Name: Évaluation de réticulum sarcoplasmique Calcium réserve et intracellulaires de Calcium diastolique enlèvement dans les Cardiomyocytes ventriculaires isolées (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-09-18T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min
Description: Découvrez l'évaluation des réserves calciques du réticulum sarcoplasmique et du retrait calcique diastolique dans les cardiomyocytes ventriculaires isolés. Cette méthode permet d'étudier le métabolisme calcique intracellulaire dans le diabète et l'insuffisance cardiaque.

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Ce travail a été soutenu par des subventions de la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (no 81100159, Dongwu Lai, 81401147, Juhong Zhang), le médical et santé Science programme de la Province du Zhejiang (no 201646246, Dongwu Lai) et les sciences de la santé et Plan de la technologie de la ville de Hangzhou (no 2013A28, Ding Lin).

toutes les expérimentations animales ont été effectuées conformément aux protocoles approuvés par le Comité de l’urbanisme au centre de recherche expérimentale, Académie chinoise des Sciences médicales chinoises et Université de Zhejiang et d’institutionnels animalier.
 1. préparation de la solution <ol><li>préparer toutes les solutions tel que décrit dans le tableau 1.</li></ol>
 2. isolement de gauche ventricule (LV) Cardiomyocytes Remarque : LV cardiomyocytes sont isolés par voie enzymatique en utilisant un système de perfusion de Langendroff comme décrit précédemment 7 , 8 , 9 , 10 , 11.
<ol><li>Mis en place le système de perfusion Langendroff. Remplir le système de perfusion avec une solution normale Tyrode (NT), réglez la température à 36,5 ° C et éliminer les bulles d’air dans le tube.</li>
	<li>, Peser et anesthésier un rat Sprague-Dawley par injection intrapéritonéale (ip) de l’hydrate de chloral (400 mg/kg). Confirmer l’État anesthésique en évaluant la réponse de pincée de queue ou de l’orteil après 5 min.</li>
	<li>Ouvrir la cavité abdominale sous le processus xiphoïde avec ciseaux chirurgicaux, soulever le processus xiphoïde et ouvrir le coffre avec le ciseaux. Retirez le péricarde, légèrement soulever le cœur avec une pince courbée, identifier la crosse aortique et coupez le cœur par les ciseaux de la racine de l’aorte.</li>
	<li>Transférer le coeur dans un plat de 60 mm et lavez-le avec une solution NT. Tenez l’aorte avec deux micro-dissection forceps, montez-la sur la canule de perfusion de Langendorff et puis fermement ligaturer l’aorte sur la canule à l’aide de sutures chirurgicales. 
	Remarque : Un opérateur habile peut finir ce processus au sein de 15 s.</li>
	<li>Perfuse le cœur avec une solution de 30 mL NT pour récupérer la circulation des artères coronaires. Mettez ensuite le perfusat à 30 mL Ca 2 +-gratuit solution Tyrode (Taurine, 1 mg/mL de BSA de 10 mM) pour arrêter les battements du cœur. Ensuite, basculez le perfusat solution d’isolation de collagénase A (0,6 mg/mL) pour une digestion enzymatique. 
	NOTE : Utilisez de collagénase A des expériences avec des rats diabétiques ou collagénase II pour les expériences sans rats diabétiques.</li>
	<li>Après digestion pendant 20-25 min, passer rapidement la solution de perfusion à la Ca 2 +-gratuit solution Tyrode pour arrêter plus de digestion. Puis, maintenez le cœur avec une pince, coupe-la de la canule et placer le cœur dans un plat de 35 mm contenant une solution KB (voir tableau 1).</li>
	<li>De disséquer le mur LV avec ciseaux et pinces. Couper l’oreillette, le ventricule droit et le quartier de la jonction auriculo-ventriculaire. Le tissu restant est le LV ; transférer dans une autre boite de 35 mm avec solution KB. Émincer le tissu LV en petits morceaux.</li>
	<li>Doucement, déposer les morceaux avec un compte-gouttes en plastique filtré et remettre en suspension dans une solution de 10 mL KB.</li>
	<li>Filtrer les cellules avec 150 µm ouverture inox filtre et transfert dans un tube à centrifuger 15 mL. Centrifuger à 150 g pendant 30 s et jeter le surnageant. Remettre en suspension les myocytes dans une solution de 10 mL KB, sans se contenter de 6 min, jeter le surnageant et remettre en suspension l’extrait concentré dans une solution de 10 mL KB. 
