Évaluation de réticulum sarcoplasmique Calcium réserve et intracellulaires de Calcium diastolique enlèvement dans les Cardiomyocytes ventriculaires isolées

L’objectif global de cette procédure est d’évaluer la réserve de calcium du réticulum sarcoplasmique et la fonction d’élimination du calcium diastolique intracellulaire dans les cardiomyocytes isolés. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés sur le mécanisme de manipulation du calcium intracellulaire dans certaines conditions physiopathologiques telles que le diabète et l’insuffisance cardiaque. Le principal avantage de cette technique est sa commodité et est moins limitée par la technique et l’équipement.

Pour commencer cette procédure, installez le système de perfusion Langendorff. Remplissez le système de perfusion avec une solution NT, réglez la température à 36,5 degrés Celsius et éliminez toutes les bulles d’air dans le tube. Ensuite, ouvrez la cavité abdominale sous le processus xiphoïde, soulevez le processus xiphoïde et ouvrez la poitrine avec des ciseaux.

Retirez ensuite le péricarde, soulevez légèrement le cœur à l’aide d’une pince incurvée, identifiez l’arc aortique et coupez le cœur de la racine de l’aorte. Après cela, transférez le cœur dans un plat de 60 millimètres et lavez-le avec une solution NT. Tenez l’aorte à l’aide de deux micro-pinces de dissection et montez-la sur la canule de perfusion Langendorff.

Ensuite, ligaturez fermement l’aorte sur la canule à l’aide de sutures chirurgicales. Par la suite, perfuser le cœur avec 30 millilitres de solution NT pour récupérer la circulation des artères coronaires. Ensuite, passez le perfusat à 30 millilitres de solution Tyrode sans calcium pour arrêter le rythme cardiaque.

Ensuite, remplacez le perfusat par une solution d’isolement de collagénase A pour la digestion enzymatique. Après une digestion de 20 à 25 minutes, remplacez rapidement la solution de perfusion par la solution de Tyrode sans calcium pour arrêter la digestion. Ensuite, tenez le cœur avec une pince, coupez-le de la canule et placez le cœur dans une boîte de 35 millimètres contenant une solution KB.

Ensuite, trouvez la zone ventriculaire gauche. Coupez l’oreillette, le ventricule droit et la zone de la jonction auriculo-ventriculaire. Transférez ensuite le ventricule gauche dans une nouvelle boîte de 35 millimètres avec une solution KB et coupez le tissu en petits morceaux.

Pipetez doucement les morceaux avec un compte-gouttes en plastique filtré. Ensuite, filtrez les cellules avec un filtre en acier inoxydable à ouverture de 150 microns et transférez-les dans un tube à centrifuger de 15 millilitres. Ensuite, centrifugez l’échantillon à 150 fois g pendant 30 secondes et jetez le surnageant.

Remettez les myocytes en suspension dans 10 millilitres de solution KB et laissez-les se stabiliser pendant six minutes. Ensuite, jetez le surnageant et remettez la pastille en suspension dans 10 millilitres de solution KB pendant 20 minutes. Après s’être installé dans la solution KB pendant 20 minutes, jetez le surnageant et remettez les myocytes en suspension avec la solution de réintroduction de calcium A.Répétez la procédure ci-dessus avec la solution d’introduction de calcium B.Répétez ensuite la procédure ci-dessus avec la solution de NT pour purifier les myocytes disponibles.

Conservez les myocytes LV isolés dans cette solution et étudiez-les dans les quatre à six heures. Ajoutez ensuite une solution NT et une solution de caféine de 10 millimolaires à chaque colonne du crayon. Évacuez toutes les bulles d’air dans les tubes pour éviter le blocage de l’air.

Maintenant, connectez le tube d’entrée avec la solution NT pour la perfusion en chambre. Pour la perfusion à l’aiguille du myocyte cible, connectez l’embout du collecteur à plusieurs canons au système de perfusion contrôlé par valve. Ensuite, comptez le nombre de gouttes à partir de la pointe du micron du crayon pendant 10 secondes et ajustez manuellement le régulateur de débit pour maintenir la vitesse d’écoulement à une vitesse approximative de trois gouttes par 10 secondes.

Dans cette procédure, ajoutez le stock de fura-2-acétoxyméthyle dans un millilitre de suspension de myocytes pour porter la concentration finale à deux micromolaires. Gardez-les dans l’obscurité pendant 20 minutes à température ambiante. Après cela, jetez le surnageant et remettez deux fois en suspension les cardiomyocytes avec la solution de NT.

Ensuite, éteignez la lumière et gardez les cellules dans l’obscurité. Placez les myocytes dans la chambre de perfusion pendant 15 minutes avant de les perfuser avec la solution de NT. Stimulez les myocytes avec une stimulation de champ hertz pendant cinq minutes à l’aide d’un stimulateur.

