Analyse semi-automatique de souris Muscle squelettique morphologie et la Composition de la fibre de type

L’objectif global de ce protocole est d’utiliser une immunohistochimie de pointe pour identifier avec précision et rapidité les types de fibres musculaires squelettiques. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la biologie musculaire, par exemple si les changements de type de fibres sont précipités par la perte de protéines fonctionnelles. Bien que cette méthode puisse donner un aperçu de nombreux modèles de maladies musculaires, elle peut également être utilisée dans des systèmes tels que les modèles knock in et knock out pour révéler l’impact plus important d’une seule molécule sur la fonction musculaire de base.

Pour commencer, faites sécher à l’air libre des sections congelées de muscle de souris sur des lames chargées pendant environ une demi-heure. Une fois séché, tracez une bordure autour des sections de chaque lame à l’aide d’un stylo PAP barrière hydrophobe. Ensuite, pour bloquer la liaison des anticorps non spécifiques, chargez environ 250 microlitres de BSA à 5 % dans du PBS à l’intérieur des bordures dessinées et incubez les lames à température ambiante pendant une heure.

Pendant ce temps, préparez une dilution de un à 50 de l’anticorps primaire dans du PBS à 5 %. Préparez environ 250 microlitres par lame et stockez la dilution de l’anticorps sur de la glace. Après la période de blocage, aspirez la solution en bloc des lames et ajoutez 250 microlitres d’aliquotes de dilution de l’anticorps.

Pour un contrôle négatif, appliquer 5 % de BSA dans du PBS sans anticorps primaire. Ensuite, chargez la boîte de Pétri avec du papier filtre humide et couvrez-la d’une feuille d’aluminium pour une chambre d’incubation. Ensuite, incubez les lames à quatre degrés Celsius pendant 24 à 48 heures dans la chambre ou dans un environnement similaire avec la même humidité.

Après l’incubation de l’anticorps primaire, aspirez la solution des lames et lavez-les trois fois. Pour chaque lavage, appliquez environ 250 microlitres de BSA à 5 % dans du PBS pendant environ 10 minutes. Pendant le lavage des lames, préparez une à 200 dilutions des anticorps secondaires conjugués au fluorophore purifié

Préparez au moins 250 microlitres par lame et conservez la solution dans l’obscurité et sur de la glace. Après le troisième lavage, ajoutez 250 microlitres de dilution secondaire de l’anticorps sur les lames. Ensuite, incubez les lames pendant 90 minutes à température ambiante dans un environnement sombre et humide.

Après l’incubation, aspirez la solution d’anticorps et lavez les lames trois fois comme précédemment. Après avoir éliminé tout l’excès d’anticorps secondaires, rincez les lames avec du PBS et laissez-les sécher à l’air libre pendant 10 minutes. Enfin, montez les lames à l’aide d’un support de montage aqueux non permanent à faible viscosité.

Une fois le médium sec, scellez les bords de la lamelle avec du vernis à ongles et transférez les lames dans une boîte de rangement opaque. Avant d’imager une diapositive, nettoyez la lamelle avec de l’éthanol à 70 %. Obtenez ensuite des images numériques à l’aide d’un microscope à épifluorescence.

Sous un faible grossissement, sélectionnez une zone d’intérêt d’un millimètre carré. Pour afficher les anticorps conjugués à Alexa 488, utilisez un filtre passe-long de 505 nanomètres. Pour afficher les anticorps conjugués à Alexa 594, utilisez un filtre passe-long de 595 nanomètres.

Une fois les filtres correctement définis, commencez à collecter des images numériques. Assurez-vous d’inclure une barre d’échelle pour l’analyse ultérieure. Pour l’analyse, installez Fidji dans la macro fournie avec cette publication.

Stockez le fichier de macro dans un répertoire facile d’accès. Maintenant, chargez une image en fond clair d’une section sélectionnée et accédez à l’option de segmentation weka entraînable. Afin de stipuler les zones cellulaires de la section, tracez une ligne sur une fibre et cliquez sur ajouter à la première classe.