	Remarque : Toutes les mesures ont été effectuées à 36 ° C dans des solutions gazées avec 100 % O 2.</li>
</ol> 3. Réintroduction de calcium <ol><li>après s’être installé pendant 20 min dans une solution KB, éliminer le surnageant et remettre en suspension les myocytes avec solution de réintroduction de calcium A (0. 3 mM Ca 2 +, 4,5 mL Ca 2 +-solution Tyrode libre, solution de 1,5 mL NT) pour 10 min.</li>
	<li>Répéter la procédure ci-dessus avec solution de réintroduction de calcium B (0,3 mM Ca 2 +, 3 mL Ca 2 +-solution gratuite de Tyrode, solution 3 mL NT).</li>
	<li>Répéter la procédure ci-dessus avec une solution de NT (1,2 mM Ca 2 +) pour purifier les myocytes disponibles. Stocker les LV des myocytes isolés dans cette solution et observe-les dans 4-6 h.</li>
</ol> 4. Set Up du système de Perfusion <ol><li>connecter le tube d’entrée avec la solution pour perfusion ( Figure 1 a) de la chambre de NT.</li>
	<li>Pour la perfusion de l’aiguille de la cible de myocyte, branchez la fiche multi baril collecteur (p. ex., crayon de la perfusion, dénommé crayon désormais), fixe le micromanipulateur, au robinet commandé par perfusion. Ajouter la solution de NT et solution de caféine de 10 mM à chaque colonne du crayon ( Figure 1 a).</li>
	<li>Évacuer les bulles d’air dans les tubes pour éviter le blocage de l’air.</li>
	<li>Compter le nombre de goutte à goutte de la pointe de micron du crayon pour 10 s et de régler manuellement le régulateur de débit pour maintenir la vitesse d’écoulement à une vitesse approximative de 3 goutte à goutte/10 s.</li>
</ol> 5. Mesures de Ca intracellulaire 2 + transitoire et le raccourcissement du sarcomère 7 , 8 , 9 <ol><li>Pipette 10 µL de la suspension cellulaire dans la diapositive, compter le nombre de cellules par un compteur de cellules au microscope et calculer la masse volumique. Diluer les myocytes à une concentration approximative de 50 000 cellules/mL.</li>
	<li>Ajouter la Fura-2 acétoxyméthyl (AM) stock (un colorant photosensible de calcium) dans une suspension de 1 mL de myocytes pour abaisser la concentration finale de 2 µM. maintenir dans l’ignorance pendant 20 min à température ambiante.</li>
	<li>Centrifuger à 150 g pour 30 s et remettre en suspension les cardiomyocytes avec solution NT 2 fois.</li>
	<li>Tour hors de la lumière et de garder les cellules dans l’obscurité. Placer les myocytes dans la chambre de perfusion pendant 15 min. Ensuite, démarrez la perfusion de chambre (1,5 mL/min) avec solution de NT. Les myocytes de pair avec une stimulation de champ de 1 Hz à l’aide d’un stimulateur (durée d’onde 4,0 ms, amplitude d’impulsion 8,0 V) pendant 5 min.</li>
	<li>Sélectionner un myocyte avec bonne forme (forme de la tige, arête vive et effacer les stries croisées) et contraction stimulée stable (pas de contraction spontanée) sous les 10 x objectif microscopique. Ensuite, changer le grossissement microscopique à 40 x et faire pivoter l’orientation de la caméra CCD pour garder le myocyte en position horizontale.</li>
	<li>Cadre du myocyte unique en ajustant l’adaptateur de cadrage de cellule. Assurez-vous que le fond est clair.</li>
	<li>Exposer les myocytes de la lumière émise par une lampe au xénon, avec 340 ou 380 nm longueur d’onde excitation des filtres et image les myocytes à travers un objectif 40 x. Détecter le signal de fluorescence à 510 nm. En attendant, notez les changements de longueur du sarcomère des myocytes et enregistrer à l’aide du module de soft-edge simultanément.</li>
	<li>Record de fluorescence par un système de double excitation fluorescence photomultiplicateur. Exécuter le programme d’enregistrement pour le calcium, système d’imagerie, cliquez sur &#34; fichier/nouveau fichier &#34; pour créer un nouveau fichier d’enregistrement, cliquez sur le &#34; début &#34; bouton à enregistrer de façon synchrone fluorescence et sarcomère longueur.</li>
</ol> 6. Évaluation de SR Ca 2 + réserve et diastolique Ca 2 + fonction de suppression de 8 , 7 , 9 <ol><li>Interlink le &#34; Aux Out &#34; port en le stimulateur avec le &#34; analogue à &#34; port sur le système de contrôle de valve (p. ex., commandant de la vanne, voir Table des matières) par un câble BNC (pour synchroniser le signal TTL).</li>
	<li>Preset un programme pour les robinets de perfusion de commutation automatiquement comme décrit précédemment 8 , 9 ; La procédure détaillée pour l’opération est répertoriée comme suit.
