Un modèle de Culture cellulaire des artères de résistance

L’objectif global de cette technique est de cultiver des cellules endothéliales et musculaires lisses ensemble in vitro pour créer des jonctions myoendothéliales qui se produisent dans les artères de résistance de petit diamètre. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine cardiovasculaire telles que la localisation des protéines et l’activation des cascades de signalisation dans la paroi artérielle. Le principal avantage de cette technique est que vous pouvez isoler spécifiquement les fractions de jonction myoendothéliale de l’endothélium et du muscle lisse, ce qui est impossible à faire avec une artère réelle.

La démonstration visuelle d’un enrobage de paraffine est particulièrement critique, car les étapes d’enrobage peuvent être difficiles à apprendre sans voir le processus. Commencez la construction de la co-culture de cellules vasculaires ou VCCC, en vaporisant des boîtes de Pétri et des couvercles de 150 millimètres avec un désinfectant, puis en essuyant avec une serviette en papier ou des lingettes non pelucheuses. Ensuite, vaporisez les boîtes de Pétri avec de l’éthanol à 70 % et placez-les dans la hotte pour les faire sécher à l’air.

Ouvrez la plaque des inserts filtrants dans des conditions stériles. Enduisez la face inférieure des filtres avec une solution de fiberactin en pipetant jusqu’à un millilitre de solution de fiberactin à travers les fentes latérales dans le bas de la plaque. Assurez-vous que la moitié inférieure du filtre est couverte et laissez les inserts dans la hotte, en gardant le couvercle de la plaque.

Après 30 minutes de traitement avec la solution Fiberaction, aspirez tout excès de solution sans déranger les inserts filtrants. Ensuite, retournez la plaque en plaçant les filtres dans la moitié inférieure de la boîte de Pétri propre. Trypsinisez un flacon de 225 centimètres carrés de cellules musculaires lisses avec trois millilitres de solution de trypsine EDTA préchauffée.

Une fois que les cellules ont décollé, ajoutez neuf millilitres de milieu SMC pour neutraliser la trypsine. Transférer dans un tube conique et bien mélanger. Ensuite, pipetez 10 microlitres sur un hémocytomètre pour déterminer le nombre de cellules.

Après avoir effectué un comptage cellulaire, plaquez soigneusement 750 microlitres de suspension cellulaire contenant environ 75 000 cellules musculaires lisses sur la face inférieure de chaque filtre. Incuber l’assiette à 37 degrés Celsius pendant la nuit. Le deuxième jour, remplissez chaque puits d’une assiette propre à six puits avec deux millilitres de milieu SMC frais préchauffé.

Retirez le fluide d’un insert par aspiration et transférez-le sur la plaque à six puits avec un fluide SMC. Ajouter un millilitre d’une solution de gélatine bovine à 0,5 % sur la face supérieure des inserts et placer à 37 degrés Celsius, pendant au moins 30 minutes. Trypsinisez un flacon de 225 centimètres carrés de cellules endothéliales avec trois millilitres de solution de trypsine EDTA préchauffée.

En tapotant doucement le ballon pour soulever les cellules de la plaque. Après avoir remis les cellules en suspension dans le milieu EC et effectué un comptage des cellules, retirez la gélatine du filtre. Ensuite, plaquez 360 000 EC dans un volume d’un millilitre sur la face supérieure de chaque insert filtrant.

Laissez les cellules incuber sans être dérangées à 37 degrés Celsius pendant 24 heures. Commencer le fractionnement, en aspirant le milieu d’une plaque à six puits d’inserts dans la hotte de culture cellulaire, puis transporter dans une chambre froide sur de la glace. Dans la chambre froide, pipetez 10 microlitres de PBS sur le côté SMC des inserts.

Utilisez l’élévateur de cellules pour racler les SMC. Ensuite, transférez les cellules du grattoir dans une boîte de Pétri étiquetée contenant un tampon de lyse. Une fois que le grattoir a touché le tampon de lyse, ne le laissez pas toucher le filtre à insert tant qu’il n’a pas été complètement essuyé et séché sur du papier absorbant.

Répétez l’élimination du filtre SMC une ou deux fois de plus, pour éliminer complètement les débris restants de la cellule SMC. Ensuite, pipetez 10 microlitres de PBS sur le côté des cellules endothéliales du filtre à insert. Grattez les cellules dans une boîte de Pétri correctement étiquetée de tampon de lyse, comme cela vient d’être démontré.

