Préparation de l’échantillon d’Identification basé sur la spectrométrie de masse des régions de liaison à l’ARN

L’objectif global de cette procédure est d’identifier les protéines de liaison à l’ARN dans les cellules vivantes et de cartographier leurs régions de liaison à l’ARN à l’aide d’une photo-réticulation médiée par UV suivie d’une spectrométrie de masse. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de l’épigénétique, telles que les régulateurs épigénétiques liés à l’ARN et les régions protéiques nécessaires aux interactions. Le principal avantage de cette technique est qu’elle n’implique pas de purification des complexes d’ARN protéiques, et nécessite donc peu de matériel et identifie les protéines liées à tout type d’ARN.

Telle que présentée, cette méthode se concentre sur les protéines nucléaires parce que c’est notre intérêt scientifique, mais avec des modifications mineures dans les étapes de fractionnement, elle pourrait être utilisée pour étudier l’ARN et les protéines de liaison dans d’autres compartiments étudiés. Après avoir cultivé et développé des ESC de souris conformément au protocole de texte, développez les cellules jusqu’au nombre requis de plaques de 10 centimètres. Avant que les plaques n’atteignent la confluence, ajoutez quatre SU directement dans le milieu jusqu’à une concentration finale de 500 micromolaires.

Laissez les paraboles de contrôle 4sU non traitées. Secouez doucement les plaques pour répartir uniformément le 4sU dans tout le milieu, puis remettez les plaques dans le même incubateur de culture tissulaire pendant deux heures. L’efficacité de l’incorporation de 4sU varie selon les types de cellules, et il peut donc être nécessaire d’optimiser sa concentration et son temps d’incubation pour assurer une réticulation efficace et minimiser la toxicité.

Ensuite, transférez les assiettes dans un seau à glace et jetez le fluide. Ensuite, utilisez 5 millilitres de PBS glacé pour rincer délicatement les plaques. Ajoutez 2 millilitres de PBS glacé et placez les plaques sans couvercles dans un réticulant équipé d’ampoules émettrices UV-B.

Irradiez les plaques à une énergie de 1 joule par centimètre carré. Une réticulation UV efficace est essentielle. Nous recommandons d’utiliser la lumière UV-B, mais les UV-A peuvent également être utilisés.

Dans tous les cas, la quantité d’énergie UV utilisée doit être optimisée et peut être surveillée par PAR-CLIP ou ChIRP. Utilisez des élévateurs de cellules pour collecter les cellules et les transférer dans du PBS glacé dans des tubes coniques. Ensuite, centrifugez les cellules à 2000 fois g et quatre degrés Celsius pendant cinq minutes.

Retirez le surnageant et remettez en suspension la pastille cellulaire dans cinq millilitres de PBS glacé avec 2 millimolaires d’EDTA et 0,2 millimolaire de PMSF. À l’aide d’un hémocytomètre, comptez les cellules. Attendez-vous à cinq à dix et dix à vingt millions de cellules à partir de plaques de 10 centimètres et de 15 centimètres, respectivement.

Ensuite, centrifugez les cellules à 2000 fois g et 4 degrés Celsius pendant cinq minutes. Pour isoler les noyaux des cellules, préparez le tampon A glacé comme indiqué dans le protocole de texte. Avant l’utilisation, ajoutez 0,5 millimolaire de DTT et 0,2 millimolaire de PMSF à la quantité souhaitée de tampon A.Ajoutez 2 millilitres de tampon froid aux cellules pour les laver, puis faites tourner les cellules à 2500 fois g et quatre degrés Celsius pendant cinq minutes.

Jetez le surnageant et ajoutez le tampon A complété par 0,2 % d’un détergent non ionique et non dénaturant, puis faites pivoter l’échantillon à 4 degrés Celsius pendant cinq minutes. Après avoir fait tourner les cellules à 2500 fois g pendant cinq minutes, retirez le surnageant. La pastille comprend des noyaux intacts dépourvus de cytoplasme.

Pour lyser les noyaux, ajoutez 200 microlitres de tampon de lyse dans le tube. Utilisez une sonde de 1/8e de pouce pour soniser l’échantillon afin de cisailler la chromatine à une amplitude de 50 % pendant cinq à dix secondes. Faites tourner l’échantillon à 12000 fois g pendant cinq minutes et ne prélevez que 175 microlitres de surnageant pour éviter la pastille.

Ensuite, mesurez la concentration en protéines à l’aide du test Bradford ou d’une technique similaire. Ensuite, utilisez un tampon de lyse pour diluer la protéine dans les différents échantillons à 1 milligramme par millilitre ou à la concentration la plus basse de l’échantillon. Ajouter une solution de DTT de 5 millimolaires au lysat nucléaire et incuber l’échantillon à température ambiante pendant une heure.

