Name: Évaluation des propriétés anticoagulantes et anti-inflammatoires de cellules endothéliales à l’aide de la Culture cellulaire 3D et sang total Non-anticoagulant (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-09-05T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 8 s
Description: Découvrez une méthode d'évaluation des propriétés anticoagulantes des cellules endothéliales utilisant du sang total non anticoagulé. Ce modèle in vitro permet d'étudier la coagulation et l'activation endothéliale en recherche cardiovasculaire.

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Cette étude a été financée par la Swiss National Science Foundation (FNS, Grant No. 320030_156193). Les auteurs remercient Dr Benoît Werlen pour fournir les perles avec des microporteurs de Biosilon. Nous remercions également le Prof. Hans Peter Kohler et Prof. André Haeberli d’aide à la mise en place du modèle de perle avec des microporteurs.

allemand Landrace porcs (type sauvage élevé dans une ferme locale et transgénique élevés à l’Institut de race d’animaux moléculaire et biotechnologie, Université Ludwig-Maximilian, Munich, Allemagne), pesant entre 30 kg à 40 kg, ont été utilisés dans Cette étude. Tous les animaux étaient logés dans des conditions normales, avec eau et nourriture ad lib. Toutes les expériences animales ont été effectuées conformément à la Loi sur les animaux au Royaume-Uni (procédures scientifiques) et le Guide de NIH pour les soins et Use of Laboratory Animals, ainsi que la Loi de la protection Suisse des animaux. Toutes les études sur l’animal respecte les directives d’arrivée. Le Comité de l’expérimentation animale du service vétérinaire cantonal (Canton de Berne, Suisse) a approuvé toutes les procédures d’animaux, l’autorisation ne. BE70/14. Protocoles expérimentaux ont été affinés selon les principes 3R et état-of-the-art anesthésie et gestion de la douleur ont été utilisées pour réduire au minimum le nombre d’animaux et de réduire l’exposition des animaux au stress et douleur au cours des expériences.
 sang provient des individus sains par ponction veineuse système fermé conformément aux directives suisses de compétence et d’éthique de l’hôpital universitaire de Berne. L’expression &#34; sang anticoagulé non &#34; signifie que le sang n’a pas été traité avec un anticoagulant.
 les étapes suivantes sont effectuées dans des conditions stériles. Familiarité avec la technique stérile de culture de cellule de base est nécessaire.
 1. isolement du PAEC Remarque : segments de l’aorte thoracique de 6 à 10 cm ont été extraites des euthanasiés allemand Landrace porcs de 3 à 6 mois d’âge (utilisé pour d’autres expériences in vivo) et immédiatement transféré dans une bouteille en verre de 500 mL contenant un milieu de transport (DMEM + 1 % pénicilline/streptomycine).
<ol><li>Préalablement recouvrir une plaque 6 puits fibronectine 12,5 µg/ml dans du PBS 1 x et le placer dans un incubateur à 37 ° C pendant 1 h.</li>
	<li>Préchauffer PBS stérile 1 x et cell culture moyen (DMEM).</li>
	<li>Sortir de l’aorte de porc de milieu de transport.</li>
	<li>Placer l’aorte sur une plaque de polystyrène.</li>
	<li>Rincer doucement au préalable de PBS chaud.</li>
	<li>Couper l’aorte longitudinalement et fixez-le avec des aiguilles.</li>
	<li>Ajouter un milieu de culture cellulaire chaud sur la surface intérieure de navire.</li>
	<li>Aspirer de milieu de culture cellulaire de la fibronectine et ajouter le milieu de culture de cellules fraîches (DMEM additionné de 10 % FBS, 1 % pénicilline/streptomycine et 0,4 % de cellules endothéliales croissance moyenne supplément Mix).</li>
	<li>Faire tremper un coton-tige dans le milieu de culture cellulaire. Tamponner le bourgeon d’ouate sur le sommet de la surface intérieure de navire doucement et lentement dans la même direction.</li>
	<li>Frotter les cellules dans un puits de 6 puits plaque ronde par ronde.</li>
