de détermination du sexe polygénique accompagnée par des facteurs environnementaux tels que la température, l&#39;hypoxie, la disponibilité alimentaire et de la densité de la population. ne sont pas pleinement compris les mécanismes détaillés de développement sexuel poisson zèbre. Des questions fondamentales telles que lors de la détermination du sexe se produit, ce poisson zèbre le signal primaire de détermination du sexe (s) est / sont et quels gènes régulent la première étape de la transformation des gonades reste à répondre 2, 3. Dans le processus de développement sexuel poisson zèbre, plusieurs étapes importantes ont été reconnues. Au début du stade de développement, à partir de 4 HPF (heures de fécondation) des cellules germinales primordiales (PGC) sont soumises à la spécification, la migration vers la crête génitale etprolifération. Les nombres de PGC et les interactions réciproques entre les cellules germinales et les cellules somatiques sont importantes pour la différenciation des gonades 4. A 13 dpf (jours de la fécondation), les gonades sont au stade indifférencié. Par 17 dpf, les gonades se développent dans les ovaires bi potentiel dans les deux futures femmes et les hommes. La transition dépendant de l&#39;apoptose de l&#39;ovaire à testiculaire commencent à 21 à 25 dpf et peut se poursuivre pendant plusieurs semaines. Par 35 dpf, le sexe de la gonade a été déterminée et la production de gamètes spécifique du sexe est en cours dans les deux ovaires et les testicules 5, 6, 7. À ce jour, divers gènes candidats et les mécanismes de détermination du sexe ont été proposées. Protéomique et l&#39; analyse de transcriptome ont isolé plusieurs gènes dont l&#39; expression dimorphisme sexuel et ces gènes ont été utilisés pour étudier la différenciation sexuelle chez le poisson zèbre 8, </sup&gt; 9, 10. Par exemple, chez le poisson zèbre larvaire, le gène cyp19a1a est exprimé spécifiquement dans l&#39;ovaire , mais pas dans le testicule 11, 12. De plus, le gène de l&#39; AMH est faiblement exprimé dans les cellules granuleuses des follicules ovariens, mais fortement dans les cellules de Sertoli testiculaires 13. En revanche, le gène de vasa est exprimé en continu dans les cellules germinales à la fois le poisson zèbre mâle et femelle, ce qui en fait un marqueur de gonade approprié 14, 15. Enquête sur les niveaux d&#39;expression du gène gonadiques est essentiel pour comprendre le mécanisme moléculaire de la détermination du sexe et de la différenciation en particulier au stade de l&#39; ovaire bi-potentiel 3, 9. Cependant, la petite taille du poisson zèbre larvaire et des gonades de façon correspondante de petits compliquer l&#39;isolement des gonadal tissu pour une analyse plus poussée moléculaire. Des études antérieures utilisées toute la région du tronc disséqués entre les opercules et pores anal 16. Cette préparation, bien que contenant gonades, se compose de plusieurs tissus et organes. En variante, des animaux transgéniques avec expression de GFP spécifique de gonade tels que vasa: EGFP ont été utilisés pour l&#39; isolement des tissus gonadiques par tri cellulaire activé par fluorescence (FACS) et des micro-dissection par capture laser 17, 18. Mais leur application à grande échelle est limitée. Ici, nous décrivons une procédure simple pour isoler gonades des larves de poisson zèbre à 17 dpf et 25 dpf. Nous démontrons la position des gonades par rapport à d&#39;autres organes et d&#39;isoler les gonades des tissus environnants morphologiquement intacts. Nous montrons en outre les gènes spécifiques gonades tels que Vasa et cyp19a1a sont fortement exprimés dans les gonades isolées par rapport au tissu du tronc par PCR quantitative (analyse qPCR). Le présent protocole permet l&#39; identification, l&#39; isolement, la purification de l&#39; ARN et l&#39; amplification de gènes spécifiques des gonades de poisson zèbre larvaire, ce qui permet une analyse moléculaire ultérieure du tissu gonadique 19.

