Name: Analyse semi-automatique de souris Muscle squelettique morphologie et la Composition de la fibre de type (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-08-31T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 36 s
Description: Découvrez une méthode d'immunohistochimie semi-automatisée pour identifier rapidement les types de fibres musculaires squelettiques chez la souris. Cette approche accélère l'analyse morphologique et facilite l'étude des maladies musculaires.

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Nous sommes reconnaissants à la Fondation de Boettcher et l’Association de la sclérose latérale amyotrophique (#17-II-344) pour leur soutien à cette recherche.

toutes les procédures impliquant des souris ont été approuvés par l’Université du Colorado-Anschutz médicale Campus institutionnels et animalier Comité d’urbanisme (91813(05)1D).
 1. jour 1 : primaires (1°) immunomarquage avec blocage Bovine Serum Albumin (BSA) <ol><li>sechage coupes congelées de muscle du membre postérieur de la souris (par exemple, jambier antérieur, muscle soléaire) montés sur des diapositives chargées pour ~ 30 min 11. dessiner une bordure autour les sections à l’aide d’un stylo PAP barrière hydrophobe.</li>
	<li>Place ~ 250 µL de solution saline tamponnée au phosphate/BSA 5 % (BSA/PBS) sur chaque diapositive pour bloquer la liaison de l’anticorps non spécifiques. Incuber les lames à température ambiante pendant 1 h.</li>
	<li>Tout en bloquant, préparer à 01:50 les dilutions de l’anticorps 1 ° surnageant dans 5 % BSA/PBS (tous sont des anticorps monoclonaux de souris ; voir tableau 1 6 , 12) préparer 250 µL de solution par diapositive. Garder des stocks d’anticorps de 1° et des dilutions sur Ice.</li>
</ol> <img alt="Table 1" src="/files/ftp_upload/56024/56024table1.jpg" /> tableau 1 : anticorps primaires utilisés pour distinguer les chaînes lourdes de myosine.
<ol start="4"> <li>suite à l’aspiration de la solution de saturation 5 % BSA/PBS, ajouter 250 µL de dilution de 1° anticorps aux diapositives appropriés. Ajouter 250 µL de 5 % BSA/PBS au secondaire (2°) anticorps seule témoin négatif glisse.</li>
	<li>Incuber à 4 ° C pendant 24 à 48 heures dans une atmosphère humide. 
	Remarque : Une boîte de Pétri couvert de papier d’aluminium avec du papier filtre imbibé peut servir une chambre d’incubation approprié.</li>
</ol> 2. Jour 2:2 ° immunohistochimie avec des anticorps fluorescents <ol><li>aspirer la solution d’anticorps 1° ou 5 % BSA/PBS solution de contrôle. Lavez tout glisse trois fois, 10 min avec 5 % de BSA.</li>
	<li>Tout laver, préparer des dilutions de 1 : 200 des anticorps purifiés, conjugué à un fluorophore 2 ° 5 % BSA/PBS (voir tableau 2, tous sont chèvre anti-souris). Préparez 250 µL de solution par diapositive. Garder les anticorps conjugué à un fluorophore 2° dans l’obscurité sur la glace</li>
</ol> <img alt="Table 2" src="/files/ftp_upload/56024/56024table2.jpg" /> tableau 2 : anticorps secondaire conjugué à un Fluorophore utilisé pour visualiser les principaux anticorps reconnaissance de chaînes lourdes de myosine.
<ol start="3"> <li>suite à l’aspiration de la troisième demande de solution de saturation 5 % BSA/PBS, ajouter 250 µL de dilution d’anticorps de 2° à toutes les diapositives. Incuber pendant 90 min à température ambiante dans un environnement sombre et humide.</li>
	<li>Solution d’anticorps obtenus par aspiration 2°. Lavez tout glisse trois fois, 10 min avec 5 % BSA/PBS.</li>
	<li>Rinçage avec du PBS. Sécher pendant 10 min.</li>
	<li>Monter la lamelle avec un milieu de montage aqueux non permanents, de faible viscosité.</li>
	<li>Une fois sec, sceller les bords de la diapositive avec vernis à ongles. Sécher et mettre dans un sombre slidebox.</li>
</ol> 3. Imagerie des diapositives avec la microscopie à épifluorescence <ol><li>nettoyer les lames avec une petit, 70 % éthanol imbibé lab-lingette.</li>
