3: Analyse de la méthylation de l'ADN

La méthylation de l’ADN est une modification chimique de l’ADN qui affecte l’expression des gènes dans différents contextes cellulaires. De nombreux chercheurs s’intéressent au mécanisme et aux fonctions de ce processus, car la méthylation aberrante de l’ADN a été associée à des maladies telles que le cancer.

Dans cette vidéo, nous aborderons les principes de la méthylation de l’ADN et les méthodes pour la détecter. Ensuite, nous explorerons un protocole général pour l’une de ces méthodes, l’analyse au bisulfite, et certaines applications de cette technique.

Tout d’abord, voyons ce qu’est la méthylation de l’ADN et comment elle peut être détectée.

Au cours de ce processus biochimique, une cellule ajoute une étiquette chimique connue sous le nom de groupe méthyle aux bases de cytosine dans son ADN. La plupart des cytosines méthylées se produisent à côté de bases de guanine dans le même brin d’ADN, et ces nucléotides adjacents – et la liaison phosphodiester qui les relie – sont appelés « CpG ». Bien que la plupart des CpG des vertébrés soient méthylés, ceux qui ne sont pas méthylés ont tendance à se trouver à proximité les uns des autres dans les « îles » CpG près des promoteurs des gènes activement exprimés, et de divers autres éléments de séquence régulatrice.

La façon dont les changements dans la méthylation de l’ADN contribuent à la régulation des gènes fait encore l’objet d’études intenses. La méthylation des îlots CpG semble être importante pour le silençage génique stable et à long terme observé dans les processus épigénétiques tels que l’empreinte génomique, qui est l’expression spécifique du parent d’origine de certains gènes, ainsi que l’inactivation du chromosome X, le silençage de l’un des deux chromosomes X dans chaque cellule de mammifères femelles. Il a également été démontré que la répression de gènes critiques due à la méthylation aberrante des îlots CpG contribue à une croissance cellulaire incontrôlée, ce qui peut conduire au cancer. D’un point de vue mécaniste, la méthylation de l’ADN peut contribuer au silençage génique en empêchant les facteurs de transcription de s’associer aux promoteurs, ou en recrutant des protéines qui modifient les histones et remodèlent la chromatine dans un état transcriptionnellement non permissif.

Il existe plusieurs méthodes pour détecter l’état de méthylation de l’ADN.

L’une d’elles, le test HELP, implique deux endonucléases de restriction appelées HpaII et MspI, qui ne clivent respectivement que les séquences CCGG non méthylées, ou à la fois méthylées et non méthylées. En comparant les schémas de digestion produits par ces deux enzymes, l’état de méthylation de l’ADN peut être déduit.

Une autre méthode, appelée immunoprécipitation d’ADN méthylé ou ? MeDIP, ? utilise des anticorps qui se lient aux cytosines méthylées pour enrichir les séquences d’ADN méthylées.

Enfin, l’analyse au bisulfite est utilisée pour distinguer la cytosine méthylée de la cytosine non méthylée dans l’ADN, en effectuant une réaction chimique qui convertit la cytosine non méthylée en uracile. Suite à cette conversion, l’ADN traité au bisulfite peut être soumis à la PCR, séquencé et comparé à un génome de référence. Les cytosines non méthylées sont celles qui sont présentes dans la référence, mais remplacées par des thymines suite à l’analyse au bisulfite et à la PCR. En soumettant de l’ADN traité au bisulfite à la spectrométrie de masse, les chercheurs peuvent également créer des « épigrammes de méthylation ». qui représentent linéairement différents CpG dans le génome et décrivent le degré de méthylation à chacun d’eux. De telles épigrammes sont particulièrement utiles si les chercheurs souhaitent comparer les modèles de méthylation entre différents types de cellules.

Examinons maintenant en profondeur le protocole d’analyse du bisulfite.

