Synthèse de cristaux liquides biocompatibles mousses élastomères comme échafaudages cellulaires pour les cultures de cellules spatiales 3D

L’objectif de cette procédure est de préparer des échafaudages cellulaires biodégradables, tridimensionnels, semblables à de la mousse, à base d’élastomères à cristaux liquides biocompatibles à chaîne latérale. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans les domaines des cristaux liquides et de la biomédecine, telles que les effets des propriétés des élastomères à cristaux liquides sur la prolifération et l’alignement cellulaires. Le principal avantage de cette méthode d’échafaudages cellulaires bidimensionnels est qu’elle permet d’étudier les interactions spatiales cellule-cellule, ce qui est rarement possible dans des macro-environnements 2D.

En général, ceux qui découvrent cette méthode auront du mal avec les tests de compression tactile. Nous avons d’abord eu l’idée de cette méthode après avoir dû changer le support dans des centaines de boîtes de Pétri. Nous nous sommes demandé si les élastomères à cristaux liquides pouvaient soutenir les cellules musculaires sur un réseau 3D, afin d’éliminer l’utilisation d’autant de boîtes de Pétri.

La démonstration visuelle de cette méthode est essentielle, car certaines étapes nécessitent une manipulation soigneuse des produits chimiques. De plus, la mise en forme du modèle en mousse métallique peut être difficile. Tout d’abord, remplissez une ampoule de 20 millilitres avec une solution volumique de PFOTES à 2 % dans du toluène.

Remuez la solution dans l’ampoule pendant 24 heures pour silaniser l’intérieur de l’ampoule. Rincez l’ampoule silanisée avec de l’alcool isopropylique et séchez-la à 140 degrés Celsius pendant 30 minutes. Placez 3,64 grammes d’epsilon-caprolactone distillé, 0,5 gramme d’alpha-chloro-epsilon-caprolactone et 0,25 millilitres de glycérol dans l’ampoule sèche.

Agitez le mélange pendant une minute. Ensuite, ajoutez 4,90 grammes de DL-lactide au mélange et purgez l’atmosphère de l’ampoule avec de l’azote gazeux pendant une minute. Couvrez l’ouverture de l’ampoule avec du papier d’aluminium et chauffez le mélange à 120 degrés Celsius pendant environ deux heures pour faire fondre le DL-lactide.

Vortex le mélange pour perturber les solides non fondus, puis ajoutez 66 microlitres de 10-2-éthylhexanoate dans l’ampoule, puis vortex à nouveau. Fermez l’ampoule avec du papier d’aluminium et chauffez le mélange à 120 degrés Celsius pendant 10 minutes pour faire fondre à nouveau le DL-lactide. Une fois que le DL-lactide a fondu à nouveau, vortex vigoureusement le mélange et purgez l’atmosphère de l’ampoule avec de l’azote gazeux.

Scellez l’ampoule avec un septum en caoutchouc. Insérez une aiguille reliée à une ligne de vide à travers le septum et démarrez le vide. Scellez à la flamme le col de l’ampoule en faisant attention de ne pas faire fondre le bouchon en caoutchouc.

Une fois le cou scellé, chauffez le mélange réactionnel à 140 degrés Celsius pendant 48 heures. Ensuite, laissez le mélange refroidir à température ambiante. Ouvrez l’ampoule et dissolvez le mélange réactionnel visqueux dans 10 millilitres de dichlorométhane.

Transférez le mélange dans un entonnoir séparateur. Placez une fiole contenant 100 millilitres de méthanol dans un bain de glace sèche et d’acétone pour refroidir le méthanol à environ moins 78 degrés Celsius. Une fois le méthanol refroidi, fixez l’entonnoir séparateur sur le ballon.

Ajoutez le mélange réactionnel au méthanol froid à raison de deux gouttes par seconde. Recueillir le précipité blanc obtenu sur du papier filtre. Séchez le précipité dans un four sous vide entre 50 et 60 degrés Celsius pour obtenir le produit alpha-chloro SBC à trois bras.

