Analyse de la méthylation de l'ADN

Méthylation de l’ADN est une modification chimique de l’ADN qui affecte l’expression des gènes sous différents contextes cellulaires. De nombreux chercheurs s’intéressent dans le mécanisme et les fonctions de ce processus, comme méthylation aberrante de l’ADN a été associée à des maladies comme le cancer.

Dans cette vidéo, nous allons couvrir les principes qui sous-tendent la méthylation de l’ADN et les méthodes de le détecter. Ensuite, nous allons explorer un protocole général pour l’une de ces méthodes, l’analyse de bisulfite et certaines applications de cette technique.

Tout d’abord, nous allons jeter un oeil à ce que méthylation de l’ADN est et comment il peut être détecté.

Au cours de ce processus biochimique, une cellule ajoute une balise chimique appelée groupe méthyle aux bases cytosine dans son ADN. Plus les cytosines méthylés se produisent à proximité des bases guanine dans le même brin d’ADN et ces nucléotides adjacents — et la liaison phosphodiester qui les lie — sont appelées « GPC ». Bien que la plupart des GPC vertébrés sont méthylées, celles qui sont non méthylé ont tendance à se produire rapprochées dans les gènes de CpG « îlots » près les promoteurs d’activement exprimés et divers autres éléments d’ordre réglementaire.

Comment les changements dans la méthylation de l’ADN contribuent à la régulation des gènes, c’est toujours un sujet d’enquête intense. La méthylation des îles de CpG semble être important pour le silençage de génétique stable et à long terme vu dans des processus épigénétiques comme l’empreinte génomique, qui est l’expression spécifique de parents d’origine de certains gènes, ainsi que l’inactivation du chromosome x, le silence de l’un des deux chromosomes dans chaque cellule des femelles de mammifères. Répression des gènes essentiels en raison de la méthylation aberrante de l’îles de CpG a également démontrée de contribuer à une croissance cellulaire incontrôlée, qui peut mener au cancer. Mécaniquement, la méthylation de l’ADN peut-être contribuer à silençage génique par deux facteurs de transcription empêchant de s’associer avec les promoteurs, ou en recrutant des protéines qui modifient des histones et de remodèlent de la chromatine dans un État transcriptionnellement non permissif.

Il existe plusieurs méthodes pour détecter l’état de méthylation de l’ADN.

Une technique, l’analyse de l’aide, implique deux endonucléases de restriction, appelés HpaII et MspI, qui clivent respectivement seulement unmethylated ou méthylés et non méthylés, séquences CCGG. En comparant les profils de digestion produites par ces deux enzymes, l’état de méthylation de l’ADN peut être déduit.

Une autre méthode, appelée méthylé ADN immunoprécipitation ou « MeDIP, » utilise des anticorps qui se fixent à des cytosines méthylés d’enrichir à des séquences d’ADN méthylés.

Enfin, l’analyse du bisulfite sert à distinguer méthylés de non méthylé cytosine dans l’ADN, en procédant à une réaction chimique qui convertit non méthylé cytosine en uracile. Suite à cette conversion, ADN bisulfite-traitée peut être soumis à la PCR, séquencé et comparé à un génome de référence. Les cytosines non méthylés sont ceux qui sont présents dans la référence, mais remplacé avec les thymines après analyse du bisulfite et PCR. En soumettant l’ADN bisulfite-traitée par spectrométrie de masse, de chercheurs peuvent également créer des « épigrammes de méthylation, « qui linéairement représentent différentes GPC dans le génome et représentent le degré de méthylation à chacun d’eux. Ces épigrammes sont particulièrement utiles si les chercheurs veulent comparer les profils de méthylation entre différents types de cellules.

Nous allons maintenant jeter un regard en profondeur sur le protocole d’analyse de bisulfite.