	<ol><li>Preset les paramètres dans la valve de contrôlent de logiciel selon le tableau 2, puis cliquez sur le &#34; téléchargement &#34; le bouton pour télécharger la séquence chargés dans le programme. Cliquez sur le &#34; Trigger &#34; bouton pour activer la fonction déclencheur. 
		Remarque : Le système de contrôle de valve peut exécuter la séquence après avoir reçu le signal TTL.</li>
		<li>Prédéfinir le stimulateur dans mode de séquence et réglez les paramètres selon le tableau 3.</li>
	</ol></li> <li>Définir le stimulateur à &#34; S1 étape &#34; pour rythmer le LV myocytes à 1 Hz. démarrer la perfusion de l’aiguille à la vitesse de 1,5 mL/min avec une solution NT. 
	NOTE : Parce que la vitesse du flux de l’aiguille est plus rapide que la perfusion de la chambre, la réfraction de lumière du flux de l’aiguille est différente de la réfraction de la perfusion de la chambre. La différence de réfraction indique la plage de perfusion efficace de l’aiguille, qui entoure la cible myocyte.</li>
	<li>Sélectionner une cible myocyte sous la vue microscopique de faible puissance (dans l’ordre de l’aval vers l’amont), et assurez-vous qu’il peut être atteint par la micro pointe du crayon. Changer le grossissement du microscope à x 400. Faites pivoter l’orientation de la caméra CCD pour garder le myocyte en position horizontale. Régler l’ouverture rectangulaire dans l’adaptateur de cadrage de cellules vers une fenêtre adaptée qui emplit les myocytes. S’assurer qu’il n’y a fond minime ; ne permettent pas les autres myocytes ou des débris de cellules mortes dans cette fenêtre.</li>
	<li>Régler la position du crayon fixé sur le micromanipulateur et placer soigneusement la pointe micro à la distance du rayon du champ de vision pour le myocyte cible moins de 400 x grossissement du microscope.</li>
	<li>Régler la gamme des flux aiguille pour surtout couvrir le myocyte cible et assurez-vous que les myocytes ne peuvent être écartée par l’écoulement de l’aiguille.</li>
	<li>Après 60 s base arpentant, rouler le curseur de stimulateur de la &#34; étape de D2 &#34;. 
	NOTE : Le reste du protocole sera exécuté automatiquement par le stimulateur et le système de contrôle de valve. Selon la configuration ci-dessus, le protocole pourrait être exécuté automatiquement comme dans la Figure 2 a, 1Hz base stimulation avec solution NT pendant 60 s. Puis mettez en pause la stimulation et le délai de 2 s, rapidement passer à la perfusion de caféine de 10 mM pour 15 s (pour fonctionnellement libérer Ca 2 + stockage en RS) et puis rebasculer vers la solution NT.</li>
	<li>à la fin de l’enregistrement, détecter la fluorescence de fond pour des myocytes. Cliquez sur le &#34; pause &#34; bouton pour mettre en pause le fichier d’enregistrement, déplacer la vue microscopique sur une zone vide à proximité. Cliquez sur le &#34; dossier &#34; bouton pour reprendre l’enregistrement pour les secondes et enregistrement numérique 340 et 380 nm intensité des valeurs pour une correction de fond.</li>
	<li>Ouvert le &#34; opération/Constant &#34; boîte de dialogue et de remplir les valeurs dans le &#34; fond &#34; forment, respectivement, le logiciel permet de corriger les valeurs de ratio Fura 2 en soustrayant l’arrière-plan.</li>
</ol> 7. Analyse de données 9 <ol><li>pour les mesures transitoires du calcium et du sarcomère raccourcissement au stade de la stimulation base, en moyenne les impulsions de la secousse et ensuite analyser les paramètres dynamiques, tels que les transitoires de calcium, la constante de temps décomposition du calcium transitoire (Tau-1 Hz), en utilisant le logiciel automatiquement. 