<table><tbody><tr><td>Boîte de culture cellulaire 100 mm</td><td>Corning</td><td>430167</td><td>Pour l’incubation d’embryons</td></tr><tr><td>20x EM</td><td></td><td></td><td>Pour 1 L nécessaire : ajouter 17,5 g de NaCl, 0,75 g de KCl et 2,9 g de CaCl&#183 ; 2H2O ; ajouter ensuite 0,41 g de KH2PO4, 0,412 g de Na2HPO4 anhydre et 4,9 g de MgSO4&#183 ; 7H2O.</td></tr><tr><td>1x EM</td><td></td><td></td><td>Diluer 20x EM dans de l’eau distillée</td></tr><tr><td>AGAROSE G-10</td><td>Gène</td><td>121985</td><td>Pour préparer les plaques de gélose à 2</td></tr> % <tr><td>Trizol Réactif</td><td>Invitrogen</td><td>15596-026</td><td>Pour l’isolement de l’ARN</td></tr><tr><td>Mètre en verre</td><td>Shen Bo</td><td>250 ml</td><td>Pour préparer les plaques de gélose à 2 %</td></tr><tr><td>Four à micro-ondes</td><td>Midea</td><td>M1-211A</td><td>Pour chauffer l’AGAR</td></tr><tr><td>Pince à épiler DUMONT#5INOX</td><td>World Precision Instrument</td><td>500341</td><td>Pour la dissection</td></tr><tr><td>Stéréomicroscope</td><td>Motic</td><td>SMZ168</td><td>Pour la dissection</td></tr><tr><td>Équipement à eau pure</td><td>Millipore</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ringer' </td><td></td><td></td><td>Pour 1 L nécessaire : Ajouter 6,78 g de NaCl, 0,22 g de KCl, 0,26 g de CaCl2 et 1,19 g de Hepes, puis remplir à 1 L ; Ajustez le pH à 7,2. Stériliser par filtration et conserver dans un récipient en polycarbonate transparent autoclave.</td></tr><tr><td>Pipette de transfert</td><td>Samco</td><td>202, 204</td><td></td></tr><tr><td>Bain de métal</td><td>QiLinbeier</td><td></td><td>Modèle GL-150</td></tr><tr><td>Microscope</td><td>Leica&nbsp ;</td><td>M205 FA</td><td>Pour photomicrographie</td></tr><tr><td></td><td>Centrifugeuse Eppendorf</td><td>5417R</td><td></td></tr><tr><td>Micro Scale Kit d’isolement d’ARN</td><td>Ambion</td><td>AM1931</td><td>Pour l’isolement d’ARN à partir de tissus gonades</td></tr><tr><td>Dnase I</td><td>Sigma</td><td>AMPD1-1KT</td><td>Pour la digestion de l’ADN dans la solution d’ARN</td></tr><tr><td>RevertAid First Strand cRNA</td><td>Synthesis Kit Thermo Scientific</td><td>#K1631</td><td>Pour la synthèse d’ADNc premier brin</td></tr><tr><td>Rnase H</td><td>Thermo Scientific</td><td>#EN0202</td><td>Pour digérer l’ARN résiduel dans la solution d’ADNc.</td></tr><tr><td>SYBR Green Realtime PCR Master Mix</td><td>TOYOBO</td><td>QPK-201</td><td>Ce produit est un master mix 2x basé sur l’ADN polymérase Taq pour la PCR en temps réel et applicable pour le test d’intercalation avec SYBR Green I.</td></tr><tr><td>Spectrophotomètre</td><td>Ne Drop</td><td>OD-2000+</td><td>Mesure de la concentration de l’ARN total</td></tr><tr><td>Mastercycler</td><td>Eppendorf</td><td>AG 22331 Hamburg</td><td>Profil d’expression génique</td></tr></tbody></table>

dissection de tissu gonadique larval zebrafish

Dissection of Larval Zebrafish Gonadal Tissue

Bien que le poisson zèbre sauvage possède un ZZ / ZW système de détermination du sexe, ont perdu domestiqué zebrafish le chromosome sexuel. Ils utilisent un système de détermination du sexe polygénique, où plusieurs gènes répartis dans le génome déterminent collectivement l&#39;identité sexuelle des individus. À l&#39;heure actuelle, les gènes impliqués dans la régulation du développement des gonades et comment ils fonctionnent demeurent insaisissables. Normalement, l&#39;isolement gonades est la première étape pour examiner les processus de développement sexuels. Nous présentons ici une procédure pour isoler gonades de 17 dpf (jours de la fécondation) et 25 dpf larves de poisson zèbre. Le tissu gonadique isolé peut ensuite être examiné par le profilage de la morphologie et de l&#39;expression génique.