Maintenant, sélectionnez un myocyte avec une bonne forme et une contraction stimulée stable sous la lentille de l’objectif microscopique 10X. Cliquez sur Fichier Nouveau fichier pour créer un nouveau fichier d’enregistrement. Ensuite, changez le grossissement microscopique à 40X et tournez l’orientation de la caméra CCD pour maintenir le myocyte en position horizontale.

Ensuite, cadrez le myocyte unique en ajustant l’adaptateur de cadrage cellulaire et assurez-vous que l’arrière-plan est clair. Ensuite, exposez les myocytes à la lumière émise par une lampe au xénon avec des filtres d’excitation de longueur d’onde de 340 ou 380 nanomètres et imagez les myocytes à travers un objectif 40X. Détection du signal fluorescent à 510 nanomètres.

Cliquez sur le bouton Démarrer pour enregistrer de manière synchrone la fluorescence et la longueur du sarcomère à l’aide du système photomultiplicateur de fluorescence à double excitation. Notez les changements de longueur du sarcomère des myocytes et enregistrez-les simultanément à l’aide du module de bord doux. Dans cette procédure, reliez l’orifice de sortie auxiliaire du stimulateur avec l’importation analogique sur le système de commande de la vanne par un câble BNC.

Ensuite, préréglez les paramètres dans le logiciel de contrôle des vannes, cliquez sur le bouton de téléchargement pour télécharger la séquence chargée dans le programme, puis cliquez sur le bouton de déclenchement pour activer la fonction de déclenchement. Ensuite, préréglez le stimulateur en mode séquence et réglez les paramètres. Ensuite, réglez le stimulateur sur le pas S1 pour rythmer les myocytes LV à un hertz.

Commencer la perfusion à l’aiguille à la vitesse de 1,5 millilitre par minute avec la solution NT. Sélectionnez un myocyte cible sous la vue microscopique de faible puissance et assurez-vous qu’il peut être atteint par la micropointe du crayon. Ensuite, changez le grossissement du microscope à 400X.

Tournez l’orientation de la caméra CCD pour maintenir le myocyte en position horizontale. Ajustez ensuite l’ouverture rectangulaire sous l’adaptateur d’encadrement de cellule jusqu’à une fenêtre appropriée qui se remplit de myocytes. Ensuite, ajustez la position du crayon fixé sur le micromanipulateur et placez soigneusement la micropointe à la distance du rayon du champ de vision par rapport au myocyte cible.

Ajustez ensuite la portée du jet d’aiguille pour couvrir principalement le myocyte cible et assurez-vous que le myocyte ne peut pas être emporté par le flux d’aiguille. Après 60 secondes de stimulation de base, faites rouler le curseur du stimulateur jusqu’à l’étape D2. Le reste du protocole sera exécuté automatiquement par le stimulateur et le commandant de la valve.

Cliquez sur le bouton Pause pour mettre en pause l’enregistrement du fichier et déplacer la vue microscopique vers une zone vide à proximité. Cliquez ensuite sur le bouton Enregistrer pour reprendre l’enregistrement pendant quelques secondes et enregistrer les valeurs d’intensité numériques 340 et 380 nanomètres pour la correction de l’arrière-plan. Ensuite, ouvrez la boîte de dialogue Opération Constant et remplissez les valeurs dans le formulaire d’arrière-plan.

Le logiciel peut corriger les valeurs du rapport fura-2 en soustrayant l’arrière-plan. Voici une illustration du protocole de commutation automatique des valves de perfusion et du système de stimulation. Cette figure montre les valeurs statistiques de la réserve de calcium du réticulum sarcoplasmique et de la libération fractionnée de calcium pour les contractions stimulées par un hertz dans les groupes diabétiques et Sprague-Dawley.

Le groupe diabétique a montré une diminution significative de la réserve de calcium SR et de la libération fractionnée de calcium SR par rapport au groupe Sprague Dawley. Ici, le panneau logiciel montre une courbe exponentielle mono manuelle ajustée à la constante de temps de décroissance de l’impulsion calcique induite par la caféine. Ces diagrammes à barres comparent la Tau-caféine et la Tau-1Hz/Tau-caféine entre les groupes diabétique et Sprague Dawley.

Le groupe diabétique a montré des valeurs significativement plus élevées de Tau-caféine et de Tau-1Hz/Tau-caféine que le groupe Sprague Dawley. Cette procédure fournit un outil réalisable et pratique pour explorer le mécanisme de manipulation du calcium intracellulaire de la dysfonction cardiaque. Lors de la tentative de cette procédure, certains points clés doivent être notés, tels que l’adhérence stable des myocytes à la boîte, l’enveloppement de l’interrupteur de canal, tout en contrôlant la vitesse d’écoulement de la perfusion de l’aiguille et la distance appropriée entre la pointe de l’aiguille et le myocyte cible.