	<li>Obtenir des images numériques des sections de muscle d’immunomarquage à l’aide d’un microscope à épifluorescence équipé d’un appareil photographique (voir la Table des matières).
	<ol><li>Sélectionnez une zone d’environ 1 mm 2 (objectif 10 X, NA 1,4).</li>
		Filtre <li>vue fluorescence anticorps conjugué Alexa 488 2° via une 505 nm long-pass. Découvre la fluorescence générée par l’excitation des anticorps conjugué Alexa 594 2° via un filtre de passe longue 595 nm. Numériser des images avec un ordinateur PC équipé d’un logiciel d’imagerie compatible. Inclure l’échelle graphique du logiciel pour une analyse ultérieure d’imagerie.</li>
	</ol></li></ol> 4. Analyse d’Images avec les îles Fidji Remarque : avant de procéder à l’analyse, les Fidji (disponible gratuitement sur le National Institutes of Health, Bethesda, MD) doit être installé par l’intermédiaire de https://imagej.net/Fiji/Downloads. En outre, la macro utilisée dans ce processus est fournie dans le Fichier supplémentaires. Placez le fichier de macro dans un répertoire facilement accessible.
Image de <ol><li>charge un fond clair d’une section sélectionnée dans les îles Fidji. Accédez au Plugins &#8594; Segmentation &#8594; Segmentation Weka Trainable.</li>
	<li>Afin de préciser les zones cellulaires de la section, tracez une ligne sur une fibre et cliquez sur &#34; ajouter à la classe 1 &#34;. Puis, tracez une ligne sur l’espace entre les fibres, puis cliquez sur &#34; ajouter à la classe 2 &#34; pour marquer les domaines extracellulaires. Répétez jusqu'à ce qu’il y a 5-10 étiquettes dans chaque classe.
	<ol><li>Cliquez sur Train classifieur. Sur la superposition rouge et verte qui en résulte, ajouter des étiquettes plus manuellement (Voir l’étape 4.2) aux pièces mal segmentées de l’image, si nécessaire. Répétez jusqu'à ce que les fibres (rouge) sont bien séparées de l’espace entre les fibres (vert).</li>
	</ol></li> <li>Cliquez &#34; probabilité d’obtenir &#34; et enregistrez l’image dans un dossier nouvellement étiqueté.</li>
	<li>Répéter la procédure ci-dessus (étapes 4.2 et 4.3) avec l’image fluorescente prise sur le même terrain. Immunomarquage fibres comme l’étiquette &#34; classe 1 &#34; et toutes les régions non fluorescent comme &#34; classe 2 &#34;. Enregistrer la carte de probabilité résultante dans le même dossier où l’image de fond clair transformés est stockée.</li>
	<li>Ouvrir une des cartes probabilité enregistré précédemment à Fidji. Dessiner une ligne droite sur la barre d’échelle fournie par le logiciel d’imagerie. Aller à analyser &#8594; définissez échelle. Modifier les paramètres (p. ex., distance connue, unité de longueur) à leurs valeurs appropriées telle que donnée par la barre d’échelle, puis vérifiez le &#34; Global &#34; boîte de normaliser l’échelle pour chaque image.</li>
	<li>Accédez à Plugins &#8594; Macros &#8594; Run &#8594; Tyagi et coll. fibre quantification macro.ijm (voir le Fichier supplémentaire). Immédiatement, un volet de navigation s’affiche. Ouvrez l’image &#39; dossier d’hôte s ; une boîte de dialogue apparaîtra. Pour chaque boîte de dialogue Modifier le &#34; fond &#34; valeur dropdown à &#34; lumière. &#34; Remarque : le dossier est maintenant rempli avec des images des contours fibre et fichiers logiciel tableur des résultats (CSA et Feret diamètre sont plus pertinents dans quantifier la morphologie des fibres ; paramètres mesurés peuvent être ajustées à analyser les mesures de la valeur). Données de morphologie de fibre générées par la fonction de pore-analyse des Fidji seront automatiquement transférées à fichiers logiciel tableur pour les deux images de champ fluo et lumineux.</li>
	<li>Calculer la fraction de fibres exprimant une chaîne donnée dans un champ en divisant le nombre de fibres fluorescentes dans le domaine par le nombre de fibres totales dans l’image correspondante du champ lumineux.</li>
</ol>