	<li>Faire la même chose pour le reste des puits.</li>
	<li>Vérifier les cellules au microscope et placer la plaque de 6 puits dans un incubateur à 37 ° C, 5 % de CO 2.</li>
	<li>Changer le milieu de la deuxième journée et modifiez-le à nouveau tous les 2-3 jours.</li>
	<li>Lorsque les cellules vont être confluentes, trypsinize des cellules et leur semence dans une fiole de T75 (PAEC P1).</li>
</ol> 2. PAEC caractérisation <ol><li>manteau avant une chamberslide de 8 puits avec la fibronectine 12,5 µg/mL dans du PBS 1 x et le placer dans un incubateur à 37 ° C pendant 1 h.</li>
	<li>Graines de 5 x 10 4 cellules/puits et incuber pendant la nuit dans l’incubateur à 37 ° C.</li>
	<li>Laver les cellules deux fois avec du PBS ++ (PBS additionné de CaCl 2 et MgCl 2), 300 μL/puits.</li>
	<li>Fixer les cellules avec du paraformaldéhyde de 3,7 % pendant 10 min à température ambiante, 200 μL/puits.</li>
	<li>Laver les cellules 3 fois avec du PBS ++, 300 μL/puits.</li>
	<li>Ajouter 300 μl de PBS 1 x-3_% BSA (tampon de blocage) et laisser 30 min à température ambiante.</li>
	<li>Appliquer les anticorps primaires (anti-VE-cadhérine, anti-CD31, anti-vWF) dilués dans un détergent 1x-1%BSA-0.05% PBS, 160 μL/puits et incuber pendant 1 heure à température ambiante.</li>
	<li>Laver 3 fois avec du PBS ++ (200 μL/puits).</li>
	<li>Appliquer les anticorps secondaires et DAPI dilué dans un détergent 1x-1%BSA-0.05% PBS, 160 μL/puits et incuber pendant 1 heure à température ambiante.</li>
	<li>Laver 3 fois avec du PBS ++ (200 μL/puits).</li>
	<li>Monter les lames avec du milieu de montage de la base de glycérine et vérifier l’expression de marqueurs de cellules endothéliales sous un microscope à fluorescence. 
	NOTE : Les cellules endothéliales aortiques porcines Culture dans une fiole de T175 (milieu de faible concentration de glucose DMEM + 10 % FBS, 1 % pénicilline/streptomycine et 0,4 % de cellules endothéliales croissance moyenne supplément Mix) jusqu’au confluent de 90 % est atteint. (ensemencement des cellules de 6 densité 1 x 10, 90 % confluence correspondent approximativement à 5 x 10 6 cellules).</li>
</ol> 3. Revêtement de perles avec des microporteurs <ol><li>7 mL de perles avec des microporteurs se mêlent 42 mL de solution de collagène dans un tube de 50 mL (100 μg/mL, dilué dans une solution d’acide acétique 0,2 %) et incuber pendant 1 heure à température ambiante.</li>
	<li>Laver les perles deux fois avec 25 mL de PBS pH 7,4 (ajouter 25 mL de PBS, mélangez bien avec la pipette et attendre jusqu'à ce que les perles sont installés puis jeter le surnageant et répétition) et une fois avec 25 mL de milieu DMEM.</li>
	<li>Couvrir les perles dans le tube de 50 mL avec 10mL de milieu 199 additionné de 10 % de BF, 1 % pénicilline/streptomycine, 1 % L-Glutamine, 0,4 % de cellules endothéliales croissance moyenne supplément Mix et 25 μL d’héparine (5000 UI/mL) et permettre l’équilibration pendant 10 min avant d’utiliser.</li>
</ol> 4. Prélèvement de cellules <ol><li>enlever le milieu de culture cellulaire du T175 flacon contenant PAEC et ajouter 5 mL de tampon au phosphate pH 7.4.</li>
	<li>PBS de retirer du flacon T175.</li>
	<li>Ajouter 5 mL d’EDTA Trypsin-0.05% et incuber pendant 3-4 min à 37 ° C.</li>
	<li>Recueillir les cellules en rinçant le ballon avec 15 mL de milieu de culture cellulaire et transférer la suspension dans un tube de 50 mL.</li>
	<li>Centrifuger des cellules à 1 200 g pendant 8 min à température ambiante, enlever l’excès du milieu et Resuspendre le culot dans 5 mL de milieu de culture cellulaire.</li>
</ol> 5. Ensemencement des cellules dans la fiole d’agitateur <ol><li>Ajouter 20 mL de milieu de culture cellulaire à la suspension cellulaire et resuspendre.</li>
	<li>Ajouter 20 mL milieu de culture cellulaire (w/o de cellules) dans la fiole de 500 mL agitateur magnétique.</li>