Dissections des gonades ont été effectuées sur la souche AB zebrafish des larves. La figure 1 représente un tissu gonadique typique des larves de poisson zèbre à 17 dpf et 25 dpf. Tout d&#39;abord, la peau et les muscles d&#39;un côté de l&#39;abdomen est coupé pour exposer les organes internes. Après avoir enlevé la masse des organes internes, la vessie natatoire en même temps que la gonade restent dans le coffre. Le gonades a été attaché à la face ventrale...

Nous présentons ici un protocole pour isoler gonades des larves de poisson zèbre, ce qui facilitera les enquêtes de la différenciation sexuelle et l&#39;entretien du poisson zèbre.

Dissection de tissu gonadique Larval Zebrafish

Although wild zebrafish possess a ZZ/ZW sex-determination system, domesticated zebrafish have lost the sex chromosome. They utilize a polygenic sex ...

L'objectif général de cette procédure est d'isoler le tissu gonadique de larves de zebrafish et d'analyser les propriétés moléculaires du tissu isolé. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine du développement sexuel du zebrafish, telles que la conservation des gènes dans la régulation du développement des gonades et les bases moléculaires du développement sexuel du zebrafish. Le principal avantage de cette technique est que les tissus gonadiques de larves de zebrafish aussi jeunes que 17 jours après la fécondation peuvent être disséqués pour en étudier l'état cellulaire et biologique moléculaire.En général, les personnes novices dans cette méthode éprouveront des difficultés en raison de la petite taille et du remodelage dynamique des tissus gonadiques chez le poisson-zèbre larvaire. Pour préparer la dissection des gonades, transférez deux poissons-zèbres adultes mâles et deux femelles de chaque côté d’un aquarium d’accouplement divisé. Le lendemain matin, renouvelez l’eau de l’aquarium et retirez la barrière pour initier l’accouplement.Une à deux heures après la fécondation, récupérez et transférez environ quarante œufs dans une plaque de 100 millimètres contenant 40 millilitres de milieu pour embryons, ou EM. Incubez les embryons à 28,5 degrés Celsius pendant quatre jours, en renouvelant le milieu EM deux fois par jour. À l’issue de l’incubation, transférez les larves dans des réservoirs d’un litre. Cinq jours après la fécondation, ou DPF, nourrissez les poissons avec des rotifères vivants.Lorsque les larves atteignent dix jours post-fécondation (DPF), nourrissez les poissons avec des artémias vivants. Ensuite, à 14 DPF, transférez les poissons dans un système d'eau en recirculation. Élevez les poissons larvaires jusqu'à 17 ou 25 DPF.Ensuite, mesurez la longueur du corps des larves à 17 et 25 jours post-fécondation. Préparez des boîtes de gélose à deux pour cent pour la dissection en ajoutant quatre grammes d'agar à 200 millilitres d'eau stérile. Chauffez le mélange au micro-ondes jusqu'à ce qu'il devienne transparent.Laisser refroidir l'agar pendant 15 minutes, puis le verser dans des boîtes de Pétri de 60 millimètres de diamètre. Conserver les boîtes contenant l'agar solidifié à quatre degrés Celsius. Ajouter de la glace pilée dans le réservoir contenant les larves anesthésiées de 17 jours post-fécondation.Transférez les larves anesthésiées dans une boîte de Pétri de 100 millimètres refroidie contenant 30 millilitres de solution froide de Ringer. Incubez les poissons dans la solution de Ringer refroidie pendant au moins 15 minutes afin d’anesthésier complètement les larves. À l’aide d’une cuillère en plastique, transférez les larves vers une boîte d’agar prérefroidie.Immergez tout le corps du poisson dans dix millilitres de solution de Ringer froide et déposez-le délicatement sur le côté. Sous un microscope stéréo, à un grossissement de 25x, utilisez une pince pour immobiliser le tronc du poisson. Ensuite, à l’aide d’une autre pince, déchirez longitudinalement l’abdomen depuis l’anus jusqu’au cœur.Ensuite, retirez délicatement la peau et les muscles d'un côté du corps pour exposer les organes internes. Puis, retirez