Ensuite, pour marquer les domaines extracellulaires, tracez une ligne sur l’espace entre les fibres et cliquez sur ajouter à la classe deux. Répétez ce processus jusqu’à ce que cinq à 10 étiquettes de chaque classe aient été définies. Il peut être difficile de marquer les limites interstitielles.

L’utilisation de la fonction zoom permet de marquer ces limites avec une plus grande précision. Ensuite, sélectionnez l’option Entraîner le classificateur. Sur la superposition rouge et verte résultante, ajoutez manuellement d’autres étiquettes à toutes les parties de l’image qui ont été mal segmentées par le processus automatisé.

Faites-le jusqu’à ce que les fibres marquées en rouge soient correctement séparées des espaces intermédiaires marqués en vert. Cliquez ensuite sur obtenir une probabilité et enregistrez l’image dans un nouveau dossier. Maintenant, répétez tout le processus en utilisant l’image fluorescente prise à partir du même champ.

Étiquetez les fibres immunomarquées comme classe un et toutes les régions non fluorescentes comme classe deux. En fin de compte, enregistrez la carte de probabilité résultante dans le même dossier que celui où l’image en fond clair traitée a été stockée. Maintenant, ouvrez l’une des cartes de probabilité précédemment enregistrées aux Fidji.

Tracez une ligne droite sur la barre d’échelle fournie par le logiciel d’imagerie. Sélectionnez Définir l’échelle et entrez les valeurs correctes en fonction de la barre d’échelle. Basculez ensuite l’option globale pour uniformiser l’échelle à chaque image.

Maintenant, exécutez la macro Tyagi pour la quantification de la fibre et le volet de navigation apparaîtra. Ouvrez ensuite le dossier host images. Dans la boîte de dialogue associée, définissez la valeur de la liste déroulante Arrière-plan sur Clair.

La fonction de réglage des mesures peut être utilisée pour définir les paramètres à mesurer. L’ASC et le diamètre des pieds sont les mesures les plus pertinentes pour quantifier la morphologie des fibres. Après avoir exécuté la macro, le dossier sera alors rempli d’images des contours de la fibre et de feuilles de calcul avec les mesures effectuées par la fonction d’analyse médiocre.

Les muscles tibial, antérieur et soléaire ont été analysés à l’aide des méthodes décrites car ils sont principalement composés de fibres à contraction rapide ou lente. Plusieurs chaînes lourdes de myosine différentes ont été identifiées à l’aide d’anticorps spécifiques. Une fraction substantielle des fibres du muscle soléaire exprimait des chaînes lourdes de myosine de type un et de type deux A et une bonne partie des fibres restantes étaient positives pour le type deux X.By revanche, pratiquement aucune fibre de type B n’était évidente.

En comparaison, les muscles antérieurs du tibial colorés étaient composés principalement de fibres de chaîne lourde de myosine de type 2 B et de type 2 X, avec des contributions plus faibles de fibres exprimant des chaînes de type deux A et pratiquement aucune fibre exprimée dans des chaînes de type 1. L’analyse morphométrique d’un muscle tibial antérieur sondé avec des anticorps SC-71 dirigés contre la chaîne lourde de myosine de type A a fourni plusieurs transformations d’images utilisées pour faire des cartes de probabilité. À partir de cette analyse automatisée facile, les données se sont avérées entièrement comparables aux données générées à l’aide de calculs manuels beaucoup plus fastidieux.

Au total, l’analyse produit les données d’environ 6 000 fibres individuelles au total. Le débit élevé de données a rendu l’analyse statistique beaucoup plus réalisable. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’immunocolorer des sections musculaires et d’utiliser le logiciel semi-automatisé fourni pour faciliter l’analyse du type et de la composition des fibres musculaires.

Lors de la tentative de cette procédure, il est important de se rappeler que les muscles peuvent être hétérogènes d’une région à l’autre et que l’analyse de nombreux champs musculaires est nécessaire pour une évaluation rigoureuse du type et de la composition des fibres musculaires. En combinaison avec cette procédure, d’autres méthodes telles que la coloration des trichomes peuvent être effectuées afin de répondre à des questions supplémentaires telles que si la fibrose se développe en parallèle avec des changements dans la composition du type de fibre.