	<li>Ajouter les cellules aux talons avec des microporteurs lavé à l’étape 3.3 et mélanger soigneusement avec une pipette sérologique de 25 mL.</li>
	<li>Transvider le mélange de perles/cell dans la fiole de toupie magnétique.</li>
	<li>Rincer le tube de 50 mL avec 10 mL de milieu de culture cellulaire pour recueillir les cellules restantes.</li>
	<li>Ajouter une autre 85 mL de milieu de culture cellulaire dans le ballon de la fileuse et placez-le dans l’incubateur pendant une nuit à 37 ° C dans un agitateur (100 x g, intervalle de mélange : 3 min toutes les 45 min).</li>
	<li>Ajouter 50 mL de milieu de culture cellulaire (volume total 200 mL) et continuer à remuer pendant 24h supplémentaire à 37 ° C dans un agitateur (100 x g, intervalle de mélange : 3 min toutes les 45 min).</li>
	<li>Ajouter le milieu RPMI incolore (additionné de 10 % FBS, pénicilline/streptomycine 1 % 1 % L-Glutamine, 0,4 % de cellules endothéliales croissance moyenne supplément Mix et 25 μL d’héparine) jusqu'à atteindre 320 mL de volume total.</li>
	<li>Remplacer le milieu de chaque mL de 48 h: 100 supprimer de vieux milieu et ajouter 100 mL de frais RPMI incolore supplémenté.</li>
	<li>Culture des cellules pendant 5 à 7 jours. Le temps dépend de l’état de la confluence des perles revêtement cellulaire.</li>
</ol> < classe p = « jove_title "&gt; 6. Vérification de la confluence <ol><li>200 μL de perles enduit de cellule à l’aide d’une pipette de recueillir et de les transférer dans un tube en polypropylène.</li>
	<li>Laver les perles 3 fois avec 600 μl de PBS 1 x (Ajouter PBS, incliner le tube et mélanger doucement pour éviter le détachement des cellules, les perles d’attente pour s’installer, jetez le PBS et répétez).</li>
	<li>Difficulté les perles pendant 10 min en ajoutant 200 μL d’acide parapicric.</li>
	<li>Laver 3 fois avec 600 μl de PBS 1 x.</li>
	<li>Ajouter DAPI dilué dans du PBS 1 x et incuber pendant 10 min.</li>
	<li>Transférer les perles sur une lame de verre et appliquer un lamelle couvre-objet à l’aide du milieu de montage glycérol basé.</li>
	<li>Visualiser les perles sous un microscope confocal.</li>
</ol> 7. Procédure expérimentale <ol><li>enlever les perles revêtement cellulaire de la fiole de l’agitateur magnétique (procédures n’ont pas à être fait dans des conditions stériles) avec une pipette sérologique de 10 mL et de les transférer dans des tubes en polypropylène à fond rond 12 mL.</li>
	<li>Laissez les billes s’installer (environ 1-2 min) et enlever l’excès du milieu.</li>
	<li>Ajouter des perles plus aux tubes jusqu'à ce que chaque tube contient exactement 2 mL de perles.</li>
	<li>Ajouter RPMI clair 5 mL dans chaque tube et mélanger délicatement à l’aide d’une pipette sérologique de 10 mL.</li>
	<li>Laissez les billes s’installer et enlever l’excès du milieu.</li>
	<li>Répéter la procédure de lavage une fois de plus avec RPMI et enlever tout excès du milieu.</li>
</ol> 8. L’incubation avec sang anticoagulé-Non <ol><li>prudemment et lentement (à l’aide de jet ni Vacutainer) prélever du sang d’un volontaire sain et ramasser dans les tubes en polypropylène neutre 9 mL (sans anticoagulant).</li>
	<li>Transvaser lentement 8 mL de sang avec une pipette sérologique de 10 mL dans chacun des tubes en polypropylène contenant 2 mL de cellule-enduit perles (le volume total sera de 10 mL). Toujours éviter une manipulation brutale du sang ou des perles pour éviter l’activation prématurée de EC. La procédure prend 1-2 min.</li>
	<li>Incliner délicatement le mélange de sang/perle pour assurer un mélange égal et sceller le bouchon avec le film de paraffine.</li>
	<li>Placer les tubes sur une table horizontale inclinable (avec réglages inclinaison douces seulement) à l’intérieur d’un incubateur de 37 ° C et le record de temps de coagulation.
	<ol><li>à des intervalles de temps définie, par exemple après 10, 20, 30, 50, 70, 90 min, retirez au moins 1,5 à 2 mL de mélange de sang-perle pour l’analyse de sérum ou de plasma. 