<ol><li>Engel, W. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+essentiality+of+histo-+and+cytochemical+studies+of+skeletal+muscle+in+the+investigation+of+neuromuscular+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Neurol%22%5BJournal%5D)">The essentiality of histo- and cytochemical studies of skeletal muscle in the investigation of neuromuscular disease.</a> Neurol. 12, 778-784 (1962).</li>
<li>Dobrowolny, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skeletal+muscle+is+a+primary+target+of+SOD1G93A-mediated+toxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metab%22%5BJournal%5D)">Skeletal muscle is a primary target of SOD1G93A-mediated toxicity.</a> Cell Metab. 8, 425-436 (2008).</li>
<li>Sultana, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Restricting+calcium+currents+is+required+for+correct+fiber+type+specification+in+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Restricting calcium currents is required for correct fiber type specification in skeletal muscle.</a> Development. 143 (9), 1547-1559 (2016).</li>
<li>Guth, L., Samaha, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Procedure+for+the+histochemical+demonstration+of+actomyosin+ATPase%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Procedure for the histochemical demonstration of actomyosin ATPase.</a> Exp Neurol. 28 (2), 365-367 (1970).</li>
<li>Bloemberg, D., Quadrilatero, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+determination+of+myosin+heavy+chain+expression+in+rat%2C+mouse%2C+and+human+skeletal+muscle+using+multicolor+immunofluorescence+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Rapid determination of myosin heavy chain expression in rat, mouse, and human skeletal muscle using multicolor immunofluorescence analysis.</a> PLoS One. 7 (4), (2012).</li>
<li>Lucas, C. A., Kang, L. H., Hoh, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monospecific+antibodies+against+the+three+mammalian+fast+limb+myosin+heavy+chains%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">Monospecific antibodies against the three mammalian fast limb myosin heavy chains.</a> Biochem Biophys Res Commun. 272 (1), 303-308 (2000).</li>
<li>Lee, C. S., et al. <a target="_blank" href="https://skeletalmusclejournal.biomedcentral.com/articles/10.1186/s13395-014-0027-1">Ca2+ permeation and/or binding to Cav1.1 fine-tunes skeletal muscle Ca2+ signaling to sustain muscle function.</a> Skelet Muscle. 5 (4), (2015).</li>
<li>Sawano, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+one-step+immunostaining+method+to+visualize+rodent+muscle+fiber+type+within+a+single+specimen%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A one-step immunostaining method to visualize rodent muscle fiber type within a single specimen.</a> PLoS One. 11 (11), (2016).</li>
<li>Meunier, B., Picard, B., Astruc, T., Labas, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+image+analysis+tool+for+the+classification+of+muscle+fibre+type+using+immunohistochemical+staining%5BTitle%5D)+AND+%22Histochem+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Development of image analysis tool for the classification of muscle fibre type using immunohistochemical staining.</a> Histochem Cell Biol. 134 (3), 307-317 (2010).</li>
<li>Kammoun, M., Casser-Malek, I., Meunier, B., Picard, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simplified+immunohistochemical+classification+of+skeletal+muscle+fibres+in+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Histochem%22%5BJournal%5D)">A simplified immunohistochemical classification of skeletal muscle fibres in mouse.</a> Eur J Histochem. 58 (2), 2254(2014).</li>
<li>Kumar, A., Accorsi, A., Rhee, Y., Girgenrath, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Do%27s+and+don%27ts+in+the+preparation+of+muscle+cryosections+for+histological+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Do's and don'ts in the preparation of muscle cryosections for histological analysis.</a> J Vis Exp. (99), (2015).</li>
<li>Schiaffino, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three+myosin+heavy+chain+isoforms+in+type+2+skeletal+muscle+fibres%5BTitle%5D)+AND+%22J+Muscle+Res+Cell+Motil%22%5BJournal%5D)">Three myosin heavy chain isoforms in type 2 skeletal muscle fibres.</a> J Muscle Res Cell Motil. 10 (197), (1989).</li>
<li>Augusto, V., Padovani, C. R., Campos, G. E. R. <a target="_blank" href="https://www.researchgate.net/publication/228866300_Skeletal_muscle_fiber_types_in_C57BL6J_mice">Skeletal muscle fiber types in C57Bl6j mice.</a> Braz J Morphol Sci. 21 (2), 89-94 (2004).</li>
<li>Schiaffino, S., Reggiani, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiber+types+in+mammalian+skeletal+muscles%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Fiber types in mammalian skeletal muscles.</a> Physiol Rev. 91 (4), 1447-1531 (2011).</li>
<li>Allen, D. L., Harrison, B. C., Maass, A., Bell, M. L., Byrnes, W. C., Leinwand, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+and+skeletal+muscle+adaptations+to+voluntary+wheel+running+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22J+Appl+Physiol%22%5BJournal%5D)">Cardiac and skeletal muscle adaptations to voluntary wheel running in the mouse.</a> J Appl Physiol. 90 (5), 1900-1908 (2001).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont aucun intérêt contradictoires de divulguer.