	Remarque : Si le logiciel ne tient pas bien le segment de la carie, exporter la trace de déclin pour l’ajustement de courbe exponentielle mono manuel.</li>
	<li>Pour des impulsions de calcium induit par la caféine, sélectionnez uniquement le pouls avec une vague raide pour l’analyse de la fonction de suppression de calcium. Exclure les cellules avec perturbation de signal, pouls anormal ou ceux qui s’écoulait à mi-chemin away.</li>
	<li>Mesurer l’amplitude de l’impulsion de calcium induit par la caféine (Ca-caféine, un index de SRCa 2 + réserve).</li>
	<li>Obtenir la constante de temps de désintégration d’impulsion de calcium induit par la caféine (Tau-caféine) par une courbe exponentielle-mono raccord (durée de 10 s) manuellement depuis le logiciel ( Figure 2).</li>
</ol>

<ol><li>Capel, R. A., Terrar, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+importance+of+Ca+%282%2B%29-dependent+mechanisms+for+the+initiation+of+the+heartbeat%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Physiol%22%5BJournal%5D)">The importance of Ca (2+)-dependent mechanisms for the initiation of the heartbeat.</a> Front Physiol. 6, 80(2015).</li>
<li>Bers, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+cycling+and+signaling+in+cardiac+myocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Physiol%22%5BJournal%5D)">Calcium cycling and signaling in cardiac myocytes.</a> Annu Rev Physiol. 70, 23-49 (2008).</li>
<li>Zhao, S. M., Wang, Y. L., Guo, C. Y., Chen, J. L., Wu, Y. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progressive+decay+of+Ca2%2B+homeostasis+in+the+development+of+diabetic+cardiomyopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovasc+Diabetol%22%5BJournal%5D)">Progressive decay of Ca2+ homeostasis in the development of diabetic cardiomyopathy.</a> Cardiovasc Diabetol. 13, 75(2014).</li>
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<li>Ferrantini, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((R4496C+RyR2+mutation+impairs+atrial+and+ventricular+contractility%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gen+Physiol%22%5BJournal%5D)">R4496C RyR2 mutation impairs atrial and ventricular contractility.</a> J Gen Physiol. 147 (1), 39-52 (2016).</li>
<li>Li, L., Chu, G., Kranias, E. G., Bers, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+myocyte+calcium+transport+in+phospholamban+knockout+mouse+relaxation+and+endogenous+CaMKII+effects%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Cardiac myocyte calcium transport in phospholamban knockout mouse relaxation and endogenous CaMKII effects.</a> Am J Physiol. 274, H1335-H1347 (1998).</li>
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<li>Lai, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Rho+kinase+inhibitor%2C+fasudil%2C+ameliorates+diabetes-induced+cardiac+dysfunction+by+improving+calcium+clearance+and+actin+remodeling%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Med+%28Berl%29%22%5BJournal%5D)">The Rho kinase inhibitor, fasudil, ameliorates diabetes-induced cardiac dysfunction by improving calcium clearance and actin remodeling.</a> J Mol Med (Berl). 95 (2), 155-165 (2017).</li>
<li>Lai, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stretch+Current-Induced+Abnormal+Impulses+in+CaMKII%CE%B4+Knockout+Mouse+Ventricular+Myocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cardiovasc+Electrophysiol%22%5BJournal%5D)">Stretch Current-Induced Abnormal Impulses in CaMKIIδ Knockout Mouse Ventricular Myocytes.</a> J Cardiovasc Electrophysiol. 24 (4), 457-463 (2013).</li>
<li>Xu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alterations+of+L-type+calcium+current+and+cardiac+function+in+CaMKII%7Bdelta%7D+knockout+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Alterations of L-type calcium current and cardiac function in CaMKII{delta} knockout mice.</a> Circ Res. 107 (3), 398-407 (2010).</li>
<li>Roussel, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Palmitoyl-carnitine+increases+RyR2+oxidation+and+sarcoplasmic+reticulum+Ca2%2B+leak+in+cardiomyocytes%3A+Role+of+adenine+nucleotide+translocase%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Palmitoyl-carnitine increases RyR2 oxidation and sarcoplasmic reticulum Ca2+ leak in cardiomyocytes: Role of adenine nucleotide translocase.</a> Biochim Biophys Acta. 1852 (5), 749-758 (2015).</li>
<li>Yaras, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+diabetes+on+ryanodine+receptor+Ca2%2B+release+channel+%28RyR2%29+and+Ca2%2B+homeostasis+in+rat+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Effects of diabetes on ryanodine receptor Ca2+ release channel (RyR2) and Ca2+ homeostasis in rat heart.</a> Diabetes. 54 (11), 3082-3088 (2005).</li>
<li>Hu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adenovirus-Mediated+Overexpression+of+O-GlcNAcase+Improves+Contractile+Function+in+the+Diabetic+Heart%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Adenovirus-Mediated Overexpression of O-GlcNAcase Improves Contractile Function in the Diabetic Heart.</a> Circ Res. 96 (9), 1006-1013 (2005).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Le flux de calcium libéré de la SR est la Ca2 + source principale pour la systole au cœur. Dans une certaine mesure, l’amplitude de la SR Ca2 + contenu et fractionnaire Ca2 + libéré de la SR reflètent la SR Ca2 + réserve disponible pour la contraction cardiaque. En revanche, la Ca2 + réserve de SR dépend de la capacité du SR Ca2 + recaptage, Ca2 + fuite de SR et leur équilibre dans l’ensemble de la SR au cours de la diastole12<...