		NOTE : pour 6 points dans le temps nous vous suggérons ayant plus de 3 répétitions au sein d’un groupe de cellules, comme le prélèvement de sang se fera dans différents tubes.</li>
		<li>Pour la collecte de sérum, laisser le sang à coaguler. Pour collecter le plasma, ajoutez EDTA ou citrate de tubes de 2 mL avant d’ajouter des échantillons de sang.</li>
		<li>Stocker les tubes sur la glace, centrifuger à 2 500 g pendant 10 min à 4 ° C et conserver le sérum/plasma à 80 ° C jusqu'à l’utilisation. 
		NOTE : On trouvera des précisions sur les matériaux dans la Table des matières</li></ol></li></ol>

<ol><li>Rajendran, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+vascular+endothelium+and+human+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Biol.+Sci%22%5BJournal%5D)">The vascular endothelium and human diseases.</a> Int. J. Biol. Sci. 9, 1057-1069 (2013).</li>
<li>Rajwal, S., Richards, M., O'Meara, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+recalcified+citrated+whole+blood+-+a+pragmatic+approach+for+thromboelastography+in+children%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatric+Anesthesia%22%5BJournal%5D)">The use of recalcified citrated whole blood - a pragmatic approach for thromboelastography in children.</a> Pediatric Anesthesia. 14, 656-660 (2004).</li>
<li>Kohler, H. P., Muller, M., Mombeli, M., Mtraub, M. M., Maeberli, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Suppression+of+the+Coagulation+of+Nonanticoagulated+Whole-Blood+in-Vitro+by+Human+Umbilical+Endothelial-Cells+Cultivated+on+Microcarriers+Is+Not+Dependent+on+Protein-C+Activation%5BTitle%5D)+AND+%22Thromb.+Haemost%22%5BJournal%5D)">The Suppression of the Coagulation of Nonanticoagulated Whole-Blood in-Vitro by Human Umbilical Endothelial-Cells Cultivated on Microcarriers Is Not Dependent on Protein-C Activation.</a> Thromb. Haemost. 73, 719-724 (1995).</li>
<li>Biedermann, B., Rosenmund, A., Muller, M., Kohler, H. P., Haeberli, A., Straub, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+endothelial+cells+suppress+prothrombin+activation+in+nonanticoagulated+whole+blood+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Lab.+Clin.+Med%22%5BJournal%5D)">Human endothelial cells suppress prothrombin activation in nonanticoagulated whole blood in vitro.</a> J. Lab. Clin. Med. 124, 339-347 (1994).</li>
<li>Banz, Y., Cung, T., Korchagina, E. Y., Bovin, N. V., Haeberli, A., Rieben, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+cell+protection+and+complement+inhibition+in+xenotransplantation%3A+a+novel+in+vitro+model+using+whole+blood%5BTitle%5D)+AND+%22Xenotransplantation%22%5BJournal%5D)">Endothelial cell protection and complement inhibition in xenotransplantation: a novel in vitro model using whole blood.</a> Xenotransplantation. 12, 434-443 (2005).</li>
<li>Cowan, P. J., d'Apice, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complement+activation+and+coagulation+in+xenotransplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology+and+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Complement activation and coagulation in xenotransplantation.</a> Immunology and Cell Biology. 87, 203-208 (2009).</li>
<li>Reitsma, S., Slaaf, D. W., Vink, H., van Zandvoort, M. A. M. J., oude Egbrink, M. G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+endothelial+glycocalyx%3A+composition%2C+functions%2C+and+visualization%5BTitle%5D)+AND+%22Pflugers+Arch%22%5BJournal%5D)">The endothelial glycocalyx: composition, functions, and visualization.</a> Pflugers Arch. 454, 345-359 (2007).</li>
<li>Wiegner, R., Chakraborty, S., Huber-Lang, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complement-coagulation+crosstalk+on+cellular+and+artificial+surfaces%5BTitle%5D)+AND+%22Immunobiology%22%5BJournal%5D)">Complement-coagulation crosstalk on cellular and artificial surfaces.</a> Immunobiology. 221, 1073-1079 (2016).</li>
<li>Bongoni, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenic+Expression+of+Human+CD46+on+Porcine+Endothelium%3A+Effect+on+Coagulation+and+Fibrinolytic+Cascades+During+Ex+Vivo+Human-to-Pig+Limb+Xenoperfusions%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Transgenic Expression of Human CD46 on Porcine Endothelium: Effect on Coagulation and Fibrinolytic Cascades During Ex Vivo Human-to-Pig Limb Xenoperfusions.</a> Transplantation. 99, 2061-2069 (2015).</li>
<li>Miyazaki, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+shear+stress+can+initiate+both+platelet+aggregation+and+shedding+of+procoagulant+containing+microparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">High shear stress can initiate both platelet aggregation and shedding of procoagulant containing microparticles.</a> Blood. 88, 3456-3464 (1996).</li>
<li>Wuensch, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulatory+Sequences+of+the+Porcine+THBD+Gene+Facilitate+Endothelial-Specific+Expression+of+Bioactive+Human+Thrombomodulin+in+Single-and+Multitransgenic+Pigs%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Regulatory Sequences of the Porcine THBD Gene Facilitate Endothelial-Specific Expression of Bioactive Human Thrombomodulin in Single-and Multitransgenic Pigs.</a> Transplantation. 97, 138-147 (2014).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Le modèle présenté ici est adapté pour la coagulation des études permettant l’analyse des différents aspects de la coagulation et de son interaction avec EC. 8 dans la recherche de la xénotransplantation, c’est un système utile pour tester les propriétés anticoagulantes de différents ECs porcins génétiquement modifiés après incubation avec le sang humain 9.