Pour commencer, de l’hydroxyde de sodium est ajouté à des préparations d’ADN génomique, qui sont ensuite incubées à 95°C. Cela dénature l’ADN et rend ses bases accessibles aux réactions chimiques ultérieures. Le métabisulfite de sodium est ensuite introduit dans le mélange d’ADN dénaturé, et deux étapes de réaction chimique se produisent. Au cours de la première étape, la sulfonation, un groupe sulfite est ajouté à une cytosine non méthylée pour former une cytosine sulfonate. Ensuite, lors de la désamination hydrolique, un groupe amino est retiré du sulfonate de cytosine pour générer du sulfonate d’uracile.

Pour faciliter ces premières étapes de la réaction chimique, la préparation de l’ADN est recouverte d’huile minérale, ce qui empêche l’évaporation et aide à maintenir la concentration de métabisulfite de sodium. La réaction est ensuite incubée à 55° ? C dans l’obscurité. Au cours de cette étape, un agent pour prévenir l’oxydation, tel que le quinol, est également ajouté au mélange.

Pour recueillir de l’ADN modifié contenant du sulfonate d’uracile, et pas d’huile minérale, le mélange est centrifugé et la couche liquide la plus basse est récupérée. L’ADN de cette solution est ensuite purifié.

Ensuite, de l’hydroxyde de sodium est ajouté au mélange d’ADN, qui est ensuite incubé à 37°C. Ceci est fait pour induire la désulfonation, qui, comme vous l’avez peut-être deviné, élimine le groupe sulfite du sulfonate d’uracile, formant de l’uracile et complétant la réaction chimique.

Enfin, le mélange est neutralisé par l’ajout d’acétate d’ammonium, et l’ADN est collecté par précipitation à l’éthanol. Une fois que l’ADN converti au bisulfite a été purifié, il est soumis à la PCR et au séquençage.

Maintenant que nous avons discuté de la technique de base de l’analyse du bisulfite, examinons quelques applications expérimentales.

Certains chercheurs utilisent l’analyse au bisulfite pour étudier l’empreinte génomique. Ici, les chercheurs ont croisé deux souches d’Arabidopsis avec des différences génétiques, de sorte que l’ADN maternel et paternel a pu être distingué. Les modèles de méthylation dans les embryons résultants et l’endosperme associé, ou le tissu qui soutient l’embryon, ont ensuite été comparés. En utilisant cette méthode, les scientifiques ont découvert que les CpG dans l’allèle maternel d’un gène codant pour une protéine, le MEA, avaient tendance à être méthylés dans les embryons mais non méthylés dans l’endosperme, indiquant une empreinte tissulaire spécifique.

D’autres chercheurs utilisent cette technique pour comprendre comment des facteurs environnementaux ou sociaux peuvent modifier les modèles de méthylation. Ici, les bébés souris ont été séparés de leur mère pour induire un stress, et leurs tissus cérébraux ont ensuite été isolés. Après le séquençage de l’ADN traité au bisulfite, les scientifiques ont déterminé que les modèles de méthylation d’un gène codant pour une hormone, l’AVP, changeaient dans une région spécifique du cerveau en les petits, suggérant un mécanisme moléculaire possible pour les effets biologiques à long terme de l’expérience de la vie précoce.

Enfin, de nombreux chercheurs tentent d’optimiser l’analyse du bisulfite pour faciliter la comparaison des modèles de méthylation entre des cellules individuelles et uniques. Ici, les chercheurs ont modifié la méthode d’analyse du bisulfite afin que toutes les étapes soient effectuées sur des ovocytes de souris individuels incorporés dans de l’agarose, ce qui a permis de se prémunir contre la perte d’ADN. En utilisant cette méthode, les chercheurs ont pu facilement identifier des échantillons d’ovocytes uniques qui avaient été contaminés par d’autres cellules en recherchant celles qui donnaient plusieurs modèles de méthylation.

Vous venez de regarder la vidéo de JoVE sur les analyses sensibles à la méthylation. Ici, nous avons discuté du rôle que joue la méthylation de l’ADN dans la régulation des gènes, des méthodes utilisées par les chercheurs pour identifier les régions méthylées du génome, d’un protocole généralisé pour l’analyse du bisulfite et, enfin, de certaines applications de cette technique. Comme toujours, merci d’avoir regardé !