Ici, nous avons fourni une orientation utile pour l’identification des types de fibres musculaires squelettiques. Ce faisant, les auteurs décrivent un nouvel algorithme pour l’analyse des données.
Étant donné que dans une large mesure, nos résultats confirment ceux des précédents rapports5,8,10 et reflètent nos propres mesures manuelles, l’algorithme semble être précis. Pourtant, nous avons rencontré ...

On sait depuis longtemps que le muscle squelettique est composé de fibres isolées de nombreux types1. Au départ, deux groupes de fibres ont été caractérisées selon leurs propriétés contractiles et nommé, convenablement, contraction lente (type I) et rapides (type II). Ces catégories sont distinguent encore sur la base du métabolisme de la fibre. Depuis de type I fibres sont riches en mitochondries et tributaire de métabolisme oxydatif, ils ont été élucidées par robustement positive nicotinamide adénine dinucléotide-tétrazolium réductase (NADH-TR) diaphorase2 ou succinate déshydrogénase (SDH)3 la coloration. En revanche, les fibres de type II exposé moindre et des degrés variables de TR-NADH diaphorase ou SDH coloration et ont été divisés en deux sous-groupes de contraction rapide (types IIA et IIB) un peu grossièrement basée sur leur capacité oxydative relative. Ces distinctions entre les fibres ont été visualisées plus efficacement par la myosine-ATPase coloration où de type I fibres tachent sombres après une pré incubation à pH 4,0 et absorbent les fibres de type IIB précipitée après incubation préalable à pH 10,0 avec des fibres de type IIA la coloration moyennement4.
Plus récemment, la coloration immunohistochimique des isoformes de myosine lourde chaîne (chaîne) a émergé comme un discriminateur plus fin des fibres de type5. De type I, type IIA et les fibres de type IIB peuvent être tous identifiés avec précision selon leur profil de chaîne. En outre, un autre type de contraction rapide métaboliquement intermédiaire fibre, tapez IIX, a été identifié6. Les fibres hybrides exprimant plus d’une chaîne ont également été confirmés5,7,8. Certaines espèces comme le chat et le babouin n’est pas connues de myosine de Type IIB express6. Si la chaîne immunostaining est actuellement à l’évaluation de l’état-of-the-art de la composition du muscle, l’analyse des données obtenues par l’intermédiaire de cette technique est lourd et fastidieux sans aide automatisée. À cette fin, une poignée de méthodes semi-automatisé pour analyser ces données ont été développés5,9,10. Nous présentons ici un protocole relativement standard pour l’identification immunohistochimique des fibres musculaires de type5,7,8,10, avec un roman semi-automatisé algorithme qui accélère l’analyse de la morphologie de type fibre et fibre avec précision.