Pour préparer l’alpha cholestéryl SBC à trois bras, l’atome de chlore pendant est remplacé par un azide. Une réaction de clic avec le 5-hexynoate de cholestéryle donne un cholestéryle pendant en tant que fraction de cristaux liquides. Pour commencer à préparer l’échafaudage en élastomère à cristaux liquides, combinez 0,75 gramme d’alpha-cholestéryl SBC à trois bras avec 0,25 millilitre de HDI et 0,24 millilitre d’epsilon-caprolactone distillé.

Ajoutez à cela 60 microlitres de 10-2-éthylhexanoate et vortex le mélange. Ensuite, découpez un morceau d’un centimètre sur quatre centimètres de mousse de nickel métallique. Roulez la mousse de nickel en un cylindre d’un centimètre de diamètre et d’un centimètre de haut pour former un gabarit pour l’échafaudage en mousse d’élastomère à cristaux liquides.

Placez le gabarit dans un flacon en verre ou dans un boîtier en feuille d’aluminium et versez le mélange d’élastomère à cristaux liquides sur le gabarit jusqu’à ce qu’il soit complètement recouvert. Laissez le modèle reposer dans le mélange d’élastomères à cristaux liquides pendant deux minutes, puis retirez l’excédent à l’aide d’une pipette. Chauffez le mélange et le modèle à 80 degrés Celsius pendant la nuit.

Ensuite, décollez le papier d’aluminium ou cassez le verre. Utilisez une lame de rasoir pour enlever l’excès d’élastomère à cristaux liquides afin d’exposer le gabarit en nickel métallique. Placez la mousse dans une fiole et ajoutez 70 millilitres d’une solution aqueuse saturée de chlorure de fer trois.

Incorporer la mousse dans la solution pendant trois jours à température ambiante pour dissoudre le modèle de nickel. Toutes les 24 heures, remuez la mousse dans de l’eau déminéralisée pendant 30 minutes, puis recommencez à mélanger dans une solution fraîche de trois chlorures de fer. Après le deuxième jour d’agitation, effectuez un test de compression tactile sur la mousse d’élastomère à cristaux liquides.

La résistance à la compression tactile indique que le modèle en nickel est toujours présent dans la mousse. Après le troisième jour, tout le modèle de nickel a été éliminé et la mousse résultante semble très douce et facile à compresser complètement. Le gabarit en nickel doit être complètement éliminé.

Il est important de rincer abondamment la mousse d’élastomère à cristaux liquides dans du chlorure de fer jusqu’à ce qu’elle soit douce au toucher lors d’un test de compression tactile. L’échafaudage en mousse d’élastomère à cristaux liquides est maintenant prêt à être caractérisé et utilisé. Une fois que la mousse d’élastomère à cristaux liquides est molle, rincez-la avec de l’éthanol à 70 % pour la stériliser.

Pour commencer la procédure d’ensemencement, lavez à nouveau les échafaudages en mousse d’élastomère à cristaux liquides deux fois dans un millilitre d’éthanol à 70 % pour stériliser les surfaces en élastomère. Ensuite, irradiez les échafaudages avec de la lumière UV pendant 10 minutes. Lavez les échafaudages avec une autre portion d’un millilitre d’éthanol à 70 %.

Rincez les échafaudages avec un millilitre d’eau stérile et un millilitre de solution saline tamponnée au phosphate. Chargez les échafaudages en élastomère à cristaux liquides stérilisés dans des plaques de culture à 24 puits. Préparez et comptez une suspension des cellules d’intérêt dans le milieu de croissance cellulaire approprié avec de la pénicilline et de la streptomycine.

Diluer la suspension cellulaire à 1,5 fois 10 à la cinquième cellules par 100 microlitres en utilisant un milieu de croissance. Déposez une goutte de suspension cellulaire diluée sur chaque échafaudage en élastomère à cristaux liquides. Incuber les échafaudages en élastomère à cristaux liquides ensemencés à 37 degrés Celsius dans une atmosphère à 5 % de CO2 pendant deux heures.