Calcium intracellulaire ([Ca2 +]i) recyclage joue un rôle essentiel dans la régulation de la fonction systolique et diastolique dans les cardiomyocytes1. Comme nous le savons, la calcium Ca2 + libération induite initie l’excitation-contraction de couplage, qui traduisent le signal électrique à la contraction. Dépolarisation de la membrane active le sarcolemme Ca L-type canaux2 + , qui induisent la Ca2 + libèrent de SR dans le cytoplasme par l’intermédiaire de récepteurs de la ryanodine (RyR2) de 2. Les transitoires élevées cytoplasmique Ca2 + initie la contraction des myofibrilles. Au cours de la diastole, cytoplasmique Ca2 + est reuptaken dans la SR au moyen de la SR Ca2 +-ATPase 2 (SERCA2) et pompé hors du cardiomyocyte via la Na+-Ca2 + échangeur (NCX)2. Ce processus conduit à la contraction-relaxation recyclage dans le cardiomyocyte.
Le SR cardiaque est un réseau de membrane intracellulaire qui entoure la machinerie contractile. Il sert un Ca2 + réservoir pour contraction et il réabsorbe intracellulaire Ca2 + lors du relâchement. La SR Ca2 + réserve disponible pour bat est déterminée pour la contractilité cardiaque. Pendant ce temps, la suppression du Ca intracellulaire2 + est critique pour la diastole cardiaque. Sous certaines conditions physiopathologiques, comme le diabète et une insuffisance cardiaque, ayant une déficience Ca2 + dégagement et déprimé SR Ca2 + magasin dans les cardiomyocytes peut être impliqué dans le processus de la dysfonction cardiaque2,3 ,4.
Pour mesurer la libération de SR Ca2 + et diastolique Ca2 + enlèvement dans les cardiomyocytes, il y a deux approches couramment : l’intégrité du NCX courant issu des patch clamp5,6et l’autorité de certification induit par la caféine 2 + pulse issu deCa 2 + fluorescence d’imagerie7,8,9. La première approche repose sur le fait que le Ca2 + libéré de la SR est largement pompé hors de la cellule par NCX. Toutefois, cette approche est limitée par son exigence d’équipements de pointe et l’exploitation habile. Dans la présente étude, nous décrivons une approche pratique pour évaluer le SR Ca2 + réserve et Ca2 + enlèvement dans les myocytes en mesurant un induit par la caféine Ca2 + pulse basé sur un Ca2 + fluorescence système d’imagerie. En bref, fluorescence intracellulaire de Ca2 + est indiqué par Fura-2. Par interconnexion du système de perfusion et un système de stimulation, nous présentons un programme pour passer la perfusion et le rythme de système automatiquement. 10 mM de caféine a été employé pour induire rapidement la libération totale de Ca2 + dans le SR. Les constantes de temps de décroissance exponentielle (Tau) des transitoires de calcium et des légumineuses de calcium induit par la caféine proviennent de la courbe exponentielle mono, qui reflètent la contribution de SERCA et NCX diastolique Ca2 + retrait en conséquence.

<table><tbody><tr><td>NaCl</td><td>Alfa Aesar</td><td>012314</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Alfa Aesar</td><td>012315</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Alfa Aesar</td><td>11595</td><td></td></tr><tr><td>HEPEs</td><td>Sigma</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>D-Glucose</td><td>Alfa Aesar</td><td>A16828</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Alfa Aesar</td><td>A18395</td><td></td></tr><tr><td>KOH</td><td>Alfa Aesar</td><td>A18854</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Alfa Aesar</td><td>011594</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Alfa Aesar</td><td>3337</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamic</td><td>Alfa Aesar</td><td>A15031</td><td></td></tr><tr><td>Taurine</td><td>Alfa Aesar</td><td>A12403</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma</td><td>E3889</td><td></td></tr><tr><td>Collagénase A</td><td>Roche</td><td>10103586001</td><td></td></tr><tr><td>Collagénase Type II</td><td>Worthington</td><td>LS004177</td><td></td></tr><tr><td>BSA Roche</td><td></td><td>735094</td><td></td></tr><tr><td>caféine</td><td>Sigma</td><td>C0750</td><td></td></tr><tr><td>Fura-2 AM</td><td>Invitrogen</td><td>F1201</td><td></td></tr><tr><td>Microscope</td><td>Olympus</td><td>Olympus IX 71</td><td></td></tr><tr><td>Système