<table><tbody><tr><td>Albumine sérique bovine</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A9418-100G</td><td>5 % dans PBS</td></tr><tr><td>Barrière hydrophobe Pap Pen</td><td>Dispositif scientifique Laboratoire</td><td>9804-02</td><td></td></tr><tr><td>Lames de microscope</td><td>Globe Scientific</td><td>1358W</td><td></td></tr><tr><td>Coverglass</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-544-E</td><td></td></tr><tr><td>Immumount</td><td>Thermo Scientific</td><td>9990402</td><td></td></tr><tr><td>Vernis à ongles</td><td>L’Oréal</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nikon Eclipse TE-200 Microscope à fluorescence inversée et à fond clair</td><td>abandonné</td><td></td>SPOT RT/KE SPOT Solutions d’imagerie RT940 Dell Optiplex BA-F8 Études de développement d’anticorps primaires Banque d’hybridomes à l’Université de l’Iowa souris monoclonale IgG2b ;<td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> 1:50</td></tr><tr><td>SC-71 Études de développement d’anticorps primaires</td> Banque <td>d’hybridomes de souris monclonales IgG1 de l’Université de l’Iowa</td><td></td><td>; 1:50</td></tr><tr><td>BF-F3 Études de développement d’anticorps primaires</td><td>Banque d’hybridomes de souris monoclonales de l’Université de l’Iowa</td><td></td><td>IgGM ; 1</td></tr><tr><td></td><td></td>:50 6H1 Études de développement d’anticorps primaires <td>Banque d’hybridomes de souris monoclonales de l’Université de l’Iowa</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 anti-IgG2b</td><td>Invitrogen</td><td>A21145</td><td>chèvre anti-souris ; 1:200</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 anti-IgG1</td><td>Invitrogen</td><td>A21121</td><td>chèvre anti-souris ; 1:200</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 anti-IgGM</td><td>Invitrogen</td><td>A21044</td><td>chèvre anti-souris ; 1:200</td></tr><tr><td>OCT</td><td>Sakura Finetek</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>isopentane</td><td>Fisher Scientific</td><td>O3551-4</td><td>refroidir avec de l’azote liguid</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Fisher Bioreagents</td><td>BP665-1</td><td>10x, diluer à 1x</td></tr><tr><td>Kim wipes</td><td>Kimberly-Clark</td><td>06-666A</td><td></td></tr></tbody></table>

analyse semi-automatique de souris muscle squelettique morphologie et la composition de la fibre de type

Semi-automated Analysis of Mouse Skeletal Muscle Morphology and Fiber-type Composition

Pendant des années, distinctions entre les types de fibres musculaires squelettiques ont été mieux visualisées par la souillure de la myosine-ATPase. Plus récemment, la coloration immunohistochimique des isoformes de myosine lourde chaîne (chaîne) a émergé comme un discriminateur plus fin des fibres de type. De type I, type IIA, le type IIX et de fibres de type IIB peuvent être identifiés avec précision selon leur profil de chaîne ; Cependant, l’analyse manuelle de ces données peut être lent et bas-droite fastidieux. À cet égard, une évaluation rapide et précise de la composition de la fibre de type et de la morphologie est un outil très souhaitable. Nous présentons ici un protocole pour une coloration immunohistochimique de l’état-of-the-art de chaînes lourdes de myosine dans les coupes congelées provenant du muscle du membre postérieur souris en concert avec un nouvel algorithme semi-automatisé qui accélère l’analyse de la morphologie de type fibre et fibre. Comme prévu, le muscle soléaire affiche une coloration pour type I et type fibres IIA, mais pas pour les fibres de type IIX ou type IIB. En revanche, le muscle jambier antérieur était essentiellement composé de fibres IIB type IIX et le type, une petite fraction des fibres de type IIA et peu ou pas fibres de type I. Plusieurs transformations d’image ont été utilisées pour générer des cartes de probabilité dans le but de mesurer les différents aspects de la morphologie de la fibre (c.-à-d., section transversale (CSA), diamètre de Feret maximal et minimal). Les valeurs obtenues pour ces paramètres ont ensuite été comparées avec les valeurs obtenues manuellement. Pas de différences significatives ont été observées entre deux modes d’analyse en ce qui concerne les CSA, maximal ou minimal diamètre Feret (tous p &#62; 0,05), indiquant la précision de notre méthode. Ainsi, notre protocole d’analyse immuno-coloration peut être appliquée à l’étude des effets sur la composition de muscle dans de nombreux modèles de vieillissement et de la myopathie.

Muscles postérieurs (p. ex., jambier antérieur, muscle soléaire), disséqués de souris C57BL/6 mâles d’âge inconnu ont été flash congelés en fonçant un moule en plastique contenant le muscle en OCT composé dans l’isopentane refroidi à l’azote liquide. Puis, coupes sériées de 8-10 µm en utilisant un cryotome, ont été coupés à-20 ° C et transférés à différents verre chargé positivement diapositives12.
<p class="jove_content" fo:keep-together.within-page="...