Les étapes plus critiques du protocole sont celles assurant la couverture cellulaire compl...

L’endothélium vasculaire est constitué d’une monocouche de cellules endothéliales (EC) qui bordent la lumière des vaisseaux sanguins. Dans un état physiologique, ce repos sont chargés de l’entretien d’un environnement anti-inflammatoire et un anticoagulant. 1 c’est médiée par l’expression d’anticoagulant et protéines anti-inflammatoires sur la surface de l’EC. Par exemple, activation de EC causée par l’ischémie/reperfusion blessures ou rejet vasculaire de (xeno-) transplantés entraîne une modification de la surface endothéliale d’un anticoagulant et anti-inflammatoires état pro-inflammatoire et Pro-coagulant organes État. 1
Pour étudier l’interaction fascinante et complexe entre les facteurs de l’endothélium et la coagulation, modèles in vitro qui imitent tant que possible la situation in vivo sont fortement souhaitables. Une limitation courante qui caractérise conventionnelles in vitro tests de coagulation est l’utilisation de sang non coagulé qui rend l’analyse des effets médiés par coagulation ardu et ne peut pas reproduire les même recalcification du sang citraté résultats obtenus avec du sang frais non-anticoagulé. 2 en outre, dans les systèmes de cultures cellulaires de plat traditionnel il est impossible d’exploiter les propriétés anticoagulantes de l’endothélium, comme une surface suffisante de cellules endothéliales par volume sanguin n’est pas joignable. Le modèle présenté ici permet de surmonter ces limitations en cultivant EC sur la surface des perles avec des microporteurs sphérique, alors qu’un ratio de surface-to-sang d’EC de &#62; 16 cm2/ml peut être atteint, ce qui est similaire à la situation dans les petites artérioles ou veines, et suffisantes permettre à l’anticoagulation « naturelle » du sang, qui a été décrit par la surface de l’EC. 3 , 4 sang entier peut être utilisé sans anticoagulants ajoutés dans ce paramètre. Des échantillons de sang peuvent être collectées au cours de l’expérience et des cytokines, des facteurs de coagulation et marqueurs d’activation complément soluble peuvent être détectés et quantifiées. En outre, EC-enduit avec des microporteurs perles peuvent être analysées pour les dépôts d’immunoglobulines et de complément ainsi que l’expression des marqueurs d’activation EC par microscopie confocale. Une autre application intéressante comprend les essais de médicaments qui sont censés pour prévenir la coagulation et, par conséquent, activation des cellules endothéliales. 5 bien que ce modèle ne peut totalement remplacer l’expérimentation animale, elle offre une méthode pour tester les hypothèses fonctionnelles spécifiques ex vivo à l’aide de cellules et ainsi réduire le nombre d’animaux utilisés en recherche fondamentale sur l’ischémie/reperfusion transplantation des blessures ou (xeno).