Langendorff</td><td>Beijing Syutime Technology Co</td><td>PlexiThermo-S-LANGC</td><td></td></tr><tr><td>Micromanipulateur</td><td>Marchauser</td><td>MM33 liens</td><td></td></tr><tr><td>Chambre de perfusion</td><td>IonOptix</td><td>FHD Système de</td><td></td></tr><tr><td>perfusion par gravité contrôlé ALA</td><td></td><td>VC 3-8</td><td></td></tr><tr><td>Logiciel de commande de soupape</td><td>ALA</td><td>VC 3 1.0.1.2</td><td></td></tr><tr><td>Régulateur de débit de précision</td><td>Delta Med 3204315</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Multi-Barrel Manifold Perfusion Pencil</td><td>AutoMate Scientific</td><td>04-08-[360]</td><td></td></tr><tr><td>Micron Embout amovible</td><td>AutoMate Scientific</td><td>360um i.d.</td><td></td></tr><tr><td>Systèmes de mesure de fluorescence et de dimensionnement cellulaire</td><td>IonOptix</td><td>Hyperswitch</td><td></td></tr><tr><td>Logiciel d’enregistrement</td><td>IonOptix</td><td>IonWizard 6.2.59</td><td></td></tr><tr><td>Stimulateur</td><td>IonOptix</td><td>MyoPacer EP</td><td></td></tr><tr><td>Rats Sprague-dawley</td><td>Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co.</td><td>SCXK 2016-01-007436</td><td></td></tr></tbody></table>

Évaluation de réticulum sarcoplasmique calcium réserve et intracellulaires de calcium diastolique enlèvement dans les cardiomyocytes ventriculaires isolées

Assessment of Sarcoplasmic Reticulum Calcium Reserve and Intracellular Diastolic Calcium Removal in Isolated Ventricular Cardiomyocytes

Recyclage de calcium intracellulaire joue un rôle essentiel dans la régulation de la fonction systolique et diastolique dans les cardiomyocytes. Réticulum sarcoplasmique cardiaque (SR) sert d’un Ca2 + réservoir de contraction, qui reuptakes intracellulaire Ca2 + lors du relâchement. La SR Ca2 + réserve disponible pour bat est déterminée pour la contractilité cardiaque, et la suppression du Ca intracellulaire2 + est critique pour la fonction cardiaque diastolique. Dans certaines conditions physiopathologiques, comme le diabète et l’insuffisance cardiaque, le dégagement de calcium ayant une déficience et SR Ca2 + store dans les cardiomyocytes peuvent être impliqués dans la progression du dysfonctionnement cardiaque. Nous décrivons ici un protocole pour évaluer SRCa2 + réserve et diastolique Ca2 + suppression. En bref, un cardiomyocyte unique a été isolée par voie enzymatique, et la fluorescence2 + Ca intracellulaire indiquée par Fura-2 a été enregistrée par un système d’imagerie calcique. Pour utiliser une caféine pour induire la libération totale de SR Ca2 + , nous prédéfinir un assorties de perfusion automatique interconnexion la stimulation et le système de perfusion. Ensuite, l’ajustement de la courbe exponentielle mono a été utilisé pour analyser les constantes de temps de désintégration des transitoires de calcium et des légumineuses de calcium induit par la caféine. En conséquence, la contribution de la SR Ca2 +-ATPase (SERCA) et Na+-Ca2 + échangeur (NCX) à l’élimination du calcium diastolique a été évaluée.

Ici, nous illustrons la streptozotocine (STZ) - induced rats diabétiques (DM) et appariés selon l’âge Sprague - Dawley (SD) les rats par exemple. des rats SD mâles âgés de 8 semaines (200 ± 20 g) a reçu une injection intrapéritonéale de STZ (70 mg/kg, ip) pour le tampon de groupe ou citrate de DM pour le groupe témoin. Une semaine après l’administration de STZ, rats avec glycémie &#62; 16,7 mmol/L ont été considérés comme diabétique. Après 8 semaines, les myocytes LV ont été enzymatiqueme...

Recyclage de calcium intracellulaire joue un rôle essentiel dans la régulation de la fonction systolique et diastolique dans les cardiomyocytes. Nous décrivons ici un protocole pour évaluer le réticulum sarcoplasmique Ca2 + réserve et fonction de suppression de calcium diastolique dans les cardiomyocytes en un système d’imagerie de calcium.

Évaluation de réticulum sarcoplasmique Calcium réserve et intracellulaires de Calcium diastolique enlèvement dans les Cardiomyocytes ventriculaires isolées

Intracellular calcium recycling plays a critical role in regulation of systolic and diastolic function in cardiomyocytes. Cardiac sarcoplasmic reticulum ...