Marquage immunohistochimique des isoformes de la chaîne lourde de myosine a émergé comme le discriminant de l’état-of-the-art des fibres musculaires squelettiques de type (c'est-à-direde type I, type IIA, tapez IIX, type IIB). Nous présentons ici un protocole de coloration avec un nouvel algorithme semi automatisé qui facilite l’évaluation rapide de la morphologie de type fibre et fibre.

Analyse semi-automatique de souris Muscle squelettique morphologie et la Composition de la fibre de type

For years, distinctions between skeletal muscle fiber types were best visualized by myosin-ATPase staining. More recently, immunohistochemical staining of ...

L'objectif général de ce protocole est d'utiliser l'immunohistochimie de pointe pour identifier avec précision et rapidité les types de fibres musculaires squelettiques. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la biologie musculaire, par exemple si les changements de type de fibre sont provoqués par la perte de protéines fonctionnelles. Bien que cette méthode puisse fournir des informations sur de nombreux modèles de maladies musculaires, elle peut également être utilisée dans des systèmes tels que les modèles d'insertion génique (knock in) et de délétion génique (knock out) afin de révéler l'impact plus large d'une seule molécule sur la fonction musculaire de base.Pour commencer, séchez à l'air des coupes congelées de muscle de souris sur des lames chargées pendant environ une demi-heure. Une fois sèches, tracez une bordure autour des sections sur chaque lame à l'aide d'un stylo PAP hydrophobe. Ensuite, afin de bloquer la liaison non spécifique des anticorps, ajoutez environ 250 microlitres de BSA à 5 % dans du PBS à l'intérieur des bordures tracées et incubez les lames à température ambiante pendant une heure.Entre-temps, préparez une dilution du facteur primaire comprise entre un et cinquante dans du PBS contenant 5 % de BSA. Préparez environ 250 microlitres par lame et conservez la dilution d'anticorps sur glace. Après la période de blocage, aspirez la solution de blocage des lames et ajoutez des aliquotes de 250 microlitres de la dilution d'anticorps.Pour un témoin négatif, appliquer 5 % de BSA dans du PBS sans anticorps primaire. Ensuite, placer une coupelle de Pétri avec du papier filtre humidifié et la recouvrir de papier d'aluminium pour créer une chambre d'incubation. Puis incuber les lames à quatre degrés Celsius pendant 24 à 48 heures dans cette chambre ou dans un environnement similaire ayant la même humidité.Après l'incubation avec l'anticorps primaire, aspirez la solution des lames et lavez les lames trois fois. Pour chaque lavage, appliquez environ 250 microlitres de BSA à 5 % dans du PBS pendant environ 10 minutes. Pendant le lavage des lames, préparez des dilutions de un à 200 des anticorps secondaires purifiés conjugués à un fluorophore.Préparez au moins 250 microlitres par lame et conservez la solution à l’obscurité et sur de la glace. Après le troisième lavage, ajoutez 250 microlitres de la dilution d’anticorps secondaire sur les lames. Incubez ensuite les lames pendant 90 minutes à température ambiante dans un environnement humide et à l’abri de la lumière.Après l'incubation, aspirez la solution d'anticorps et lavez les lames trois fois comme précédemment. Après avoir éliminé tout l'excès d'anticorps secondaire, rincez les lames avec du PBS et laissez-les sécher à l'air pendant 10 minutes. Enfin, montez les lames en utilisant un milieu de montage aqueux à faible viscosité non permanent.Une fois que le milieu est sec, scellez les bords de la lame avec du vernis à ongles et transférez les lames dans une boîte de stockage opaque. Avant d'acquérir une image, nettoyez la lame avec de l'éthanol à 70 %. Ensuite, obtenez des images numériques à l'aide d'un microscope à épifluorescence.Avec un faible grossissement, sélectionnez une zone d'intérêt d'un millimètre carré. Pour visualiser les anticorps conjugués à l’Alexa 488, utilisez un filtre passe-long de 505 nanomètres. Pour visualiser les anticorps conjugués à l’Alexa 594, utilisez un filtre passe-long de 595 nanomètres.Avec les filtres correctement réglés, commencez à acquérir des images numériques. Veillez à inclure une barre d'échelle pour l'analyse ultérieure. Pour l'analyse, installez Fiji avec le macro fourni avec cette publication.Enregistrez le fichier macro dans un répertoire facilement accessible. Chargez maintenant une image en champ clair d'une section sélectionnée et accédez à l'option de segmentation entraînable par Weka. Afin de définir les zones cellulaires de la