Ensuite, ajoutez 14 millimolaires d’iodoacétamide de stock frais et incubez le lysat à température ambiante dans l’obscurité pendant 30 minutes. Diluez le lysat avec cinq fois le volume de bicarbonate d’ammonium de 50 millimolaires, puis ajoutez de la trypsine. Incuber l’échantillon à 37 degrés Celsius pendant la nuit.

Pour préparer une pointe de platine sur mesure par échantillon, placez un disque de matériau d’extraction en phase solide C18 au fond d’une pointe de pipette de 200 microlitres. Ajoutez 50 microlitres de résine Oligo R3 à phase inverse sur le disque C18, puis placez l’embout de l’étage à l’intérieur d’un adaptateur de centrifugation et placez l’adaptateur à l’intérieur d’un tube de microfuge de 1,5 millilitre. Ajoutez 100 microlitres de 100 % d’acétonitrile aux pointes pour les laver.

Ensuite, centrifugez les pointes à 1000 fois g pendant une minute pour éliminer le solvant. Équilibrez les pointes avec 50 microlitres d’acide trifluoroacétique à 0,1 % ou TFA. Ensuite, faites-les tourner à nouveau.

Ajoutez 100 % d’acide formique à l’échantillon de protéines digérées pour réduire le PH à 2 à 3. Ensuite, chargez l’échantillon sur une pointe de platine sur mesure et centrifugez l’échantillon à 1000 fois g pendant une minute jusqu’à ce que tout l’échantillon passe par la pointe. Lavez les peptides liés avec 50 microlitres de TFA à 0,1 %.

Ensuite, après avoir fait tourner l’échantillon à 1000 fois g pendant une minute, éluez les peptides en ajoutant 50 microlitres de tampon d’élution à l’extrémité de l’étage et centrifugez à 1000 fois g pendant une minute pour forcer le tampon d’élution à sortir de l’extrémité. Pour sécher l’échantillon, à l’aide d’une centrifugeuse à vide réglée à 150 fois g et de 1 à 3 kilopascals, pendant une heure. Pour éliminer l’ARN réticulé de l’échantillon, remplacez la pastille en suspension dans 50 microlitres de tampon de nucléase 2x.

Mesurez la concentration peptidique à 280 nanomètres en supposant 1 milligramme par millilitre de peptides pour et A280 de 1. Utilisez 2x tampon de nucléases pour ajuster tous les échantillons à un milligramme par millilitre ou à la concentration la plus faible, puis préparez un mélange principal de 50 microlitres d’eau plus 1 microlitre de nucléase de haute pureté par échantillon. Combinez 50 microlitres d’échantillon peptidique avec 50 microlitres d’eau et un mélange maître de nucléases.

Ensuite, incubez l’échantillon à 37 degrés Celsius pendant une heure. Enfin, effectuez la chromatographie nanoliquide, la spectrométrie de masse et le traitement des données selon le protocole texte. Cette figure montre un graphique volcanique d’un résultat d’identification RBR à partir d’ESC de souris.

Les peptides qui se chevauchent avec un domaine de motif de reconnaissance de l’ARN sont en bleu et présentent des niveaux de déplétion très constants. Un peptide de liaison à l’ARN de HNRNPC est surligné en rouge. Voici une carte thermique des scores d’identification RBR qui sont calculés comme une estimation de la probabilité de liaison à l’ARN d’une région protéique.

Le score est projeté à la surface de la sous-unité épissodique U1-70k. La couleur rouge vif au voisinage du contact de l’ARN, déterminée par la structure cristalline, indique une identification correcte de l’interaction entre l’ARN de la protéine. Dans cette figure, TET2 est présenté comme un nouveau RBP et l’activité de liaison à l’ARN est cartographiée à une région C terminale en traçant le score RBR id le long de la séquence primaire de la protéine.

Enfin, l’exigence de ce nouveau RBR a pu être vérifiée en effectuant PAR-CLIP en utilisant la séquence de type sauvage et en comparant le signal à celui d’un mutant dépourvu du RBR prédit. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en sept à huit heures sur deux jours si elle est bien exécutée. Avant la réticulation, les cellules peuvent être stimulées par divers traitements afin de répondre à des questions supplémentaires telles que comment la différenciation commence-t-elle ou comment le cycle cellulaire régule-t-il les interactions ARN-protéine.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de générer des extras contenant des complexes d’ARN protéique réticulés pour identifier les sites d’interactions entre l’ARN protéique avec la spectrométrie de masse.