L'objectif général de cette procédure est d'évaluer la réserve calcique du réticulum sarcoplasmique et la fonction d'élimination intracellulaire du calcium diastolique dans des cardiomyocytes isolés. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés concernant le mécanisme de gestion du calcium intracellulaire dans certaines conditions physiopathologiques telles que le diabète et l'insuffisance cardiaque. Le principal avantage de cette technique réside dans sa facilité d'utilisation et dans le fait qu'elle est moins limitée par les contraintes techniques et matérielles.Pour commencer cette procédure, installez le système de perfusion de Langendorff. Remplissez le système de perfusion avec la solution NT, réglez la température à 36,5 degrés Celsius et éliminez toutes les bulles d'air dans le tube. Ensuite, ouvrez la cavité abdominale sous le processus xiphoïde, soulevez le processus xiphoïde et ouvrez la poitrine avec une paire de ciseaux.Ensuite, retirez le péricarde, soulevez légèrement le cœur à l’aide de pinces courbes, identifiez l’arc aortique, puis détachez le cœur à la racine de l’aorte. Transférez ensuite le cœur dans une boîte de 60 millimètres et rincez-le avec la solution NT. Saisissez l’aorte à l’aide de deux pinces microchirurgicales et montez-la sur la canule de perfusion Langendorff.Ensuite, ligaturez fermement l'aorte sur la canule à l'aide de fils chirurgicaux. Ensuite, perfusez le cœur avec 30 millilitres de solution NT afin de rétablir la circulation dans les artères coronaires. Puis, changez le liquide de perfusion pour 30 millilitres de solution de Tyrode sans calcium afin d'arrêter les battements cardiaques.Ensuite, passez au solution d'isolement à la collagénase A pour la digestion enzymatique. Après une digestion de 20 à 25 minutes, changez rapidement la solution de perfusion pour la solution de Tyrode sans calcium afin d'arrêter la digestion. Puis saisissez le cœur avec une pince, détachez-le de la canule et placez le cœur dans une boîte de 35 millimètres contenant la solution KB.Ensuite, repérez la zone du ventricule gauche. Retirez l'oreillette, le ventricule droit et la région de la jonction atrioventriculaire. Puis, transférez le ventricule gauche dans une nouvelle boîte de 35 millimètres contenant la solution KB et hachez le tissu en petits morceaux.Agiter doucement les morceaux à l’aide d’un compte-gouttes en plastique stérile. Ensuite, filtrer les cellules à l’aide d’un filtre en acier inoxydable de 150 microns et transférer le filtrat dans un tube conique de 15 millilitres. Puis, centrifuger l’échantillon à 150 × g pendant 30 secondes et éliminer le surnageant.Resuspendre les myocytes dans 10 millilitres de solution KB et laisser décanter pendant six minutes. Ensuite, éliminer le surnageant et resuspendre le culot dans 10 millilitres de solution KB pendant 20 minutes. Après décantation dans la solution KB pendant 20 minutes, éliminer le surnageant et resuspendre les myocytes dans la solution A de réintroduction du calcium. Répéter la procédure ci-dessus avec la solution B d'introduction du calcium. Puis répéter la procédure ci-dessus avec la solution NT afin de purifier les myocytes disponibles.Conserver les myocytes ventriculaires isolés dans cette solution et les étudier dans un délai de quatre à six heures. Ensuite, ajouter la solution NT et la solution de caféine à 10 millimolaire à chaque colonne du crayon. Éliminer toutes les bulles d'air présentes dans les tubes afin d'éviter un blocage par l'air.Maintenant, reliez le tube d'entrée à la solution NT pour la perfusion de la chambre. Pour la perfusion par aiguille du myocyte cible, connectez l'extrémité du manodistributeur multicanal au système de perfusion contrôlé par valve. Ensuite, comptez le nombre de gouttes sortant de l'extrémité micrométrique du stylet pendant 10 secondes et ajustez manuellement le régulateur de débit pour maintenir la vitesse d'écoulement à environ trois gouttes par 10 secondes.Dans cette procédure, ajouter le stock de fura-2-acétoxyméthyle dans un millilitre de la suspension de myocytes afin d'obtenir une concentration finale de deux micromoles par litre. Incuber à l'abri de la lumière pendant 20 minutes à température ambiante. Ensuite, éliminer le surnageant et resuspendre les cardiomyocytes dans la solution NT deux fois.Ensuite, éteignez la lumière et maintenez les cellules à l’obscurité. Placez les myocytes dans la chambre de perfusion pendant 15 minutes avant de les perfuser avec la solution NT. Stimulez les myocytes à un hertz par stimulation de champ pendant cinq minutes à l’aide d’un stimulateur.Maintenant, sélectionnez un myocyte présentant une bonne forme et une contraction provoquée stable sous l'objectif