section, tracez une ligne sur une fibre et cliquez sur ajouter à la classe un.Ensuite, pour marquer les domaines extracellulaires, tracez une ligne dans l'espace entre les fibres et cliquez sur ajouter à la classe deux. Répétez ce processus jusqu'à ce que cinq à dix étiquettes de chaque classe aient été définies. Il peut être difficile de marquer les limites interstitielles.L'utilisation de la fonction de zoom permet de marquer ces limites avec une plus grande précision. Ensuite, sélectionnez l'option d'entraînement du classificateur. Sur la superposition rouge et verte résultante, ajoutez manuellement davantage d'étiquettes aux parties de l'image qui ont été segmentées incorrectement par le processus automatisé.Faites cela jusqu'à ce que les fibres marquées en rouge soient correctement séparées des espaces intermédiaires marqués en vert. Ensuite, cliquez sur « obtenir la probabilité » et enregistrez l'image dans un nouveau dossier. Répétez maintenant l'ensemble du processus en utilisant l'image fluorescente prise du même champ.Étiquetez les fibres immunomarquées comme classe un et toutes les régions non fluorescentes comme classe deux. Enfin, enregistrez la carte de probabilité obtenue dans le même dossier où l'image en champ clair traitée a été stockée. Ouvrez maintenant l'une des cartes de probabilité précédemment enregistrées dans Fiji.Tracez une ligne droite sur la barre d'échelle fournie par le logiciel d'imagerie. Sélectionnez l'option définir l'échelle et saisissez les valeurs correctes en fonction de la barre d'échelle. Ensuite, activez l'option globale pour standardiser l'échelle sur chaque image.Exécutez maintenant la macro Tyagi pour la quantification des fibres et le volet de navigation apparaîtra. Ouvrez ensuite le dossier hôte contenant les images. Dans la boîte de dialogue associée, modifiez la valeur du menu déroulant d'arrière-plan en « clair ».La fonction de mesures prédéfinies peut être utilisée pour définir quels paramètres doivent être mesurés. La surface transversale (CSA) et le diamètre des fibres sont les mesures les plus pertinentes pour quantifier la morphologie des fibres. Après l'exécution de la macro, le dossier sera alors rempli d'images des contours des fibres et de feuilles de calcul contenant les mesures effectuées par la fonction d'analyse.Les muscles tibial antérieur et soléaire ont été analysés à l'aide des méthodes décrites car ils sont principalement composés de fibres de type rapide ou de type lent. Plusieurs chaînes lourdes de myosine différentes ont été identifiées à l'aide d'anticorps spécifiques. Une fraction importante des fibres musculaires du soléaire exprimait les chaînes lourdes de myosine de type I et de type IIa, et une proportion non négligeable des fibres restantes était positive pour le type IIx. En revanche, pratiquement aucune fibre de type IIb n'était visible.Par comparaison, les muscles tibialis antérieurs colorés étaient composés principalement de fibres à chaîne lourde de myosine de type deux B et de type deux X, avec une moindre contribution des fibres exprimant des chaînes de type deux A, et pratiquement aucune fibre n'exprimait de chaînes de type un. Une analyse morphométrique d'un muscle tibialis anterior marqué par des anticorps SC-71 dirigés contre la chaîne lourde de myosine de type deux A a fourni plusieurs transformations d'image utilisées pour établir des cartes de probabilité. Grâce à cette analyse automatisée simple, les données se sont révélées entièrement comparables à celles obtenues par des calculs manuels beaucoup plus laborieux.Dans l'ensemble, l'analyse fournit des données provenant d'environ 6 000 fibres individuelles au total. Le haut débit de données a rendu l'analyse statistique nettement plus réalisable. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière de réaliser une immunomarquage de sections musculaires et d'utiliser le logiciel semi-automatisé fourni pour faciliter l'analyse du type et de la composition des fibres musculaires.Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de garder à l'esprit que le muscle peut présenter une hétérogénéité régionale et qu'une analyse de nombreux champs musculaires est nécessaire pour une évaluation rigoureuse du type et de la composition des fibres musculaires. En complément de cette procédure, d'autres méthodes, comme la coloration trichrome, peuvent être réalisées afin de répondre à des questions supplémentaires, telles que savoir si un fibrose se développe parallèlement aux modifications de la composition en types de fibres.

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