Pour commencer, hydroxyde de sodium est ajouté aux préparations d’ADN génomique, qui sont ensuite incubées à 95° C. Cela dénature l’ADN et rend ses bases accessibles à des réactions chimiques ultérieures. Métabisulfite de sodium est ensuite introduit dans le mélange de l’ADN dénaturé, et deux étapes de la réaction chimique seront produit. Au cours de la première étape, sulfonation, un sulfite groupe est ajouté à une cytosine non méthylé pour former le sulfonate de cytosine. Alors, au cours de la rogneuse désamination, un groupement aminé est retiré du sulfonate de cytosine pour générer le sulfonate de perfluorooctane uracile.

Pour faciliter ces premières étapes de la réaction chimique, la préparation de l’ADN est recouverte d’huile minérale, qui empêche l’évaporation et contribue à maintenir la concentration de métabisulfite de sodium. La réaction est alors incubée à 55° C dans l’obscurité. Au cours de cette étape, un agent pour éviter l’oxydation, telles que quinol, est également ajouté au mélange.

Pour collecter l’ADN modifié contenant du sulfonate de perfluorooctane uracile et sans huile minérale, le mélange est centrifugé et la plus basse couche de liquide récupéré. L’ADN de cette solution est ensuite purifiée.

Ensuite, l’hydroxyde de sodium est ajouté au mélange de l’ADN, qui est ensuite incubé à 37° C. Ceci est fait pour induire desulfonation, qui — comme vous l’avez peut-être deviné — supprime le groupe de sulfite de sulfonate de l’uracile, formant l’uracile et en complétant la réaction chimique.

Enfin, le mélange est neutralisé avec l’ajout d’acétate d’ammonium et l’ADN est recueilli par la précipitation d’éthanol. Une fois que l’ADN bisulfite-converti a été purifiée, il est soumis à la PCR et séquençage.

Maintenant que nous avons discuté de la technique de base pour l’analyse de bisulfite, regardons certaines applications expérimentales.

Certains chercheurs utilisent analyse bisulfite pour enquêter sur l’empreinte génomique. Ici, chercheurs ont traversé deux souches d’Arabidopsis , avec des différences génétiques, ainsi que maternelles et paternelle ADN se distinguaient. Profils de méthylation dans les embryons qui en résultent et associé de l’endosperme ou le tissu qui soutient l’embryon, ont ensuite été comparés. En utilisant cette méthode, les scientifiques ont découvert que GPC dans l’allèle maternel d’un gène de protéine-codage, MEA, tendance à être méthylé dans les embryons mais non méthylé dans l’albumen, indiquant l’empreinte spécifique aux tissus.

D’autres chercheurs utilisent cette technique pour comprendre comment environnementaux ou sociaux facteurs peut modifier les profils de méthylation. Ici, souriceaux ont été séparés de leur mère pour induire des contraintes, et leurs tissus cérébraux ont été isolés par la suite. Après le séquençage d’ADN bisulfite-traitée, des scientifiques ont pu déterminer que les profils de méthylation dans un gène codant l’hormone, AVP, changé dans une région du cerveau spécifique chez les chiots « séparés », ce qui suggère un mécanisme moléculaire des effets biologiques à long terme de l’expérience de la vie.

Enfin, de nombreux chercheurs tentent d’optimiser l’analyse bisulfite pour faciliter la comparaison des profils de méthylation entre les cellules individuelles, uniques. Ici, les chercheurs ont modifié la méthode d’analyse de bisulfite afin que toutes les mesures ont été effectuées sur des ovocytes de souris individuels embarqués dans l’agarose, qui a aidé à se pour prémunir contre la perte d’ADN. En utilisant cette méthode, les chercheurs ont pu identifier les échantillons de single-ovocyte qui avaient été contaminés avec d’autres cellules en recherchant ceux qui ont donné de multiples profils de méthylation.

Vous avez juste regardé les vidéo de JoVE sur des analyses sensibles de méthylation. Ici, nous avons discuté du rôle que joue la méthylation de l’ADN dans la régulation des gènes, méthodes qui utilisent des chercheurs d’identifier les régions méthylées dans le génome, un protocole généralisé pour l’analyse du bisulfite et enfin, quelques applications de cette technique. Comme toujours, Merci pour regarder !