microscopique 10X. Cliquez sur Fichier Nouveau fichier pour créer un nouveau fichier d'enregistrement. Ensuite, modifiez le grossissement microscopique à 40X et faites pivoter l'orientation de la caméra CCD afin de maintenir le myocyte en position horizontale.Ensuite, cadrer le myocyte unique en ajustant l'adaptateur de cadrage cellulaire et s'assurer que le fond est clair. Exposer ensuite les myocytes à la lumière émise par une lampe au xénon équipée de filtres d'excitation de longueurs d'onde de 340 ou 380 nanomètres et observer les myocytes à travers un objectif 40X. Détecter le signal fluorescent à 510 nanomètres.Cliquez sur le bouton Démarrer pour enregistrer simultanément la fluorescence et la longueur des sarcomères à l’aide du système de photomultiplicateur à double excitation. Observez les variations de la longueur des sarcomères des myocytes et effectuez l’enregistrement simultanément à l’aide du module à bord doux. Dans cette procédure, reliez le port auxiliaire de sortie du stimulateur à l’entrée analogique du système de commande des vannes à l’aide d’un câble BNC.Ensuite, préréglez les paramètres dans le logiciel de commande de la vanne, cliquez sur le bouton de téléchargement pour télécharger la séquence chargée dans le programme, puis cliquez sur le bouton de déclenchement pour activer la fonction de déclenchement. Puis, préréglez le stimulateur en mode séquence et configurez les paramètres. Par la suite, réglez le stimulateur à l'étape S1 afin de stimuler les myocytes du VG à un hertz.Commencer la perfusion par aiguille à une vitesse de 1,5 millilitre par minute avec la solution NT. Sélectionner un myocyte cible en vision microscopique à faible grossissement et s'assurer qu'il peut être atteint par la micro-pointe du crayon. Ensuite, changer le grossissement du microscope à 400X.Positionnez l'orientation de la caméra CCD de manière à maintenir le myocyte en position horizontale. Réglez ensuite l'ouverture rectangulaire située sous l'adaptateur de cadrage cellulaire afin d'obtenir une fenêtre adaptée qui englobe les myocytes. Ajustez ensuite la position du stylet fixé sur le micromanipulateur et placez soigneusement la microsonde à une distance égale au rayon du champ de vision par rapport au myocyte cible.Ensuite, ajustez la portée du flux de l'aiguille pour couvrir principalement le myocyte cible et assurez-vous que le myocyte ne puisse pas être emporté par le flux de l'aiguille. Après 60 secondes de stimulation de base, faites passer le curseur du stimulateur à l'étape D2. Le reste du protocole sera exécuté automatiquement par le stimulateur et le commande-vannes.Cliquez sur le bouton Pause pour interrompre l'enregistrement du fichier et déplacer la vue microscopique vers une zone voisine vide. Ensuite, cliquez sur le bouton Enregistrer pour reprendre l'enregistrement pendant quelques secondes et enregistrer les valeurs numériques d'intensité aux longueurs d'onde de 340 et 380 nanomètres destinées à la correction du fond. Après cela, ouvrez la boîte de dialogue Constante d'opération et saisissez les valeurs dans le formulaire de fond.Le logiciel peut corriger les valeurs du rapport fura-2 en soustrayant le fond. On illustre ici le protocole de commutation automatique des vannes de perfusion et du système de stimulation. Cette figure présente les valeurs statistiques de la réserve calcique du réticulum sarcoplasmique et du relâchement calcique fractionnel pour des contractions stimulées à un hertz dans les groupes diabétiques et Sprague Dawley.Le groupe diabétique a montré une réserve calcique du réticulum sarcoplasmique et une libération calcique fractionnelle du réticulum sarcoplasmique significativement réduites par rapport au groupe Sprague Dawley. Ici, le panneau logiciel montre un ajustement manuel par une courbe mono-exponentielle pour la constante de temps de décroissance du pulse calcique induit par la caféine. Ces graphiques en barres comparent le Tau-caféine et le rapport Tau-1Hz/Tau-caféine entre les groupes diabétique et Sprague Dawley.Le groupe diabétique a montré des valeurs significativement augmentées de Tau-caféine et de Tau-1Hz/Tau-caféine par rapport au groupe Sprague Dawley. Cette procédure fournit un outil réalisable et pratique pour explorer le mécanisme de régulation calcique intracellulaire dans la dysfonction cardiaque. Lors de la réalisation de cette procédure, certains points essentiels doivent être pris en compte, tels que l'adhérence stable des myocytes à la boîte, l'enroulement du commutateur de canal, le contrôle de la vitesse d'écoulement de la perfusion par aiguille et la distance appropriée entre la pointe de l'aiguille et le myocyte cible.

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