Ajoutez encore 0,5 millilitre de milieu de croissance à chaque échafaudage et poursuivez l’incubation. Toutes les 48 heures, lavez les échafaudages ensemencés avec un millilitre de PBS et ajoutez un milieu de croissance frais. Continuez à incuber les échafaudages jusqu’à ce que les cellules soient prêtes pour la microscopie.

Ces LC smétiques permettent d’étudier des constructions tissulaires complexes tout en favorisant la croissance et la prolifération cellulaires. Afin de maintenir la viabilité cellulaire, les mousses doivent être stérilisées et la propreté des cultures maintenue en tout temps. Pour se préparer à la microscopie, fixez les cellules sur les échafaudages avec une solution de paraformaldéhyde à 4 % dans du PBS pendant 15 minutes.

Faites tremper les échantillons trois fois dans trois millilitres de PBS pendant cinq minutes. Placez un échantillon d’échafaudage dans un tube Eppendorf. Colorer l’échantillon avec une solution de 0,1 % de DAPI dans 500 microlitres de PBS pendant 10 minutes.

Faites tremper l’échantillon deux fois dans un millilitre de PBS pendant cinq minutes. Ensuite, imagez immédiatement l’échantillon avec la microscopie confocale. Acquérez des piles d’images couvrant l’échantillon et analysez les données dans un programme de traitement d’images.

Un SBC à trois bras avec des fractions à cristaux liquides a été coulé sur un gabarit en mousse de nickel avec HDI comme réticulant. Le gabarit en nickel a été enlevé par gravure pour obtenir la mousse d’élastomère à cristaux liquides. Des essais de déformation par compression ont été effectués périodiquement pour surveiller le processus de gravure.

Une fois le nickel complètement dissous, l’essai de déformation par compression a montré une réduction de 70 % de la taille lorsqu’il est comprimé. Lors du relâchement de la compression, la mousse d’élastomère à cristaux liquides a constamment retrouvé sa taille et sa forme d’origine. Ce comportement est attribué aux fractions de cristaux liquides, car des mousses d’élastomères similaires dépourvues de la fraction cholestérol epsilon-caprolactone ne se sont pas rétablies de la compression.

La MCS de la morphologie interne de la mousse a montré un réseau interconnecté d’entretoises creuses en mousse. La morphologie régulière a été attribuée à la structure de la mousse de nickel, ce qui indique que la taille des pores et la forme générale peuvent être contrôlées par la sélection d’un modèle métallique approprié. La mousse a été ensemencée de cellules de neuroblastome, qui se sont fixées aux parois du réseau en deux jours.

30 jours après l’ensemencement, la microscopie confocale a révélé que les cellules s’étendaient sur le réseau d’élastomères à cristaux liquides et avaient formé plusieurs couches dispersées dans la mousse d’élastomère. L’allongement des noyaux cellulaires a été observé et a été corrélé à l’alignement cellulaire. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en trois à quatre semaines si elle est correctement exécutée.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la conception et de la préparation d’échafaudages cellulaires en élastomère à cristaux liquides avec des tailles et des morphologies de pores spécifiques. Lors de cette procédure, il est important de bien caractériser chaque produit et de surveiller la viabilité et l’expansion des cellules. De plus, une technique de coloration appropriée est importante pour acquérir facilement des images de microscopie confocale.

À la suite de cette procédure, les élastomères à cristaux liquides peuvent également être exposés à des stimuli externes, tels que le stress ou les champs magnétiques et électriques, pour répondre à des questions supplémentaires sur la façon dont l’ordre moléculaire anisotrope des élastomères à cristaux liquides affecte la réponse cellulaire. Les implications de cette technique s’appliquent à l’étude des processus pathologiques, car elle fournit une plate-forme pour étudier dynamiquement les effets des agents externes sur l’activité simulée de la maladie et les processus de réparation ultérieurs. Bien que cette mousse d’élastomère à cristaux liquides puisse donner un aperçu des interactions cellule-cellule, elle peut également être utilisée avec d’autres matériaux, tels que des semi-conducteurs ou des nanostructures métalliques.

Après son développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans les domaines biomédicaux pour concevoir des plateformes expérimentales à long terme reflétant les systèmes vivants.