Le modèle décrit a été utilisé pour imiter la xénotransplantation dans quelles cellules endothéliales aortiques porcines (PAEC) sont cultivées sur les perles avec des microporteurs et incubées en présence de sang entier, non anticoagulé. Différente PAEC transgénique, transportant plusieurs gènes humains tels que CD46 pour la régulation du système du complément et/ou thrombomoduline (hTBM) pour la régulation du système de la coagulation, ont été analysées pour leurs propriétés anticoagulantes. Systèmes d’activation, complément et coagulation de cellules endothéliales sont étroitement contrôlées et reliés entre eux. 6 il est donc important de comprendre comment les différentes cellules transgéniques se comportent après une exposition au sang humain, en ce qui concerne l’expression de molécule adhérence et cytokines, effusion du glycocalyx et une perte de protéines anticoagulantes. 7

<table><tbody><tr><td>PAEC</td><td></td><td></td><td>Isolé de l’aorte de porc dans notre laboratoire</td></tr><tr><td>Microcarrier beads (Biosilon)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>160-250</td><td></td></tr><tr><td>Collagen I, Bovin</td><td>Gibco</td><td>A10644-01</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>21885-025</td><td></td></tr><tr><td>Medium 199</td><td>Sigma</td><td>M7528</td><td></td></tr><tr><td>RPMI</td><td>Gibco</td><td>32404-014</td><td></td></tr><tr><td>Tubes neutres</td><td>Sarstedt</td><td>02.1726.001</td><td></td></tr><tr><td>Tubes en polypropylène</td><td>Simport</td><td>T406-2A</td><td></td></tr><tr><td>Flacons d’agitation</td><td>Tecnomara</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agitateur biologique</td><td>Brouwer</td><td>MCS-104S</td><td></td></tr><tr><td>Rat anti CD31</td><td>R& D Systems</td><td>MAB33871</td><td>Dilution 1:100</td></tr><tr><td>Chèvre anti-rat IgG-Cy3</td><td>Jackson Immuno Research</td><td>112-166-003</td><td>Dilution 1:500</td></tr><tr><td>Chèvre anti VE-cadhérine</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-6458</td><td>Dilution 1:100</td></tr><tr><td>Lapin anti vWF</td><td>DAKO</td><td>A0082</td><td>Dilution 1:100</td></tr><tr><td>Dk anti Gt IgG &ndash ; Sondes moléculaires Alexa 488</td><td></td><td>A11055</td><td>Dilution 1:500</td></tr><tr><td>Chèvre anti Lapin - FITC</td><td>Southern Biotech</td><td>4050-02</td><td>Dilution 1:500</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma</td><td>32670-25MG-F</td><td>Dilution 1 &micro ; g/mL</td></tr><tr><td>0,05 % Trypsine-EDTA</td><td>Gibco</td><td>25300-054</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Gibco</td><td>10270-106</td><td>Concentration : 10 % dans un milieu de culture cellulaire</td></tr><tr><td>Adaptateur</td><td>Sarstedt</td><td>14.1205</td><td></td></tr><tr><td>Microscope confocal</td><td>Carl Zeiss</td><td>LSM 710</td><td></td></tr><tr><td>Logiciel d’analyse d’images</td><td>Image J</td><td></td><td>Disponible gratuitement sur : https://imagej.net</td></tr><tr><td>Supplément de milieu de croissance cellulaire endothélialeMix</td><td>PromoCell</td><td>C-39216</td><td>2 mL dans 500 mL de DMEM</td></tr><tr><td>Pénicilline Streptomycine Gibco</td><td></td><td>15140-122</td><td>Concentration : 1 % dans le milieu de culture cellulaire</td></tr><tr><td>L-Glutamine</td><td>Gibco</td><td>25030-024</td><td>Concentration : 1 % dans le milieu de culture cellulaire</td></tr><tr><td>Heparinun natricum</td><td>Drossa Pharm AG</td><td></td><td>Concentration du stock : 5000 U.I./ mL</td></tr><tr><td>Lames de chambre</td><td>Bioswisstec AG</td><td>30108</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2 x 2H2O</td><td>Merck</td><td>2382.0500</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2 x6 H2O</td><td>Merck</td><td>1.5833.1000</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Axon Lab AG</td><td>9005-64-5</td><td></td></tr><tr><td>Albumine sérique bovine (BSA)</td><td>Sigma</td><td>A7030</td><td></td></tr><tr><td>Médium de montage Glycergel</td><td>Dako</td><td>C0563</td><td></td></tr></tbody></table>

Évaluation des propriétés anticoagulantes et anti-inflammatoires de cellules endothéliales à l’aide de la culture cellulaire 3d et sang total non-anticoagulant

Assessment of the Anticoagulant and Anti-inflammatory Properties of Endothelial Cells Using 3D Cell Culture and Non-anticoagulated Whole Blood