Prélevez la boue cellulaire du côté EC du filtre à l’aide de la pipette et transférez-la dans une boîte de Pétri étiquetée de manière appropriée. Soyez très minutieux dans le grattage des cellules des deux côtés des filtres pour assurer une contamination cellulaire minimale dans la fraction de jonction myoendothéliale. Ensuite, utilisez soigneusement le scalpel pour découper les filtres de l’insert en plastique.

Pour ce faire, coupez 70 à 80 % du plastique et utilisez une pince pour retirer complètement le filtre de la structure de l’insert en plastique. Dirigez chaque filtre dans un tube conique de 50 millilitres étiqueté contenant un tampon de lyse. Assurez-vous que les filtres sont immergés dans le tampon et restent humides.

Une fois que toutes les cellules ont été récoltées à partir des filtres, agitez le tube MEJ de 50 millilitres à pleine puissance pendant 15 secondes ou jusqu’à ce qu’il soit bien mélangé. Retirez les filtres de la conique MEJ à l’aide d’une pince, en les faisant glisser le long des parois latérales du tube afin de laisser le maximum de protéines et de liquides dans le tube. Une fois que tous les filtres ont été retirés du tube conique MEJ, faites un tour rapide dans une centrifugeuse pour tirer tout le liquide et les protéines au fond du tube.

Après l’essorage, transférez le contenu du tube MEJ et des boîtes de Pétri SMC et EC dans des tubes à centrifuger séparés plus petits. Ensuite, centrifugez les tubes à près de 16 000 x G pendant 15 minutes à quatre degrés Celsius. Retirez les surnageants.

Ensuite, analysez la teneur en protéines des lysats cellulaires à l’aide d’un dosage byzinconétique. Le cinquième jour d’incubation du VCCC, ajouter 4 % de PFA dans chaque puits contenant un insert filtrant rincé et incuber toute la nuit en agitant à quatre degrés Celsius. Après environ 24 heures, transférez les inserts à 70 % d’éthanol pendant au moins 24 heures.

Traitez les filtres sur un long cycle sur un processeur de tissus automatisé. Après le passage, retirez un filtre de sa cassette à l’aide d’une pince pour maintenir le filtre sur le bord, puis coupez le filtre en deux avec des ciseaux. Posez chacune des deux moitiés sur une plaque froide et remplissez le moule d’enrobage de paraffine liquide.

Touchez très brièvement le moule d’enrobage rempli sur la plaque froide, puis intégrez chaque moitié du filtre dans le moule d’enrobage avec le côté coupé vers le bas pour vous assurer que le filtre est sectionné à partir du centre. Utilisez une pince pour maintenir le filtre en place afin d’empêcher les moitiés de tomber les unes dans les autres jusqu’à ce que la paraffine soit suffisamment froide pour qu’elles puissent rester autonomes. Ensuite, déplacez le moule d’enrobage sur une plaque froide jusqu’à ce qu’il se solidifie complètement.

Intégrez et sectionnez l’insert filtré dans une orientation verticale. Après section, le VCCC peut être immunomarqué pour l’immunofluorescence transverse. Cette image au microscope électronique à immunotransmission montre une artère de souris avec l’expression de l’alphaglobine au niveau de la MEJ marquée par des billes d’or, qui apparaissent sous forme de points noirs.

Ce western blot démontre que l’expression de l’inhibiteur de l’activateur du plasminogène 1 est enrichie dans la fraction MEJ par rapport aux fractions EC ou SMC. La CE en plastique indique les CE cultivées sur une parabole en plastique qui ne forment pas de MEJ. L’immunomarquage révèle la compartimentation étroite du modèle VCCC.

Le récepteur adrénergique alpha-1 n’est visible que dans la couche de cellules musculaires lisses, le récepteur de la bradykinine n’est visible que dans la couche de cellules endothéliales. La coloration de l’actine F se produit dans les deux types de cellules au niveau de la MEJ in vitro, comme l’indique la flèche blanche. Lors de cette procédure, il est important de se rappeler de tout garder stérile jusqu’au moment de la récolte, de plaquer soigneusement les cellules et de bien racler les filtres.

Suite à cette procédure, d’autres méthodes telles que le western blot ou l’immunofluorescence peuvent être effectuées afin de répondre à des questions supplémentaires sur la localisation, les niveaux d’expression ou l’activation des protéines.