soigneusement les organes massifs situés en position ventrale par rapport à la vessie natatoire. Évitez d'endommager le gonade attaché à la vessie natatoire.Coupez la connexion entre la vessie natatoire et le corps interne. Ensuite, retirez soigneusement l'ensemble de la vessie natatoire ainsi que le tissu gonadique. À l'aide de pinces, séparez délicatement le tissu gonadique de la vessie natatoire.Et éliminer le tissu adipeux environnant. Transférer immédiatement le tissu gonadique isolé dans un tube de centrifugeuse prérefroidi de 1,5 millilitre contenant 200 microlitres de solution de Ringer. Conserver le tube sur de la glace jusqu'à ce que tous les tissus gonadiques soient séparés des larves.Pour extraire l'ARN total à partir du tissu gonadique larvaire, transférez les gonades isolées dans un nouveau tube de 1,5 millilitre sans RNase et éliminez la solution de Ringer. Ensuite, ajoutez 100 microlitres de solution de lyse. Et vortexez le tube jusqu'à ce que le tissu soit complètement lysé.Après avoir effectué une extraction totale d'ARN selon les instructions du fabricant, ajoutez un dixième du volume de tampon DNase I et un microlitre de DNase I à la solution d'ARN, puis mélangez délicatement le contenu du tube. Incubez l'échantillon à 37 degrés Celsius pendant 20 minutes. Ensuite, ajoutez un dixième du volume du réactif d'inactivation de la DNase à la solution d'ARN.Incuber l'échantillon à 70 degrés Celsius pendant dix minutes. Ensuite, utiliser un spectrophotomètre pour mesurer la concentration en ARN total. Pour réaliser la synthèse du brin complémentaire d'ADN, utiliser un amorceur lien oligo-dT et un à deux microgrammes d'ARN, en suivant le protocole du fabricant.Incuber la réaction à 45 degrés Celsius pendant 90 minutes. Ensuite, arrêter la réaction en chauffant l'échantillon à 70 degrés Celsius pendant cinq minutes. Ajouter un microlitre de RNase H à la solution d'ADN complémentaire pour éliminer l'ARN résiduel.Mélanger délicatement le contenu du tube et centrifuger l'échantillon à environ 13 000 ×g pendant dix secondes. Incuber le tube à 37 °C pendant 20 minutes. Ensuite, ajouter 20 µL d'eau sans nucléases à l'échantillon.Et conserver l'ADNc à moins 70 degrés Celsius. Enfin, utiliser un colorant fluorescent pour effectuer une qPCR en suivant les conditions et les amorces indiquées dans le protocole écrit. Cette figure montre un tissu gonadique typique de poisson zèbre larvaire à 17 jours post-fécondation.Le gonade est attaché à la face ventrale de la vessie natatoire, comme on le voit ici. À 17 jours post-fécondation (DPF), les larves possèdent les gonades gauche et droite, qui sont translucides. Dans la plupart des cas, les gonades sont entourées de tissu épithélial et de protonephridium.À 25 JPF, les gonades sont souvent entourées de tissu adipeux, et des gonades de grande ou de petite taille peuvent être observées. Enfin, afin d'analyser les propriétés moléculaires du tissu gonadique isolé, les niveaux d'expression des marqueurs gonadiques amh, cyp19a1a, nanos3 et vasa ont été examinés par QPCR. Les résultats montrent des augmentations significatives des gènes marqueurs dans le tissu gonadique par rapport au tissu témoin.Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en une heure si elle est effectuée correctement. Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de se rappeler de fournir des conditions d'élevage constantes pour les larves de poisson zèbre, car cela est essentiel pour obtenir les résultats attendus. Après son développement, cette technique a ouvert la voie aux recherches dans le domaine du développement sexuel pour explorer les mécanismes de détermination du sexe chez le poisson zèbre.Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment isoler les tissus gonadiques des larves de poisson zèbre.

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JoVE Journal

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Dissection de tissu gonadique Larval Zebrafish

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