In vivo, les cellules endothéliales sont primordiales pour l’anticoagulation naturelle du sang circulant. Par conséquent, activation des cellules endothéliales entraîne la coagulation du sang. Ce phénomène est observé dans de nombreuses situations cliniques, comme la transplantation d’organes en présence d’anticorps d’anti-donneurs préformés, y compris la xénotransplantation, ainsi que dans la lésion d’ischémie/reperfusion. Afin de réduire l’expérimentation animale selon les 3R normes (remplacement, réduction et raffinement), in vitro modèles pour étudier l’effet des cellules endothéliales activation sur la coagulation du sang serait hautement souhaitable. Cependant, des systèmes de culture de cellules endothéliales à plat communs fournissent un rapport surface-volume 1-5 cm2 de l’endothélium par millilitre de sang, ce qui n’est pas suffisant pour traitement anticoagulant naturel, endothéliale induite. Mise en culture des cellules endothéliales avec des microporteurs perles peut accroître le ratio de surface-volume de 40 à 160 cm2/ml. Cet augmentation du rapport est suffisant pour assurer l’anticoagulation « naturelle » de sang, afin que l’utilisation des anticoagulants peut être évitée. Ici un in vitro avec des microporteurs système est décrit pour étudier les effets de la modification génétique de cellules endothéliales porcines sur la coagulation du sang entier, non anticoagulé. Dans l’essai décrit, principales cellules endothéliales aortiques porcines, soit type sauvage (WT) ou transgéniques pour humain CD46 thrombomoduline et ont été cultivées avec des microporteurs perles puis exposés au sang humain non-anticoagulé fraîchement tiré. Ce modèle permet la mesure et la quantification des cytokines comme activation marqueurs de complément et de la coagulation dans le plasma sanguin. En outre, l’imagerie de cellules endothéliales activées et des dépôts d’immunoglobulines, complément - et la coagulation des protéines sur les perles d’endothelialized ont été réalisées par microscopie confocale. Ce test permet également de tester des médicaments qui sont censés pour prévenir la coagulation et, par conséquent, activation des cellules endothéliales. Sur le dessus de son potentiel de réduire le nombre d’animaux utilisés pour de telles enquêtes, l’essai décrit est facile à réaliser et toujours reproductible.

Après 7-10 jours de culture placé dans le cône d’hélice (Figure 1), les cellules étaient confluentes, couvrant toute la surface des perles avec des microporteurs (Figure 2). Vérification de l’État confluency est une étape importante car une monocouche de non-confluent d’EC sur les microbilles entraînera une diminution marquée du temps de coagulation, compte tenu de l’avec des microporteurs surface des perles est fortement Pro-coa...

Nous présentons un modèle in vitro qui permet l’étude et l’analyse de la coagulation dans le sang entier, de non anticoagulé. Anticoagulation dans le système dépend de l’effet anticoagulant naturel des cellules endothéliales saines et activation des cellules endothéliales se traduira par la coagulation.

Évaluation des propriétés anticoagulantes et anti-inflammatoires de cellules endothéliales à l’aide de la Culture cellulaire 3D et sang total Non-anticoagulant

In vivo, endothelial cells are crucial for the natural anticoagulation of circulating blood. Consequently, endothelial cell activation leads to blood ...

L'objectif général de ce test est d'évaluer les propriétés anticoagulantes des cellules endothéliales à l'aide de sang total non anticoagulé. Cette méthode peut être utilisée pour répondre à des questions de recherche liées à la recherche cardiovasculaire, au transport et à la recherche en chirurgie. Elle est essentiellement applicable à toutes les questions relatives à l'anti-immunité et à l'activation des cellules endothéliales.L'avantage principal de cette technique est qu'elle permet d'utiliser du sang total sans anticoagulant, car l'anticoagulation est assurée par les cellules endothéliales. Pour commencer le protocole, mélangez sept millilitres de billes micro-porteuses avec 42 millilitres de solution coagulante dans un tube de 50 millilitres et incubez les billes pendant une heure à température ambiante. Après l'incubation, lavez les billes avec 25 millilitres de solution saline tamponnée au phosphate ou PBS, puis rincez-les en aspirant et en redéposant le liquide à l’aide d’une pipette.Attendre que les billes sédimentent au fond du tube, puis jeter le surnageant et répéter l'opération. Ensuite, laver les billes une fois avec 25 millilitres de milieu de culture de Dulbecco modifié (Dulbecco's Modified Eagle's Medium, DMEM). Puis, recouvrir les billes avec 10 millilitres de milieu 199 et les laisser équilibrer pendant 10 minutes avant toute utilisation ultérieure.Retirer le milieu de culture cellulaire du flacon T175 contenant les PAEC et ajouter cinq millilitres de PBS. Ensuite, retirer le PBS du flacon T175 et le remplacer par cinq millilitres de trypsine contenant 0,05 % d'EDTA. Incuber les cellules pendant trois à quatre minutes à 37 °C.Récupérez les cellules en rinçant le flacon avec 15 millilitres de milieu de culture cellulaire et transférez la suspension dans un tube de 50 millilitres. Centrifugez les cellules, puis après la centrifugation, éliminez le milieu excédentaire et remettez en suspension le culot dans cinq millilitres de milieu de culture cellulaire. Ajoutez 20 millilitres de milieu de culture cellulaire à la suspension cellulaire et remettez les cellules en suspension.Ajouter 20 millilitres de milieu de culture cellulaire sans cellules dans un flacon magnétique de 500 millilitres. Ajouter les cellules aux billes de microsupport lavées et mélanger soigneusement la solution à l’aide d’une pipette sérologique de 25 millilitres. Transférer le mélange de billes et de cellules dans le flacon agitateur magnétique.Rincez le tube avec 10 millilitres de milieu de culture cellulaire pour récupérer les cellules restantes. Ajoutez 85 millilitres supplémentaires de milieu de culture cellulaire dans le flacon agité. Placez le flacon au incubateur pendant la nuit, à 37 degrés Celsius sur un agitateur.Ajouter 50 millilitres de milieu de culture cellulaire pour un volume total de 200 millilitres. Poursuivre l'agitation pendant 24 heures supplémentaires sur un agitateur. Ajouter du milieu de l'Institut de recherche Rockwell Park sans couleur ou milieu RPMI, jusqu'à atteindre un volume total de 320 millilitres.Retirer 100 millilitres du milieu ancien et ajouter 100 millilitres de RPMI sans couleur frais supplémenté, toutes les 48 heures. Cultiver les cellules pendant cinq à sept jours selon l'état de confluence des billes recouvertes de cellules. À l’aide d’une pipette serologique de 10 millilitres, retirer les billes recouvertes de cellules du flacon agité magnétiquement et les transférer dans des tubes polypropylènes ronds de 12 millilitres.Après une à deux minutes, lorsque les billes se sont déposées, retirez le milieu en excès. Ajoutez davantage de billes dans les tubes jusqu'à ce que chaque tube contienne exactement deux millimètres de billes. Ensuite, ajoutez cinq millilitres de RPMI clair dans chaque tube et mélangez soigneusement la solution à l’aide d’une pipette sérologique de 10 millilitres.Laisser les billes se déposer et éliminer le milieu excédentaire. Répéter une fois supplémentaire la procédure de lavage avec du RPMI et retirer tout le milieu en excès. Prélever soigneusement et lentement du sang auprès d’un volontaire sain et le recueillir dans un tube polypropylène neutre de neuf millilitres, sans anticoagulant.Transférez lentement huit millilitres de sang dans chacun des tubes en polypropylène contenant deux millilitres de billes revêtues de cellules, afin d'obtenir un volume total de 10 millilitres. Manipulez soigneusement le sang et les billes afin d'éviter une activation prématurée des EC. Inclinez délicatement le mélange sang-billes pour assurer un mélange homogène, puis scellez le bouchon avec du film de paraffine.Placer les tubes sur une table horizontale basculante à réglage doux, à l'intérieur d'un incubateur à 37 degrés Celsius, et enregistrer les temps de coagulation. À des intervalles de temps définis, prélever au moins 1,5 à deux millilitres du mélange sang-perles pour une analyse du sérum ou du plasma. Pour la collecte du sérum, laisser le sang coaguler.Enfin, centrifuger les tubes à 2 500 G pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius. Conserver le sérum ou le plasma à 80 degrés Celsius jusqu'à utilisation. Les billes microporteuses marquées pour CD31 et les noyaux montrent clairement la confluence.L'observation visuelle a déterminé qu'un allongement du temps de coagulation pouvait être observé si une monocouche de cellules endothéliales était présente à la surface des billes de microporteur. Une augmentation significative du temps de coagulation a été observée lorsque des cellules endothéliales aortiques porcines, PAEC GalTKO/hCD46/hTBM, étaient présentes sur les billes de microporteur, suggérant une modulation réussie des systèmes du complément et de la coagulation. Une fois maîtrisée, l'incubation de billes recouvertes de cellules endothéliales avec du sang humain non anticoagulé peut être réalisée en environ six heures.La durée réelle de l'expérience dépend principalement du temps de coagulation, observé au cours de l'expérience. Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de veiller à une couverture complète des microbilles par les cellules endothéliales et d'éviter l'activation prématurée du sang humain.

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